低浓度β-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞向成牙本质细胞分化及相关因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.023

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (41): 6688-6693.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.023

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低浓度β-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞向成牙本质细胞分化及相关因子的表达

刘明月1，胡伟平1，王晓芬2，李宁3，曹潇方4，史欣1，王晓峰5

哈尔滨医科大学附属第二临床医院，¹口腔修复科，²消化内科，³心内科，⁴牙体牙髓科，⁵口腔科教研室，黑龙江省哈尔滨市 150086

出版日期:2015-10-01 发布日期:2015-10-01
通讯作者: 王晓峰，博士生导师，主任医师，哈尔滨医科大学附属第二临床医院口腔科教研室，黑龙江省哈尔滨市 150086
作者简介:刘明月，女，1986年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，2012年哈尔滨医科大学毕业，硕士，医师，主要从事口腔修复科工作。
基金资助:
黑龙江省自然科学基金(H2013101)

Low-dose β-glycerophosphate induced differentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts and expressions of relevant factors

Liu Ming-yue¹, Hu Wei-ping¹, Wang Xiao-fen², Li Ning³, Cao Xiao-fang⁴, Shi Xin¹, Wang Xiao-feng⁵

¹Department of Prosthodontics, ²Department of Gastroenterology, ³Department of Cardiology, ⁴Department of Oral Medicine, ⁵Oral Teaching and Research Section, the 2^nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China

Online:2015-10-01 Published:2015-10-01
Contact: Wang Xiao-feng, Doctoral supervisor, Chief physician, Oral Teaching and Research Section, the 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
About author:Liu Ming-yue, Master, Physician, Department of Prosthodontics, the 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, No. H2013101

摘要/Abstract

摘要：

背景：以往研究用来诱导成牙本质细胞分化的培养基普遍借鉴成骨细胞的诱导浓度，其他浓度的诱导情况尚无相关研究。
目的：观察在低浓度β-甘油磷酸钠条件培养下，牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中，牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况。
方法：分离培养人牙髓干细胞，用不同浓度的诱导液诱导牙髓干细胞分别向脂肪细胞，成骨细胞分化，证实其多向分化能力。用5 mmol/L β-甘油磷酸钠诱导培养牙髓干细胞向牙本质细胞分化，分别在培养第7，14，21，28天提取各组细胞RNA，反转录PCR检测牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况；诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化形成的矿化结节用Alizarin Red S法检测。
结果与结论：人牙髓干细胞经过诱导可证实其成功分化为脂肪细胞和成骨细胞；反转录PCR结果显示，5 mmol/L β-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞在培养7，14，21 d，各组细胞牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白的mRNA表达增加，伴随细胞外基质磷酸糖蛋白表达下调；培养至28 d，行矿化结节检测发现牙髓干细胞向成牙本质细胞成功矿化，可见红染的矿化结节。结果证实，5 mmol/L β-甘油磷酸钠诱导培养的牙髓干细胞可成功分化为成牙本质细胞，并下调细胞外基质磷酸糖蛋白mRNA的表达，同时上调牙本质基质蛋白1及牙本质涎蛋白mRNA的表达。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 分化, 牙髓干细胞, 牙本质基质蛋白1, 细胞外基质磷酸糖蛋白, 牙本质涎蛋白, β-甘油磷酸钠, 成牙本质细胞, 诱导, 分化, 矿化, 矿化结节, 黑龙江省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The induced concentration for osteoblasts is often introduced as reference to induce odontoblast differentiation. However, there are no reports on other concentrations.
OBJECTIVE: To observe the expression of dentin matrix protein-1, dentin sialoprotein and matrix extracellular phosphoglycoprotein during low-dose β-glycerophosphate-induced differentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts.
METHODS: Human dental pulp stem cells were isolated and cultured, and then induced by different concentrations of inducing solution to differentiate into adipocytes and osteoblasts, which could verify the multi-directional differentiation ability of human dental pulp stem cells. Under 5 mmol/L β-glycerophosphate, dental pulp stem cells differentiated into odontoblasts. At 7, 14, 21, 28 days of culture, RNA samples were
extracted from dental pulp stem cells in each group, and reverse-transcription PCR was used to detect the expression of dentin matrix protein-1, dentin sialoprotein and matrix extracellular phosphoglycoprotein. Mineralized nodules were detected by alizarin red S staining to show the successfully osteogenesis induction.
RESULTS AND CONCLUSION: Human dental pulp stem cells could be induced to adipocytes and osteoblasts. The results of reverse-transcription PCR showed that the dental pulp stem cells under 5 mmol/L β-glycerophosphate could increase the expression of dentin matrix protein-1 and dentin sialoprotein, but downregulate the expression of matrix extracellular phosphoglycoprotein at 7, 14, 21 days. At 28 days of culture, dental pulp stem cells were all successfully mineralized detected by alizarin red S. There were some red mineralized nodules. These findings indicate that the 5 mmol/L β-glycerophosphate can induce the differentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts successfully, up-regulate the mRNA expression of dentin sialoprotein and dentin matrix protein-1, and meanwhile down-regulate the mRNA expression of matrix extracellular phosphoglycoprotein.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Cell Differentiation, Dental Pulp, Tissue Engineering

