自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型诱导成骨及修复腱骨界面损伤的生物力学分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.43.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型与重组人骨形态发生蛋白均有一定的成骨诱导作用，存在修复腱骨界面损伤的可能。
目的：探讨自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型的成骨诱导作用及修复腱骨界面损伤生物力学情况。
方法：35只成年健康的新西兰白兔，随机选取5只，处死后取双侧肩关节腱骨界面标本作为正常对照。剩余30只构建腱骨界面损伤模型后，随机等分为实验组和模型组，模型组不填塞任何药物，实验组填塞自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型进行修复。
结果与结论：填塞自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型后，兔损伤腱骨界面明显恢复，且随时间的延长，修复效果更佳，骨形态发生蛋白2表达水平也随之增加，损伤腱骨界面最大抗拉强度以及最大刚度明显增加。表明利用自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型复合重组人骨形态发生蛋白对腱骨界面损伤进行修复具有良好的成骨诱导作用，可以促进损伤的修复。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 肩袖, 腱骨界面损伤, 动物模型, 自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型, 骨形态发生蛋白, 生物力学

Abstract:

BACKGROUND: Both calcium phosphate cement II and recombinant human bone morphogenetic protein have certain osteoinductive effects, which have the possibility of repairing tendon-bone interface injury.
OBJECTIVE: To investigate the osteoinductive effect of calcium phosphate cement II and its biomechanics analysis of repairing tendon-bone interface injury.
METHODS: Five out of 35 adult healthy New Zealand white rabbits were randomly selected and their bilateral shoulder joint tendon-bone interface specimens were taken as normal control group after being sacrificed. The remaining 30 rabbits were used to make animal models of tendon-bone interface injury and then randomly divided into experimental and model groups. Rabbits in the model group had no treatment, and those in the experimental group were treated with calcium phosphate cement II.
RESULTS AND CONCLUSION: After repair with calcium phosphate cement II, the injured tendon-bone interface of rabbits was obviously restored, and the repair effect became better with time. The expression level of bone morphogenetic protein 2 was also increased accordingly. The maximum tensile strength and the maximum stiffness of the injured tendon-bone interface were obviously increased. These results demonstrate that calcium phosphate cement II combined with recombinant human bone morphogenetic protein has good osteoinductive and repair effect in repair of tendon-bone interface injury.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Calcium Phosphates, Tendons, Shoulder Joint, Prostheses and Implants, Tissue Engineering

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图/表（结果） 5

2.1 造模成功动物数量及过程所有35只新西兰白兔均进入结果分析，未出现死亡。实验流程见图2。

2.2 大体观察结果造模后两组动物饮食等均正常，未出现发热、伤口红肿等情况，切口良好愈合良好。经大体观察，未发现自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型植入所致的明显异位骨化以及瘢痕组织过度增生等。

2.3 组织病理变化苏木精-伊红染色显示正常组兔肩关节腱骨呈典型腱骨组织过渡结构，骨和肌腱之间呈相互紧密嵌入排列状(图3)，不表达骨形态发生蛋白2(图4A)。

造模后2周，苏木精-伊红染色显示实验组和模型组兔肩关节腱骨界面较宽，且以炎性肉芽组织为主。实验组腱骨细胞生长较少见，表达骨形态发生蛋白2，模型组中骨形态发生蛋白2染色较浅且呈不均匀分布(图4B，C)。

造模后4周，苏木精-伊红染色显示实验组和模型组兔肩关节腱骨界面成纤维细胞增多，炎性细胞减少，且炎性肉芽组织呈现出向腱性组织过渡的情况。实验组兔肩关节腱骨组织结合呈更加致密状态，模型组兔肩关节腱骨界面间隙减小，宽度不均，存在数量较多的成纤维细胞(图片未显示)。实验组兔肩关节腱骨骨形态发生蛋白2表达呈阳性，模型组兔肩关节腱骨骨形态发生蛋白2染色较浅、较均匀(图4D，E)。

造模后8周，苏木精-伊红染色显示实验组和模型组兔肩关节腱骨界面出现成纤维细胞显著增多的情况，模型组兔肩关节腱骨界面大多为结缔组织，且出现新骨形成(图片未显示)。实验组和模型组兔肩关节腱骨均呈现出骨形态发生蛋白2阳性表达，且染色均匀，其中实验组更加均匀有序(图4F，G)。

