胃癌干细胞的分离、鉴定及其特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来随着肿瘤干细胞的深入研究，越来越多的证据表明肿瘤干细胞是恶性肿瘤转移复发的原因，因此分离鉴定出肿瘤干细胞对阐明肿瘤发病机制和研发抗肿瘤药物具有重要意义。
目的：分离培养胃癌干细胞，并检测胃癌干细胞的生物学特性。
方法：收集16例胃癌患者术中切除肿瘤组织，采用组织块贴壁培养法和酶消化培养法从肿瘤组织中分离胃癌干细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，绘制生长曲线，并观察成骨成脂诱导分化能力。
结果与结论：两种方法均能够分离出胃癌干细胞，在显微镜下可以发现细胞形态为长梭形或多角样，细胞增殖生长达到融合时，呈漩涡状、放射状排列。从细胞生长曲线可以看出，1-3 d为潜伏期，4-9 d为对数增殖期，10 d后进入生长平台期。流式细胞仪检测结果显示：第3代胃癌干细胞高表达细胞表面标志物CD90、CD29、CD44，而低表达CD34、CD45、HLA-DR。第3代胃癌干细胞经成骨诱导后可见钙化结节，成脂诱导后细胞胞浆开始出现微小明亮的脂肪滴。结果表明胃肿瘤组织内存在肿瘤干细胞，且与正常细胞有相似的形态、生物特性以及多向分化能力，可能参与胃癌的发生、发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 胃癌干细胞, 形态学, 生长曲线, 细胞分化, 生物学特性

Abstract:

BACKGROUND: With the in-depth study of cancer stem cells, increasing evidence has shown that cancer stem cells are the reason for cancer metastasis and recurrence, and therefore it is of great significance to isolate and identify cancer stem cells that can elucidate the pathogenesis of cancer and development of anticancer drugs.
OBJECTIVE: To isolate and culture gastric cancer stem cells and then to detect its biological characteristics.
METHODS: Cancer tissues from 16 patients with gastric cancer were cultured using adherent method and enzymic digestion methods to isolate gastric cancer stem cells. The cell morphology was observed under inverted microscope to drawn out growth curves. Osteogenic and adipogenic ability of cells were also detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Gastric cancer stem cells were isolated successfully by both two methods. Under the microscope, the cells were fusiform- or polygon-shaped. At confluence, the cells grew in a vortex or radial manner. The cell growth curve showed that 1-3 days were latent period, 4-9 days were logarithmic growth phase, and over 10 days were growth plateau phase. Flow cytometry results showed that passage 3 gastric cancer stem cells highly expressed CD90, CD29, CD44, but lowly expressed CD34, CD45 and HLA-DR. After osteogenic induction, calcified nodules were clearly visible in the gastric cancer stem cells at passage 3; after adipogenic induction, bright and tiny fat droplets were seen in the cytoplasm. These findings indicate that cancer stem cells exist in the gastric cancer tissues, and have similar morphology, biological property and multipotent differentiation ability to normal cells, which are probably involved in gastric cancer occurrence and development.

Key words: Stomach Neoplasms, Tumor Cells, Cultured, Neoplastic Stem Cells

中图分类号:

R394.2

李阳，赵永福. 胃癌干细胞的分离、鉴定及其特性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(32): 5188-5191.

Li Yang, Zhao Yong-fu. Stomach cancer stem cells: isolation, identification and characteristics[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(32): 5188-5191.

图/表（结果） 2

2.1 胃癌干细胞形态组织贴壁法培养14 d后在倒置显微镜下观察细胞形态，发现少量梭形或多角形细胞，并且这些细胞正从组织中溢出，胞浆丰富、核大(图1)。20 d后取出组织块，根据细胞融合面积继续培养。酶消化培养法原代培养24 h后发现存在大量悬浮细胞，主要以圆形或多角形为主。5 d后看见细胞贴壁生长，且多为梭形或多角形(图2)。培养10 d后细胞增速加快，并相互融合，显微镜下胞体变得细长，形态类似成纤维细胞。待原代细胞融合到培养皿底面积80%-90%时，进行传代扩增。随着换液及传代次数的增加，细胞种群开始同类化，显微镜下表现为均匀有序的成纤维细胞形态(图3)。对组织贴壁培养法和酶消化培养法得到的细胞进行Giemsa染色，结果显示胃癌干细胞形态没有明显变化，且细胞形态比较单一，细胞核淡染，核质比大，且呈现出圆形，核仁明显(图4)。