刘明月，胡伟平，王晓芬，李宁，曹潇方，史欣，王晓峰. 低浓度β-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞向成牙本质细胞分化及相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(41): 6688-6693.

Liu Ming-yue, Hu Wei-ping, Wang Xiao-fen, Li Ning, Cao Xiao-fang, Shi Xin, Wang Xiao-feng . Low-dose β-glycerophosphate induced differentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts and expressions of relevant factors[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(41): 6688-6693.

图/表（结果） 4

2.1 分离培养人牙髓干细胞形态原代培养牙髓干细胞见图1，细胞在第4天贴培养瓶壁生长(图1A)，随后至第7天形成克隆细胞团并具有典型的成纤维细胞样形态(图1B)。经过14 d的培养，克隆的细胞更统一，具有成纤维形态和长细胞突，平行排列并达到足够数量等待传代(图1C)。传代后，细胞增殖迅速(图1D)。

2.2 矿化诱导结果实验选择长期的28 d培养并持续用矿化液培养第3代细胞。在培养至14 d时，出现第一个矿化结节(图2A)。经过28 d的矿化诱导，细胞收缩并排列成特殊的栅栏状形态(图2B)。类似的细胞形态曾被Proudfoot等描述^[18]。细胞在达到聚集后，由单层变为多层，并联合成多细胞结节(图2C)。培养28 d后，实验用Alizarin Red S检测到磷酸盐和钙沉积。显微镜观察显示，矿化中心有一个增加的矿化沉积而外层显示较少的基质矿化(图2D)。

2.3 体外鉴定牙髓干细胞多向分化能力为了分析牙髓干细胞的成脂肪细胞的能力，将细胞诱导培养3周，如图3A所示，Oil Red O染色形成中间为空泡的脂肪细胞。成骨诱导的矿化结节形成见图3B，显示了成功的矿化。

2.4 牙髓干细胞分化过程中牙本质基质蛋白1、细胞外基质磷酸糖蛋白及牙本质涎蛋白 mRNA的表达反转录PCR检测显示，5 mmol/L β-甘油磷酸钠培养7，14，21 d组细胞外基质磷酸糖蛋白与牙本质涎蛋白的表达呈相反的趋势，而在培养28 d组的检测发现细胞外基质磷酸糖蛋白表达增加(P < 0.05)，牙本质涎蛋白表达也增加。牙本质基质蛋白1在5 mmol/L β-甘油磷酸钠培养7，14，21 d组表达呈上升趋势(P < 0.05)，培养28 d组表达下调(P < 0.05)。见图4。

参考文献

[1] Gronthos S, Brahim J, Li W, et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 2002;81(8):531- 535.

