碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓干细胞与韧带成纤维细胞共培养效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：碱性成纤维细胞生长因子在韧带损伤愈合中具有重要作用，细胞因子转染的骨髓间充质干细胞可作为种子细胞应用于韧带组织工程。

目的：探讨人碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞三维共培养后的交互生物学效应。

方法：原代培养大鼠骨髓间充质干细胞，传至第3代后分为3组：对照组、Ad-EGFP组及Ad-bFGF组。各组细胞相应处理后分别与韧带成纤维细胞三维共培养，MTS法检测细胞增殖能力，ELISA法检测各组细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白水平，RT-PCR检测各组两种细胞中Scleraxis、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、核心蛋白多糖、软骨低聚物基质蛋白等相关基因mRNA表达量的变化。

结果与结论：腺病毒介导的碱性成纤维细胞生长因子可高效转染骨髓间充质干细胞；共培养3，6 d后，与对照组及Ad-EGFP组相比，Ad-bFGF组两种细胞增殖活性增强(P < 0.01)；上清液中碱性成纤维细胞生长因子表达明显增高(P < 0.01)，韧带成纤维细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、核心蛋白多糖、软骨低聚物基质蛋白mRNA表达均降低(P < 0.01)，骨髓间充质干细胞中Scleraxis、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达均明显升高(P < 0.01)。以上结果表明碱性成纤维细胞生长因子转染的骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞三维共培养促进韧带成纤维细胞增殖的同时抑制了其胶原合成能力，促进骨髓间充质干细胞增殖的同时增强了其向韧带成纤维细胞分化的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 碱性成纤维细胞生长因子, 腺病毒, 转染, 韧带成纤维细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Basic fibroblast growth factor (bFGF) plays an important role in the ligament tissue healing process, and bone marrow mesenchymal stem cells transfected with growth factors can be used as seed cells in ligament tissue engineering.

OBJECTIVE: To observe biological effect of bone marrow mesenchymal stem cells transfected with recombinant adenovirus vectors carrying bFGF in three-dimensional co-culture with ligament fibroblasts.

METHODS: Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells were divided into three groups: control group, Ad-EGFP group and Ad-bFGF group. Under a phase contrast microscope, the changes in cell morphology were observed and the rate of transfection was analyzed by flow cytometry. Proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and ligament fibroblasts was analyzed by MTS, the expression of bFGF protein in bone marrow mesenchymal stem cells was determined by ELISA. Scleraxis, collagen type I, collagen type III, decorin and cartilage oligomeric matrix protein levels were detected in BMSCs and ligament fibroblasts using real-time fluorescent quantitative PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: Recombinant adenovirus-mediated bFGF gene could transfect bone marrow mesenchymal stem cells efficiently. After co-culture for 3, 6 days, compared with the control group and Ad-EGFP group, in the Ad-bFGF group, the proliferation ability of bone marrow mesenchymal stem cells and ligament fibroblasts was enhanced (P < 0.01), the expression of bFGF protein in supernatant was obviously higher (P < 0.01), the collagen type I, collagen type III, decorin and cartilage oligomeric matrix protein mRNA expression decreased in the ligament fibroblasts (P < 0.01), but the mRNA expression of Scleraxis, collagen type I, collagen type III in bone marrow mesenchymal stem cells increased (P < 0.01). The results suggest that the co-culture of Ad-bFGF-transfected bone marrow mesenchymal stem cells with ligament fibroblasts promotes the proliferation of ligament fibroblasts while decreases the collagen synthesis at the same time, and stimulates the proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into ligament fibrolasts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Patellar Ligament, Fibroblasts

中图分类号:

R394.2

李斌，陈廖斌，齐勇建，胡东才，陈彪. 碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓干细胞与韧带成纤维细胞共培养效应[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(28): 4429-4434.