2.2 细胞计数板计数及生长曲线以时间为横坐标，细胞计数值为纵坐标绘制生长曲线，结果显示：胃癌干细胞传代培养后1-3 d为潜伏期，该时间段内细胞增殖比较慢；4-9 d为对数增殖期，细胞快速增殖；10 d后细胞增殖缓慢(图5)；采用酶消化培养法培养的各代胃癌干细胞的增殖速度差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。 2.3 流式细胞仪鉴定细胞表面标志物第3代细胞胃癌干细胞表面标志物CD90为(92.7±4.2)%，CD29为(92.1± 3.0)%，CD44为(93.1±4.1)%，而CD34为(2.5±2.1)%、CD45为(4.0±2.2)%、HLA-DR为(5.4±3.0)%。 2.4 胃癌干细胞体外诱导分化能力第3代胃癌干细胞成骨诱导3 d后细胞形态发生很大的变化，细胞开始变短、变小，9 d后细胞形态不规则，由长梭形向立方形、多角形改变，且细胞体积增大(图7)。第3代胃癌干细胞成脂诱导6 d后细胞胞浆开始出现脂肪滴，且时间越长脂滴细胞越多、越大。诱导三四周后细胞折光性较强，形态大小不一，部分脂滴为大团块(图8)。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2014年3月至2015年3月在郑州大学第一附属医院完成。

对象：

胃癌干细胞进行分离、鉴定实验所用主要试剂和仪器：
LG-DMEM/low GLUCOSE(IX)培养基	美国 Hyclone 公司
胎牛血清、EDTA	美国Gibco公司
胰蛋白酶	美国Amresco公司
Ⅳ型胶原酶、茜素红、油红O染料	美国Sigma公司
Percoll淋巴细胞分离液	上海第二化工试剂厂
流式抗体 CD29-PE、CD44-FITC、CD90-PE	美国 Biolegent 公司
CD34-FITC、CD45-PC5、HLA-DR-FITC	美国 Becman coulter 公司
青霉素、链霉素	华北制药股份有限公司
成骨细胞及成脂肪细胞诱导液	Cyagen Bioscience Inc.
培养瓶、培养皿、多孔培养板、冻存管	丹麦NUNC公司
离心管	美国Conning公司
微量移液器、细胞培养箱、超低温水箱	Thermo scientific
超净工作台	Airtech
离心机	德国Eppendorf公司
恒温水浴箱	上海跃进医疗器械厂
倒置相差显微镜	日本奥林巴斯公司
流式细胞仪	美国Becman coulter公司
电热恒温干燥箱	上海跃进医疗器械厂

纳入标准：①符合胃癌临床诊断标准。②符合分化相关标准。③术前未进行放、化疗，且术后经病理检测确诊。④入选患者自愿参加本次研究。

排除标准：①不符合胃癌临床诊断标准者。②合并其他疾病者。③严重心、肝、肾功能异常者。④入院前接受放化疗方案治疗者。

入选16例胃癌患者，其中男9例，女7例；年龄31.7-88.1岁，平均(65.7±3.1)岁；高-中分化腺癌型胃癌2例，中分化腺癌型胃癌5例，低分化腺癌型胃癌7例，黏液腺癌型胃癌2例，均经病理检查确诊。

实验方法：

细胞原代培养：将采集的胃癌组织放入到含两性霉素B和青-链霉素的缓冲液中，进行低温保存。实验时在超净工作台上将胃癌组织放入到无菌培养皿中，并用PBS冲洗(一般两三次即可)去除血细胞，并去除浆膜和血管等结缔组织，然后对胃癌组织进行分离和培养。①组织块贴壁法：将胃癌组织剪碎，放入培养皿中，间隔控制在5 mm，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱内放置 2 h，待组织贴壁牢固后继续放入培养液进行培养，24 h后半量换液，并根据细胞生长情况每三四天进行全量换液1次。②酶消化培养法：将胃癌组织切碎，并放入离心管中，加入10 mL 1% Ⅳ型胶原酶溶液，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱内温消化，组织消化期间进行充分摇匀，视情况终止消化，并经过200目的金属筛网过滤，加入PBS混匀，在1 000 r/min速度下离心5 min，加入1 mL细胞培养液及5 mL Percoll淋巴细胞分离液，其1 500 r/min离心15 min，吸取乳白色中间交界面细胞，按照5×10⁶ L^-¹细胞浓度接种在培养皿中，置入细胞培养箱进行培养，48 h进行半量换液，并根据细胞生长情况每三四天进行全量换液1次^[5-6]。

胃癌干细胞的传代、扩增：细胞在培养皿中融合到80%-90%时进行传代培养和扩增，去除培养液，并加入适量的PBS冲洗2次，然后加入适量的胰酶消化液，轻轻摇晃细胞培养瓶或细胞培养皿，使得消化液能够均匀分布，在37 ℃下放置1-3 min；培养期间多次观察细胞的消化情况，选择合适时机加入等量的胎牛血清终止消化；将细胞悬液移到离心管中，1 300 r/min离心5 min，去除上层清液，并加入适当的细胞培养液，按照1︰3比例进行传代。在倒置显微镜下观察细胞形态学及生长情况^[7]。