[2] Laino G, d'Aquino R, Graziano A, et al. A new population of human adult dental pulp stem cells: a useful source of living autologous fibrous bone tissue (LAB). J Bone Miner Res, 2005;20(8):1394-402.

[3] Okamoto Y, Sonoyama W, Ono M, et al. Simvastatin induces the odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells in vitro and in vivo. J Endod. 2009;35(3):367-372.

[4] Qin C, Baba O, Butler WT. Post-translational modifications of sibling proteins and their roles in osteogenesis and dentinogenesis. Crit Rev Oral Biol Med. 2004;15(3):126-136.

[5] Papagerakis P, Berdal A, Mesbah M, et al. Investigation of osteocalcin, osteonectin, and dentin sialophosphoprotein in developing human teeth. Bone. 2002;30(2):377-385.

[6] Suzuki S, Sreenath T, Haruyama N, et al. Dentin sialoprotein and dentin phosphoprotein have distinct roles in dentin mineralization. Matrix Biol. 2009;28(4):221-229.

[7] Qin C, Brunn JC, Jones J, et al. A comparative study of sialic acid-rich proteins in rat bone and dentin. Eur J Oral Sci. 2001; 109(2):133-141.

[8] d'Aquino R, Graziano A, Sampaolesi M, et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 2007;14(6):1162-1171.

[9] Liu H, Li W, Shi S, et al. MEPE is downregulated as dental pulp stem cells differentiate. Arch Oral Biol. 2005;50(11): 923-928.

[10] Wei X, Ling J, Wu L, et al. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J Endod. 2007;33(6):703-708.

[11] Wang H, Kawashima N, Iwata T, et al. Differentiation of odontoblasts is negatively regulated by MEPE via its C-terminal fragment. Biochem Biophys Res Common. 2010;398(3):406-412.

[12] Owen TA, Aronow M, Shalhoub V, et al. Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro: reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formation of the bone extracellular matrix. J Cell Physiol. 1990;143(3):420-430.

[13] Huang GT, Shagramanova K, Chan SW. Formation of odontoblast-like cells from cultured human dental pulp cells on dentin in vitro. J Endod. 2006;32(11):1066-1073.

[14] Toupadakis CA, Wong A, Genetos DC, et al. Comparison of the osteogenic potential of equine mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, and umbilical cord tissue. Am J Vet Res. 2010;71(10):1237-1245.

[15] Bakopoulou A, Leyhausen G, Volk J, et al. Comparative analysis of in vitro osteo/odontogenic differentiation potential of human dental pulp stem cells (DPSCs) and stem cells from the apical papilla (SCAP). Arch Oral Biol. 2011;56(7):709-721.

[16] Liu M, Sun Y, Liu Y, et al. Modulation of the differentiation of dental pulp stem cells by different concentrations of beta-glycerophosphate. Molecules. 2012;17(2):1219-1232.

[17] Gronthos S, Mankani M, Brahim J, et al. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(25):13625-13630.

[18] Proudfoot D, Skepper JN, Shanahan CM, et al. Calcification of human vascular cells in vitro is correlated with high levels of matrix Gla protein and low levels of osteopontin expression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998;18(3):379-388.

[19] About I, Bottero MJ, de Denato P, et al. Human dentin production in vitro. Exp Cell Res. 2000;258(1):33-41.

[20] Lee JH, Lee DS, Choung HW, et al. Odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells induced by preameloblast-derived factors. Biomaterials. 2011;32(36):9696-9706.

[21] Huang GT, Sonoyama W, Chen J, et al. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 2006; 324(2):225-236.

[22] Batouli S, Miura M, Brahim J, et al. Comparison of stem-cell-mediated osteogenesis and dentinogenesis. J Dent Res. 2003;82(12):976-981.

[23] Liu J, Jin T, Ritchie HH, et al. In vitro differentiation and mineralization of human dental pulp cells induced by dentin extract. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2005;41(7):232-238.