Li Bin, Chen Liao-bin, Qi Yong-jian, Hu Dong-cai, Chen Biao. Bone marrow mesenchymal stem cells transfected with recombinant adenovirus vectors carrying basic fibroblast growth factor in co-culture with ligament fibroblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(28): 4429-4434.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞的成功分离及培养培养48 h后换液去除未贴壁细胞后，可见多角形、长梭形骨髓间充质干细胞分散在培养皿。培养5 d后，细胞排列较整齐，漩涡状成片生长，融合率达80%-90%。消化传代至第3代后，细胞形态基本一致，为长梭形成纤维细胞样，呈漩涡状分布(图1A)。

韧带成纤维细胞在培养两三天开始贴壁，成短梭形、多边形。培养7 d待细胞融合到90%后消化传代至第3代。韧带成纤维细胞较骨髓间充质干细胞略小，也呈长梭形，细胞间排列紧密，呈编织状、平行或漩涡状分布，较骨髓间充质干细胞的分布更为规则(图1B)。

2.2 腺病毒转染率当腺病毒量为50感染复数时，转染效率为89.1%，当腺病毒量为100感染复数时，转染效率为95.5%(图2A)。在一定范围内，随着病毒量的增加，转染率升高，表现为一定的量效关系。以100感染复数转染骨髓间充质干细胞48 h，荧光显微镜下观察细胞生长良好，有较强的绿色荧光蛋白表达，转染效率接近100%(图2B和2C)。
2.3 三维共培养体系的建立及细胞增殖速度图3A为课题组团队自创的共培养系统，利用不锈钢细胞筛将包裹两种细胞的微球隔开。MTS法分析两种细胞共培养0，3，6 d后的增殖情况，结果显示，与Ad-EGFP组相比，Ad-bFGF组骨髓间充质干细胞和韧带成纤维细胞增殖速率在0 d时无明显变化，在第3天及第6天时明显升高(P < 0.01)，对照组增殖速率在各时间点无明显变化(图3B和3C)。2.4 上清液中bFGF蛋白水平共培养3，6 d后未接受人源性bFGF转染的对照组及Ad-EGFP组细胞上清液中无bFGF蛋白产生；与对照组和Ad-EGFP组相比，Ad-bFGF组上清液中bFGF蛋白水平明显升高(P < 0.01，图4)。

2.5 RT-PCR分析共培养后骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞相关基因mRNA表达两种细胞共培养6 d后，与Ad-EGFP组相比，韧带成纤维细胞中韧带标志物基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、核心蛋白多糖、软骨低聚物基质蛋白mRNA表达显著降低(P < 0.01，图5A)，骨髓间充质干细胞中Scleraxis、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达明显升高(P < 0.01，图5B)。

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引言

韧带/肌腱损伤是运动医学领域常见多发病^[1]，用组织工程策略来促进损伤韧带修复已成为近年来研究热点。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)是存在于骨髓基质中的一种成体干细胞，不仅具有多向分化潜能^[2-4]，而且免疫原性低，适用于同种异体移植^[5-6]，是组织工程中的热门种子细胞^[7]。在韧带修复的局部微环境中，多种细胞因子发挥着积极有益的作用，这使得细胞因子在韧带修复中的使用受到广泛关注，然而细胞因子在局部较短的生物半衰期(数分钟到几小时)极大地限制了其应用。采用基因转染技术可将细胞因子整合到骨髓间充质干细胞中，使其合成和分泌具有生物学活性的蛋白分子，在局部营造较高浓度的细胞因子环境，使特定的细胞因子能在一定时期持续而稳定地释放作用于损伤局部，进而提高修复能力。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种多效能的生长因子，它的基本生物学作用是促进细胞分裂和增殖。研究表明在创伤修复过程中bFGF可促进纤维细胞迅速增殖，在合成大量胶原同时促进新生毛细血管形成，改善创面微循环，为组织修复提供丰富的营养物质^[8]；在组织重建过程中bFGF可刺激纤维结构重塑及增强韧带成纤维细胞的增殖、迁移，促进受损肌腱和韧带组织的修复^[9]，提示bFGF修饰的骨髓间充质干细胞可能在韧带组织工程应用中具有可喜前景。然而bFGF基因转染骨髓间充质干细胞后在韧带损伤局部与韧带成纤维细胞的交互作用目前尚不清楚。本实验拟在体外三维条件下探讨经腺病毒介导bFGF基因转染的骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞共培养后产生的生物学效应，以期为组织工程促进韧带损伤愈合提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：实验于2014年12月至2015年3月在武汉大学药理系发育源性疾病省重点实验室完成。