2.4 生物力学差异造模后2周，实验组兔腱骨界面最大抗拉强度以及最大刚度与模型组差异无显著性意义(P > 0.05)；造模后4周，实验组兔腱骨界面最大抗拉强度与模型组差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组兔腱骨界面最大刚度大于模型组(P < 0.05)；造模后8周，实验组兔腱骨界面最大抗拉强度和最大刚度均大于模型组(P < 0.05)。造模后8周，正常组、实验组和模型组兔腱骨界面最大抗拉强度和最大刚度差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。2.5 不良反应实验过程中实验动物均未出现任何不良事件。

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引言

材料方法

1.1 造模动物及材料清洁级成年健康新西兰白兔35只，雌雄各半，由北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号：SYXK(京)2011-0039，饲养环境和健康状况良好。本实验内容和方法均经徐州医学院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中设计动物福利和伦理问题等均符合要求。

自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型由上海瑞邦生物材料有限公司提供，产品为预先用磷酸钙盐(粉末)和固化液调和而成的磷酸钙人工骨糊状物或固化体，每2 g磷酸钙中包含 2 mg重组人骨形态发生蛋白2。固化液为无菌溶液，安全、无血液毒性，具有良好的生物相容性。材料生物相容性好，具有塑型准确、自行固化、生物相容性好和可降解吸收等特性，使用安全、方便。

1.2 造模方法 35只成年健康的新西兰白兔，随机选取5只，处死后取双侧肩关节腱骨界面标本作为正常对照。剩余30只，随机分为实验组(n=15)和模型组(n=15)，构建腱骨界面损伤模型。常规麻醉后利用电动钻，在新西兰白兔冈上肌腱止点行离断后重建，构建肩袖损伤腱骨界面重建模型(图1)。

1.3 修复腱骨界面损伤模型组新西兰白兔不填塞任何物质。实验组新西兰白兔填塞自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型进行修复，在动物骨槽中填塞自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型0.33 mg，在腱骨界面进行褥式缝合法把离断的冈上肌腱远端缝入骨槽中，生理盐水冲洗，逐层缝合，无菌敷料包扎。造模后常规注射青霉素钠以预防感染，并予以常规喂养。

自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型修复使用的主要试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
多聚甲醛	上海弘顺生物科技有限公司
骨形态发生蛋白2抗体	上海信裕生物科技有限公司
乙二胺四乙酸二钠盐	上海瑞齐生物技术有限公司
二甲苯(分析纯)	上海盈公实业有限公司
乙醇	上海市翔升生物科技有限公司
苏木精染色液	上海微蒙生物技术有限公司
伊红染色液	上海研域生物科技有限公司
戊巴比妥钠粉剂	武汉博士德生物工程有限公司
青霉素	上海研晶生物科技有限公司
荧光显微镜	北京中仪光科科技发展有限公司
电动钻	北京宇艾奇电子科技有限公司
全自动染色机	上海精密仪器仪表有限公司
低温冰箱	湖北徕克医疗仪器有限公司
生物力学测试机	上海企想检测仪器有限公司

1.4 标本获取于造模后第2，4，8周，实验组和模型组各取5只新西兰白兔，戊巴比妥钠麻醉后处死，完整取出肩胛骨和冈上肌腱以及肱骨，低温保存。

1.5 大体观察观察实验动物大体情况。

1.6 病理观察实验兔标本组织形态学及免疫组化学的光镜下观察。对肩袖标本用针刺法确定标本脱钙完全后，石蜡包埋切片苏木精-伊红染色，光镜下观察。对肩袖标本用针刺法确定标本脱钙完全后，石蜡包埋切片行免疫组化染色，光镜检测骨形态发生蛋白2细胞因子表达。

1.7 生物力学检测利用生物力学测试机进行拉伸试验，检测腱-骨界面最大抗拉强度和最大刚度。

实验兔标本制备及测试时保持湿润，先行预处理，每个标本给予5 N的拉力，持续30 s，然后行拉断实验，拉伸速度为5 mm/min，记录载荷强度及位移距离，计算刚度。腱-骨界面刚度为肩袖腱-骨界面受力时抵抗弹性变形的能力，其数值的大小反应其弹性变形的难易程度。