[24] Tye CE, Rattray KR, Warner KJ, et al. Delineation of the hydroxyapatite-nucleating domains of bone sialoprotein. J Biol Chem. 2003;278(10):7949-7955.

[25] Couble ML, Farges JC, Bleicher F, et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif Tissue Int. 2000;66(2):129-138.

[26] Yokose S, Kadokura H, Tajima Y, et al. Establishment and characterization of a culture system for enzymatically released rat dental pulp cells. Calcif Tissue Int. 2000;66(2): 139-144.

[27] Zhang W, Walboomers XF, Wolke JG, et al. Differentiation ability of rat postnatal dental pulp cells in vitro. Tissue Eng. 2005;11(3-4):357-368.

[28] Argiro L, Desbarats M, Glorieux FH, et al. Mepe, the gene encoding a tumor-secreted protein in oncogenic hypophosphatemic osteomalacia, is expressed in bone. Genomics. 2001;74(3):342-351.

[29] Lu C, Huang S, Miclau T, et al. Mepe is expressed during skeletal development and regeneration. Histochem Cell Biol. 2004;121(6):493-499.

Gowen LC, Petersen DN, Mansolf AL, et al. Targeted disruption of the osteoblast/osteocyte factor 45 gene (OF45) results in increased bone formation and bone mass. J Biol Chem. 2003;278(3):1998-2007.