材料：

实验动物：SPF级健康Wistar雄性大鼠4只，4周龄，体质量100-120 g，购买于湖北省疾病预防控制中心，许可证号：SCXK(鄂)2009-2011。

引物：实验过程中所用引物均为自行设计，由生工(武汉)生物有限公司合成。

碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞共培养实验所用仪器及试剂：
仪器及试剂	来源
荧光显微镜	日本Olympus公司
Thermo ND2000C 紫外分光光度计、低温高速离心机	美国Thermo公司
倒置相差显微镜	日本Nikon公司
Step One 实时定量PCR仪	美国Applied Biosystems公司
流式细胞仪	美国Beckman Coulter公司
DMEM培养液、胎牛血清	美国GiBCO公司
Ⅰ型胶原酶、海藻酸钠	美国Sigma公司
腺病毒(Ad-EGFP、Ad-EGFP-bFGF)	北京诺赛基因组研究中心有限公司
ELISA试剂盒	美国R&D公司
MTS	普洛麦格(北京)生物技术有限公司
SYBR Green PCR试剂盒	美国 Fermentas公司

实验方法：

骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞分离、培养：于无菌条件下解剖出正常Wistar大鼠股骨和胫骨，细心剥取髌韧带留用，剔除肌肉等软组织，剪断干骺端，以无菌10 mL注射器抽取含体积分数为10%胎牛血清的F12-DMEM培养液反复冲洗髓腔，以1 200 r/min 离心洗涤6 min后弃去上清，全培养基重悬后接种至T25培养瓶中进行培养。每3 d换液，待细胞生长达到90%时进行传代，倒置相差显微镜下拍照第3代骨髓间充质干细胞，并继续实验。

去除髌韧带外膜组织，将其用1.5 mL PBS润洗后剪碎至1 mm³，置入含0.25%胰酶及0.2%Ⅱ型胶原酶的混合液中消化2 h，体积分数为10%胎牛血清终止消化，加入适量DMEM培养液，以1 200 r/min离心洗涤6 min后弃去上清，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基重悬后接种至T25培养瓶中进行韧带成纤维细胞的原代培养。每3 d换液，待细胞生长达到90%时进行传代，倒置相差显微镜下拍照第3代韧带成纤维细胞，并继续实验。

腺病毒转染率的测定：将第3代骨髓间充质干细胞接种6孔培养板上，待细胞汇合至80%-90%时进行转染。弃去陈旧培养基，用无血清DMEM培养基润洗2次，加入新鲜培养液0.5 mL，使其刚好覆盖培养孔底部，用无菌枪头吸取Ad-EGFP病毒液分别加入6个培养孔内，使病毒量分别为 0，50，100，150，200，300感染复数(每个细胞感染的病毒颗粒数)，同时设PBS处理空白对照，置37 ℃孵箱孵育，每15 min温和振摇1次。4 h后每孔补加DMEM培养液1.5 mL继续孵育，48 h后荧光显微镜下观察细胞，然后用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，流式细胞仪计数表达绿色荧光蛋白的细胞百分率以分析重组腺病毒Ad-bFGF对骨髓间充质干细胞的感染率。