细胞核质比、细胞形态观察：选择贴壁培养法及酶消化培养法培养的第3代和第18代细胞进行Giemsa染色，采用显微镜观察细胞核质比一级形态。选择生长状态较高的第4代细胞待融合到培养皿面积的80%-90%时进行冻存^[8-9]。

胃癌干细胞增殖能力检测和生长曲线绘制：选择贴壁培养法分离的第3代胃癌干细胞和酶消化培养法分离得到的第3代和第18代胃癌干细胞，待细胞融合达到80%-90%时，去除培养液，经胰酶消化后采用细胞计数板计数，并接种在12孔板培养板中，每间隔24 h随机选取3孔细胞，胰酶消化后采用细胞计数板计数，每孔计数3次，取平均值，连续持续12 d，每三四天更换细胞液^[10-11]，根据细胞计数结果绘制胃癌干细胞生长曲线^[12]。

流式细胞术检测胃癌干细胞表面抗原表达：选择贴壁培养法生长良好的第3代胃癌干细胞，待细胞融合到80%-90%时弃去培养液，PBS冲洗，加入胰酶消化液消化1-3 min，终止消化，1 000 r/min离心5 min，然后制成细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹单细胞悬液，每管加入100 μL细胞悬液^[13-14]，采用直接法加入20 μL流式抗体CD29-PE、CD44-FITC、CD90-PE、CD34-FITC、CD45-PC5、HLA-DR-FITC，避光温室孵育30 min，上流式细胞仪检测，并利用软件进行数据分析^[15]。

胃癌干细胞的诱导分化：采用定向诱导方法诱导胃癌干细胞成骨细胞、脂肪细胞分化^[16-17]。取细胞融合达培养皿底面积为80%-90%的第3代胃癌干细胞，以2×10⁴/cm²细胞密度接种在6孔板上，将其分为两组，一组为诱导分化实验组，另一组为对照组，对照组采用细胞培养液进行维持培养，每3 d换液1次；实验组待接种细胞融合达到90%以上，将细胞培养液换为成骨、成脂诱导分化培养液，每3 d更换1次培养液。

主要观察指标：①胃癌干细胞形态。②胃癌干细胞增殖生长曲线。③胃癌干细胞表面标志物。④胃癌干细胞体外诱导分化能力。

统计学分析：对研究所得数据利用SPSS 18.0软件进行处理，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，临床上对于胃癌更多的以手术治疗为主，这些治疗方案虽然能够延长患者寿命，但是5年生存率较低，长期疗效欠佳，治疗预后较差^[18]。医学界普遍认为，对于胃癌干细胞而言，其鉴定主要从细胞的形态、标志物、多向分化潜能等方面入手。本研究采用组织贴壁法培养14 d后在倒置显微镜下观察细胞形态，发现有少量梭形或多角形细胞，并且这些细胞正从组织中溢出，胞浆丰富、核大；采用酶消化培养法原代培养24 h后发现存在大量悬浮细胞，部分细胞开始贴壁伸展，继续对所得细胞进行全量换液发现细胞形态则比较单一。研究表明干细胞表面标志以SH1、SH2、CD166、CD90、CD44、CD106以及CD71等为主；不表达造血细胞的表面抗原，主要包括CD43、CD45、CD14、CD3以及CD8等。本次研究中，流式细胞仪检测结果显示：第3代胃癌干细胞高表达细胞表面标志物CD90，CD29，CD44，而低表达CD34，CD45，HLA-DR，其中CD44和CD90含量相对较高，它们均属于胃癌干细胞重要标志物；CD34、CD45则是胃癌干细胞中表达极低的造血细胞^[19]。研究结果显示：在人体特殊环境下，胃癌干细胞能够在多种酶的催化作用下转化为成骨细胞、心肌细胞等，能够跨胚层横向分化为神经元样细胞和肝细胞样细胞^[20]。第3代胃癌干细胞成骨诱导3 d后细胞形态发生很大的变化，细胞开始变短、变小，9 d后细胞形态不规则，由长梭形向立方形、多角形改变，且细胞体积增大。第3代胃癌干细胞成脂诱导6 d后细胞胞浆开始出现脂肪滴，且时间越长脂滴细胞越多、越大。诱导三四周后细胞折光性较强，形态大小不一，部分脂滴为大团块。由此看出：胃癌干细胞容易导入外源基因，具有高度自我更新能力和多向分化能力，具有免疫原性和肿瘤趋向能力^[21] 。综上所述，胃癌患者体内存在干细胞，与正常细胞有相似的细胞形态、生物特性以及多向分化能力，可能参与胃癌的发生、发展。

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