引言

Gronthos于2000年发现了牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)[1]。牙髓干细胞与骨髓干细胞同属成体干细胞，具有自我增殖和多向分化能力，用不同的诱导液诱导牙髓干细胞可使其分化成多种细胞类型，如成骨细胞、成牙本质细胞、脂肪细胞和神经细胞等[1]。用特定的培养基诱导牙髓干细胞向成骨细胞分化可使细胞增殖分化为前成骨细胞，具有自我更新能力，在成骨细胞中能形成活跃的自体纤维骨[2]。然而，用来诱导成牙本质细胞分化的培养基普遍借鉴成骨细胞的诱导浓度，其他浓度的诱导情况尚无研究。
牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein-1，DMP-1)是牙本质无胶原细胞外基质蛋白之一，与矿化的调节有关，在分化的成牙本质细胞中表达。有研究表明牙本质基质蛋白1在矿化成核过程一周开始表达，并在牙发生的矿化基质成熟中逐渐表达降低[3]。牙本质基质蛋白1也是牙本质特异蛋白，且为牙本质发育不全的参与基因。
细胞外基质磷酸糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein，MEPE)和牙本质涎蛋白(Dentin sialoprotein，DSP)同属Sibling蛋白家族成员[4]，在牙髓干细胞分化为成牙本质细胞的过程中分泌，其表达变化与成牙本质细胞的成熟分化程度密切相关。牙本质涎磷蛋白，为主要的成牙本质细胞外基质无胶原蛋白，可裂解为牙本质磷蛋白和牙本质涎蛋白[4]。
牙本质涎蛋白与牙本质矿化密切相关且在牙发生的过程中起关键作用[5]。其他研究显示，牙本质涎蛋白和牙本质磷蛋白在牙本质矿化中起决定作用，牙本质涎蛋白可调节早期牙本质矿化，而牙本质磷蛋白与牙本质矿化成熟相关[6]。
细胞外基质磷酸糖蛋白是在表征为骨矿化不全的相关疾病中被发现，细胞外基质磷酸糖蛋白两个重要的功能区决定了它在牙和骨组织中矿化的作用。
矿化是一个细胞分化及细胞外基质逐渐成熟的过程，伴随各种细胞内、外蛋白表达的变化。细胞外基质磷酸糖蛋白作为细胞外基质蛋白，在牙和骨的正常矿化过程中起抑制作用。了解细胞外基质磷酸糖蛋白的作用机制，不仅对研究组织矿化的过程具有重要作用，同时可为矿化不全相关疾病的研究提供理论基础。
骨和牙均是矿化的组织，在其组成和形成机制上高度相似[7]，由有机基质和包含矿物质的板状磷灰石结晶组成。相关研究显示当牙髓干细胞分化为前成骨细胞时会改变表面抗原表达及形态[8]。借鉴成骨细胞的分化条件，诱导成牙分化的培养基通常为质量浓度50 g/L维他命C盐酸(vitamin-C-phosphate)，10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 10 nmol/L地塞米松(dexamethasone)[9-11]。虽然有研究使用5 mmol/L β-甘油磷酸钠作为成牙/成骨分化的诱导浓度，但并未阐述为何选用5 mmol/L β-甘油磷酸钠，也未对不同浓度β-甘油磷酸钠的诱导差别进行比较[12-15]。本课题组在2012年最早证明了4个不同浓度β-甘油磷酸钠矿化组(5，10，15，20 mmol/L)均对细胞外基质磷酸糖蛋白蛋白表达有明显的抑制作用，特别是5 mmol/L β-甘油磷酸钠组，对细胞外基质磷酸糖蛋白抑制作用最明显。常规培养系统(10 mmol/L β-甘油磷酸钠)不如5 mmol/L组能下调细胞外基质磷酸糖蛋白的表达。即5 mmol/L β-甘油磷酸钠对牙髓干细胞向成牙本质细胞分化促进作用更加明显[16]。
细胞外基质磷酸糖蛋白、牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白同为Sibling蛋白家族成员，而细胞外基质磷酸糖蛋白的确切表达趋势目前尚未定论。实验创新的比较了牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中细胞外基质磷酸糖蛋白、牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白的表达情况。实验目的在于探讨低浓度β-甘油磷酸钠诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中，牙本质基质蛋白1、细胞外基质磷酸糖蛋白及成牙本质细胞标记蛋白牙本质涎蛋白的表达情况。同时，分析并比较在牙髓干细胞分化的过程中牙本质基质蛋白1与细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况，从而了解两种Sibling蛋白家族成员在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化中的作用。通过检测成牙本质细胞标记物牙本质涎蛋白的表达情况，研究细胞外基质磷酸糖蛋白与牙本质涎蛋白在整个培养周期中表达的变化来探索细胞外基质磷酸糖蛋白、牙本质基质蛋白1与牙本质涎蛋白的关系。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点于2014年11月至2015年5月在哈尔滨大学附属第二医院实验室完成。

1.3 材料取自哈尔滨医科大学附属第二临床医院口腔外科正常拔除的19-29岁人第三磨牙，所有过程经医院伦理委员会许可。拔除后的牙放于含5倍双抗的培养瓶内，4 ℃保存。

牙髓干细胞培养分化实验用主要试剂：
试剂	来源
特级胎牛血清、DMEM高糖培养基	Hyclone公司
Ⅰ型胶原酶、β-甘油磷酸钠、地塞米松、Alizarin Red S	Sigma公司
牙本质涎蛋白、牙本质基质蛋白1	Santa Cruz公司
细胞外基质磷酸糖蛋白	R&D公司
Vitamin-C-phosphate、L-glutamine	Gibco公司

1.4 实验方法

1.4.1 分离培养人牙髓干细胞分离培养人牙髓干细胞按先前报道^[17]，Ⅰ型胶原酶用量一般一颗磨牙需1 mL的 Ⅰ型胶原酶。将混有Ⅰ型胶原酶牙髓组织块悬液的离心管置于37 ℃水浴摇床中使牙髓消化1 h。终止消化时加入体积分数20%血清至离心管中至10 mL，放入离心机中 1 000 r/min离心5 min。离心后去上清液，再加入体积分数20%血清，吸管吹打细胞混匀，重复3次。将植入细胞后的培养瓶放入培养箱中(37 ℃，体积分数5%CO₂)，细胞将于4 d后贴壁。细胞贴壁后每隔3 d换液。倒置显微镜观察细胞形态及数量。待细胞长满瓶底后，胰酶消化传代培养。