三维共培养体系的建立：以感染复数为100的Ad-EGFP和Ad-bFGF转染骨髓间充质干细胞24 h，消化、收集细胞并用PBS润洗。以5×10⁹ L^-¹细胞浓度重悬在1.6%的无菌海藻酸钠中，用10 mL注射器进行恒速滴注至102 mmol/L CaCl₂溶液中形成微球，静置10 min，使之更好的形成微球，然后生理盐水润洗3次，每次5 min。将20个微球放于内置有无菌不锈钢细胞筛的6孔板的一边，将第3代韧带成纤维细胞按上述步骤制成微球放于6孔板的另一边，加入4 mL培养基。根据共培养体系中骨髓间充质干细胞的不同，分为对照组、Ad-EGFP组及Ad-bFGF组。

细胞增殖检测：于培养第0，3，6天各组分别取出8个共培养微球置于96孔板中，每孔加入预热的100 μL基础培养基和25 μL MTS溶液，37 ℃孵育3.5 h后，酶标仪490 nm读数，检测MTS值。

上清液中bFGF蛋白水平测定：分别于共培养第3，6天收集各组共培养细胞上清液，采用对应ELISA试剂盒检测培养上清液中bFGF蛋白水平，检测方法依照说明书进行。

RT-PCR检测相关基因mRNA表达：共培养6 d后，各组分别取出两种微球，加入citrate-EDTA溶液约12 mL，37 ℃孵育5 min，振荡后离心1 200 r/min×5 min，去掉上清，留下沉淀，根据沉淀的大小决定加入PBS的量为2 mL或者 3 mL，混匀，分装各组混匀液体1 mL到无RNA酶的EP管中，4 ℃离心12 000 r/min×15 s，留下沉淀，提取RNA。RT-PCR分别检测各组韧带成纤维细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、核心蛋白多糖、软骨低聚物基质蛋白mRNA表达变化，骨髓间充质干细胞中 Scleraxis、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达变化。引物序列、扩增片断大小及退火温度见表1。

主要观察指标：①倒置显微镜下观察细胞形态。②流式细胞仪检测细胞转染率。③MTS法检测细胞增殖速率。④ELISA法检测上清液中bFGF蛋白水平。⑤RT-PCR检测共培养细胞相关基因表达。

统计学分析：利用SPSS 17.0软件进行统计学分析；计量资料以x(_)±s表示，组间资料比较采用单向方差分析，组间两两差异比较应用Dunnett-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来组织工程不断发展，为解决目前肌腱和韧带修复中产生的一系列问题提供希望，探索合适的种子细胞是组织工程的重点。韧带成纤维细胞和骨髓间充质干细胞是目前较广泛使用的韧带组织工程种子细胞。资料表明，韧带成纤维细胞虽具有韧带修复能力，但其数量少、有丝分裂活性低，尤其是在损伤韧带中分离的韧带成纤维细胞，其生长和分化潜能降低，限制了其在韧带组织工程中的应用。骨髓间充质干细胞具有较高的增殖、分化潜能，且免疫原性低、细胞外基质分泌较多，易于接受基因修饰，目前已成为组织工程种子细胞来源的研究热门。韩桂全等^[10]应用骨髓间充质干细胞能明显促进肌腱愈合早期组织形态学及生物力学修复。Awad等^[11]将成年骨髓间充质干细胞体外培养扩增后植入肌腱缺损处，结果显示其最大张力和张力能量密度等增强，提示骨髓间充质干细胞的导入有利于肌腱的愈合。尽管上述研究令人鼓舞，但骨髓间充质干细胞植入损伤位点后，损伤局部缺乏足量的细胞因子诱导其增殖分化，导致其在局部的生物学效应大为降低。Gulotta等^[12]发现骨髓间充质干细胞单独应用于韧带损伤处并不能促进损伤愈合。另有研究表明，韧带损伤修复过程亦需要多种细胞因子的参与，如bFGF、转化生长因子β、血小板源性生长因子等^[13-15]，这些细胞因子不仅可诱导细胞分化，还参与调节细胞的生长和增殖，对组织修复发挥积极的作用，由此可见，以骨髓间充质干细胞为基础的种子细胞联合细胞因子可能有效促进韧带损伤愈合。