腱-骨界面最大抗拉强度为在拉伸测试过程中，肩袖腱-骨界面所能承受的最大抗拉力值。

1.8 主要观察指标 ①大体情况。②病理变化。③生物力学变化。

1.9 统计学分析数据采用SPSS 19.0统计软件处理。计量资料，符合正态分布的予以t 检验，不符合正态分布的予以多因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肩袖损伤多见于40岁以上男性，如为青年人，绝大多数伴有严重外伤史。由于肩袖受肩峰保护，直接暴力很少造成肩袖破裂。间接暴力多因肩袖随年龄增长发生退行性变后上肢外展，手掌扶地骤然内收而破裂，尤因冈上肌肌力薄弱，而承受牵拉力最大，故易破裂，约占50%。肩袖损伤会导致腱骨界面结构受到损伤，现有的临床治疗方式对于肩袖损伤治疗存在不足，需要有新的治疗方式的介入^[13-16]。肩袖损伤腱-骨界面重建后导致手术失败的主要原因有：腱-骨界面修复困难，要恢复到正常的止点结构所需时间漫长；抗拉强度短时间内恢复不足，导致腱-骨界面修复失败严重影响肩袖功能的恢复^[6^，^17-19]。

应用生长因子及类骨生物材料促进腱-骨界面修复是很有希望的方向，重建之后，为了达到理想的恢复效果，可以利用自固化磷酸钙人工骨进行修复治疗^[20-22]。自固化磷酸钙人工骨是一种新型的人工骨，具有良好的生物相容性以及可降解性^[23-25]。在将其植入出现骨缺损的部位之后，可以与宿主骨之间形成良好的骨性愈合，达到理想的修复效果^[26]。且随着时间的推移，可以逐渐被降解吸收^[14^，^27-31]。而且，自固化磷酸钙人工骨还具有多孔结构，可以为材料和新生骨之间的接触提供较大的面积，并促进促材料的降解^[32-33]。人工骨是由几种超细磷酸钙盐组成的混合粉剂，用生理盐水或其他固化液调和后呈糊状，注入骨缺损部位，能够根据骨缺损部位准确塑形，可把人体的骨骼组织连接起来，并且在人体温度和环境下自行固化^[27^，^34-37]。当人体的细胞不断往里生长，新的骨头长出来后，人工骨就被人体逐步降解和吸收掉，提高患者的治疗效果和治疗水平^[38-42]。

另外，材料复合有骨形态发生蛋白。骨形态发生蛋白是一种生长因子，具有诱导骨和软骨生长的作用，可以发挥出较好的促进新骨形成作用，促进骨愈合，并诱导骨形成^[43-56]。经过的大量的研究，诸多研究已经证实重组人骨形态发生蛋白2可以在骨形成以及骨折愈合中发挥出十分重要的作用^[57-59]。于是，利用这种“人工骨”进行腱骨界面损伤修复，可以增加骨缺损部位在手术后的强度，增强了定型功能，从而减轻患者的痛苦，缩短了康复时间。人工骨植入骨缺损后，能与宿主骨形成牢固的骨性愈合，从而修复骨缺损^[15^，²²^，²⁹^，^60-63]。

而且，自固化磷酸钙人工骨的另外一个特点是生物相容性良好，未见有细胞毒性反应，无皮肤致敏反应和皮内刺激反应，无急性全身毒性反应，无致癌、致突变、致畸形的作用^[64-65]。

本次实验过程中，利用自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型复合重组人骨形态发生蛋白对腱骨界面损伤进行修复，结果显示，经组织学观察，达到了良好的成骨诱导效果，造模后8周，实验组可观察到腱骨界面出现成纤维细胞显著增多的情况，经骨形态发生蛋白2抗体染色，实验组兔呈现出阳性表达，且染色更加均匀有序。本次实验结果还显示，经生物力学测试和比较，造模后2周，实验组兔最大抗拉强度以及最大刚度方面均大于模型组，但差异无显著性意义；造模后4周，实验组兔最大抗拉强度大于模型组，但差异无显著性意义；实验组兔最大刚度方面大于模型组；造模后8周，实验组兔的最大抗拉强度和最大刚度均大于模型组。另外，造模后8周，实验组和模型组兔最大抗拉强度和最大刚度均与正常组差异有显著性意义。表明利用自固化磷酸钙人工骨Ⅱ型复合重组人骨形态发生蛋白对腱骨界面损伤进行修复具有良好可以有效提高界面的抗拉强度和最大刚度，促进界面的修复，达到更好的修复效果。但受到入组样本数量以及观察时间等因素的影响，本次实验所得到的相关结果以及相应的结论可能存在一定的片面性和不准确。因此，本实验还存在一定的不足之处，还需要在今后的研究中予以进一步完善和分析。
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