1.4.2 牙髓干细胞多向分化能力检测取分离培养第3代的牙髓干细胞：成脂肪细胞诱导的培养液为0.5 μmol/L异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)，50 μmol/L 吲哚美辛和 0.5 μmol/L地塞米松，诱导培养3周；成骨细胞诱导的培养液为质量浓度50 g/L vitamin-C-phosphate和2 mmol/L L-glutamine，诱导培养3周；Oil Red O 染色检测向脂肪细胞的诱导情况；Alizarin Red S检测成骨细胞诱导分化情况。光学显微镜下观察细胞染色情况，判断其向成骨及成脂肪的诱导分化结果，即细胞红染即为阳性。

取第3代牙髓干细胞用5 mmol/L β-甘油磷酸钠诱导培养牙髓干细胞，在诱导培养7，14，21，28 d进行反转录PCR检测，矿化诱导判断其向牙本质细胞分化情况。

1.4.3 反转录PCR 5 mmol/L β-甘油磷酸钠培养7，14，21，28 d，提取各时间点细胞mRNA，吸除培养基，加入 1 mL TRIzol；将混合物加入EP管中，并标记；在室温下孵育样本5 min，加0.2 mL氯仿，用手剧烈摇管15 s，在室温下孵育2.0-3.0 min；将样品在12 000×g，4 ℃离心 15 min，吸取上层水相，放入新的EP管；向水相中加入 0.5 mL异丙醇，室温下孵育5-10 min，12 000×g，4 ℃离心10 min。吸弃上清液，只留下RNA沉淀；洗涤沉淀，加入1 mL的体积分数75%的乙醇。短暂涡旋样品，然后7 500×g，4 ℃离心5 min，弃去洗涤液；真空或空气干燥RNA沉淀 5-10 min，重悬在无RNA酶的水中，55-60 ℃水浴或加热10-15 min。引物序列见表1。

1.4.4 矿化诱导将第3代的细胞培养至28 d，不传代，每隔3 d换液，并进行矿化结节检测。矿化结节检测用体积分数95%乙醇固定30 min，并用体积分数0.1% Alizarin Red S 染色置于37 ℃孵箱中，染色30 min。光学显微镜下观察矿化结节染色情况，红染即为染色阳性，即证明成功矿化。
1.5 主要观察指标显微镜观察人牙髓干细胞的细胞形态；多向分化人牙髓干细胞后其形成脂肪细胞及成骨分化的染色情况；反转录PCR检测相关蛋白表达情况；培养 28 d人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化形成的矿化结节染色情况。