在众多的细胞因子中，bFGF广泛存在于人体各种组织器官中，能促进来源于中胚层和神经外胚层细胞的增殖和分化，是重要的促有丝分裂因子^[16]。内源性bFGF在韧带损伤修复早期即开始由韧带细胞及腱鞘细胞分泌，损伤7 d左右出现表达高峰，并且在韧带修复的3周过程中均有表达^[17]。韧带损伤修复早期，由于损伤周围的炎症反应及修复韧带的机械性能较差，较易发生再次断裂，因此该时期是临床治疗的关键时期。此时如有持续的外源性bFGF供给则会对韧带损伤修复起到良好的促进作用^[18]。文献报道，损伤局部直接注射重组bFGF蛋白可促进韧带组织愈合^[19]，但局部炎症及毒性反应限制了此应用。基因转染技术被提出用于解决这一缺憾，即通过载体将外源性目的基因转移到靶细胞内，促使靶细胞持续表达目的蛋白，进而产生预期的生物学效应。本实验采用重组腺病毒以不同的感染复数值转染骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测显示其转染效率高，ELISA检测培养 3 d后的细胞上清液发现有高浓度的bFGF蛋白表达，且培养6 d后的上清液中bFGF蛋白处于持续表达水平。上述结果表明，Ad-bFGF能高效转染骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞作为靶细胞持续稳定表达bFGF蛋白，为组织工程中克服生物体内韧带损伤局部细胞因子不足的缺陷提供了可能。

为初步了解韧带成纤维细胞与植入的骨髓间充质干细胞之间的交互作用，本研究在体外以海藻酸钠微球生物支架为媒介建立了韧带成纤维细胞和骨髓间充质干细胞的三维共培养体系，观察到韧带成纤维细胞和骨髓间充质干细胞共培养后产生的一系列生物学效应。本实验结果显示Ad-bFGF组韧带成纤维细胞增殖活性明显升高，其相关基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、核心蛋白多糖、软骨低聚物基质蛋白mRNA表达下降。与此同时，骨髓间充质干细胞增殖活性也明显升高，伴随韧带相关基因Scleraxis、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达升高。已知Ⅰ型胶原主要由成熟的韧带成纤维细胞合成和分泌，Ⅲ型胶原表达较少，核心蛋白多糖和软骨低聚物基质蛋白在维持韧带机械完整性和调控胶原纤维生成方面具有重要作用。而Scleraxis是一种螺旋-环-螺旋结构的转录分子，是韧带成纤维细胞发育过程中早期的特异标志物。因此以上结果提示，共培养系统中Ad-bFGF组内bFGF蛋白的持续表达，一方面促进了韧带成纤维细胞增殖同时降低了其胶原合成能力，其原因可能是增殖阶段韧带成纤维细胞通过降低胶原蛋白合成以避免较厚的胶原层妨碍细胞获取营养，从而更有利于细胞增殖^[20]；另一方面促进骨髓间充质干细胞增殖的同时增强了其向韧带成纤维细胞分化能力。韧带损伤愈合分为外源性和内源性愈合，前者需要外周组织参与导致粘连愈合，后者需要依靠韧带成纤维细胞自身的分裂增殖能力，不需形成粘连而愈合，以上结果提示bFGF转染的骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞共同作用可能有利于肌腱的内源性愈合。

总之，研究发现bFGF修饰的骨髓间充质干细胞能够稳定表达bFGF蛋白，且与韧带成纤维细胞在三维海藻酸钠微球共培养下产生了一系列生物学效应，一方面，促进韧带成纤维细胞的增殖并降低胶原合成能力；另一方面，促进骨髓间充质干细胞的增殖和增强其向韧带成纤维细胞分化，均有利于韧带损伤的内源性愈合，此为组织工程探索治疗韧带损伤新方法提供理论依据。但目前实验还局限于细胞水平，基因转染的骨髓间充质干细胞在生物体内的安全性及能否促进韧带损伤愈合仍需进一步研究。