讨论

从实验结果中可见明显的蛋白表达变化。实验用低浓度矿化液诱导牙本质涎蛋白向成牙本质细胞分化，并比较了分化过程中不同时间点的牙本质基质蛋白1、细胞外基质磷酸糖蛋白与成牙本质细胞标记蛋白牙本质涎蛋白的表达。反转录PCR结果表明，牙本质基质蛋白1在前3周表达呈上调趋势，在最后1周表达下调。细胞外基质磷酸糖蛋白结果与本课题前期研究结果一致，即低浓度β-甘油磷酸钠对细胞外基质磷酸糖蛋白的表达起到抑制作用，从而促进了分化的进行。且随着分化的进行细胞外基质磷酸糖蛋白表达明显下调。
实验研究牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中蛋白表达变化，从而为进一步研究Sibling蛋白家族各蛋白之间关系提供参考。研究分化过程中的蛋白表达变化及关系，为牙发生的基础研究，牙发生是牙组织工程的前提。人牙髓细胞可在体外诱导分化为成牙本质细胞显型，有特异的极性细胞体和矿化结节沉积[19-20]。如把细胞移植到牙本质中，一些牙髓干细胞将转化为具有极性细胞体和细胞突的成牙本质细胞样细胞，并伸展至现有的牙本质小管中[13，21]。骨和牙本质都是矿化了的组织，在组成和形成机制上高度相似。此外，骨髓干细胞和牙髓干细胞不仅能在早期移植阶段在体内分化成成骨细胞和成牙本质细胞，且在组织再生上能诱导宿主细胞定向形成骨髓造血干细胞及牙髓样复合物。把牙髓干细胞种到人牙本质表面并移植至免疫受损鼠中，形成修复牙本质样结构便沉积在人牙本质表面[22]。有报道显示，牙损伤中施以牙髓干细胞和牙本质可溶性提取物(包含混合生长因子和生物活性分子)可形成修复性牙本质[23]。
实验着重研究牙髓干细胞分化过程中细胞外基质磷酸糖蛋白、牙本质涎蛋白及牙本质基质蛋白1的表达情况。以前的研究证实Sibling蛋白家族中，如BSP，牙本质基质蛋白1和牙本质涎磷蛋白都在牙本质分化成熟的过程中行使了积极的作用[4，22，24]。有研究表明，细胞外基质磷酸糖蛋白可作为成牙本质细胞分化标记物[9]。
目前，牙本质涎蛋白作为成牙本质细胞分化的主要标记物已被广泛用于成牙本质细胞的鉴定[25-27]。然而，细胞外基质磷酸糖蛋白作为矿化的调节剂在骨和牙本质中作用是不同的，一些研究表明细胞外基质磷酸糖蛋白在骨组织矿化过程中成促进作用[28-29]。相反，靶向缺失细胞外基质磷酸糖蛋白基因的鼠显示了增加的骨形成和骨量，明确表明细胞外基质磷酸糖蛋白可作为一种矿化的抑制剂[30]。细胞外基质磷酸糖蛋白的相关研究表明细胞外基质磷酸糖蛋白在成牙本质细胞分化的过程中起负调节作用[9]。细胞外基质磷酸糖蛋白通过其C端片段下调了成牙本质细胞分化[11]，且实验发现细胞外基质磷酸糖蛋白在不同时间点的表达不同。因此，根据实验结果，诱导成牙本质细胞分化不能完全借鉴成骨细胞的诱导条件，不同浓度诱导液的诱导情况可能不同。
实验结果显示，培养第4周时，牙本质涎蛋白呈低表达，表明细胞已达终末分化阶段，分化能力低，即使延长培养时间也不能继续分化。牙本质涎蛋白低表达的原因可能由于随着培养时间增加，细胞重叠成多层并拥挤以至于达到28 d培养时不能继续分化。同时，牙本质基质蛋白1的表达情况与牙本质涎蛋白相近，亦说明了在牙髓干细胞早期分化过程中牙本质基质蛋白1可作为成牙本质细胞另一标记性蛋白。此外，不能排除在评估的28 d后牙本质基质蛋白1和细胞外基质磷酸糖蛋白表达是否会发生改变，且牙本质基质蛋白1、细胞外基质磷酸糖蛋白和牙本质涎蛋白的表达水平也与产物差异性相关。在分化终末期牙本质基质蛋白1与细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况有待进一步研究证实。
实验结果显示，细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况与之前研究结果类似，即表达未成上升趋势。而牙本质涎蛋白、牙本质基质蛋白1可见明显表达增加。可见牙本质涎蛋白与牙本质基质蛋白1在牙髓干细胞向成牙本质细胞表达的过程中，可能为其标记蛋白，即随着分化的进行，表达升高。而细胞外基质磷酸糖蛋白在分化的过程中的角色及表达变化，需进一步研究证实。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

低浓度β-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞向成牙本质细胞分化及相关因子的表达

Low-dose β-glycerophosphate induced differentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts and expressions of relevant factors

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[4]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[5]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[6]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[7]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[8]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[9]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[10]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[11]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[12]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[13]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[14]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[15]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.