软骨下骨量变化与软骨退变的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.20.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：关节软骨与软骨下骨在骨关节炎病变进程中的相互作用机制目前尚未完全阐明。软骨下骨量改变在骨关节炎病理进程中亦发挥重要作用。
目的：分析2种手术方式及2种蛋白酶诱导建立兔膝关节骨关节炎动物模型的效果，以及软骨下骨量变化与关节软骨退变的相关性。
方法：32只新西兰大白兔随机分为4组：Hulth模型组、前交叉韧带切断模型组、Ⅱ型胶原蛋白酶组及木瓜蛋白酶组，每组8只，右膝关节造模，左膝关节作为自身对照。造模后0，4，8周行DXA扫描，8周行MRI扫描后处死实验动物，取双侧膝关节制作病理组织学切片，比较各组膝关节影像学表现、大体形态及病理变化，并采用Mankin评分进行定量分析。
结果与结论：造模后0，4，8周实验侧膝关节骨密度进行性降低，骨量降低程度Hulth模型组>前交叉韧带切断模型组>Ⅱ型胶原蛋白酶组>木瓜蛋白酶组。MRI显示实验侧股骨内外髁关节软骨厚度变薄，厚度Hulth模型组<前交叉韧带切断模型组<Ⅱ型胶原蛋白酶组<木瓜蛋白酶组。大体标本、组织切片观察及Mankin评分显示手术建模组骨关节炎程度较药物组重，Hulth模型组病变最重，木瓜蛋白酶组最轻。结果说明关节内手术及关节腔内注射蛋白酶均能建立骨关节炎动物模型；手术造模可复制出中晚期骨关节炎，药物诱导可产生骨关节炎早期改变。骨关节炎病变严重程度与软骨下骨骨密度呈负相关；关节软骨退变和软骨下骨改变相互关联，病变进行性发展。

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 骨关节炎, 关节软骨, 软骨下骨, 骨密度, 磁共振成像, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Correlation between subchondral bone and articular cartilage in the process of osteoarthritis has not been fully elucidated. Degeneration of cartilage is the focus of attention, and the subchondral bone also plays an important role in the process of osteoarthritis.
OBJECTIVE: To observe the differences between experimental osteoarthritis models in rabbit knees established by two kinds of surgical methods and two kinds of proteases inducing methods, and to explore the correlation between subchondral bone mass and degeneration of cartilage.
METHODS: Thirty-two New Zealand rabbits were randomly and averagely divided into four groups: Hulth group (group A), anterior cruciate ligament transaction group (group B), collagenase type II group (group C) and papain group (group D). The right knees of rabbits were established as osteoarthritis models, and the left knees served as controls. Bone mineral density of the knee joint was evaluated by dual-energy X-ray absorptiometry scanning at 0, 4 and 8 weeks after modeling. The rabbits were sacrificed at 8 weeks after MRI scanning, bilateral knee joints were harvested for general and histological observation. Quantitative analysis was done according to Mankin scores.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone mineral density of the right knees decreased at 0, 4 and 8 weeks after modeling, and the rank was as follows: group A > group B > group C > group D. MRI scanning showed that the articular cartilage thickness of the medial and lateral femoral condyle on the right knees became thinner compared with the left side, and the rank was as follows: group A < group B < group C < group D. Observation by specimens and pathological slices showed that the articular cartilage degeneration of the surgery groups worsened, group A was the most serious one, and group 1D was the lightest. Both surgery and proteases inducing methods can successfully establish osteoarthritis models in rabbit knees. Surgery inducing models resemble the advanced or intermediate stage of osteoarthritis, while the proteases inducing models resemble the early stage of osteoarthritis. Degeneration of the articular cartilage and changes of subchondral bone are related in progressive development.

Key words: Osteoarthritis, Cartilage, Bone Density

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 32只新西兰兔中，Hulth模型组1只实验兔在术后2周因不耐受手术刺激进食减少死亡，其余31只按既定计划进行分组实验并进行结果分析。
2.2 软骨下骨骨密度测定 Hulth模型组手术造模侧除6区4周与0周相比骨量降低无显著性意义外，其余各定位区0，4，8周间比较差异均有显著性意义。10区经单因素方差分析骨密度呈进行性降低(F=5.354，P=0.022)。对照侧除3、4区8周与0周外，其余各区差异无显著性意义。见表1。

前交叉韧带切断模型组手术造模侧4周与0周比较，6，8，10区差异有显著性意义；各区8周与0周相比差异有显著性意义；8周与4周比较，10区差异有显著性意义。10区经单因素方差分析，骨密度进行性降低(F=14.013，P=0.001)。对照侧除4区8周与0周外，其余各区差异无显著性意义。见表2。

Ⅱ型胶原蛋白酶组药物造模侧4周与0周比较，5区差异有显著性意义；8周与0周比较，5，8区差异有显著性意义；各区8周与4周相比差异无显著性意义。10区经单因素方差分析，0，4，8周骨密度差异无显著性意义(F=2.078，P=0.168)。对照侧除2，3区8周与0周外，其余各区差异无显著性意义。见表3。

木瓜蛋白酶组药物造模侧除6区8周与0周差异有显著性意义外，其余各区0，4，8周差别均无显著性意义。10区经单一样本分析，0，4，8周骨密度差别无显著性意义(F=3.442，P=0.066)。对照侧除3区8周与0周外，其余各区差别无显著性意义。见表4。

组t=4.041，P=0.027；前交叉韧带切断模型组t=2.611，P=0.080；Ⅱ型胶原蛋白酶组t=1.587，P=0.211；木瓜蛋白酶组t=2.205，P=0.115。按α=0.05水准，Hulth模型组关节软骨厚度差异有显著性意义；前交叉韧带切断模型组、Ⅱ型胶原蛋白酶组、木瓜蛋白酶组关节软骨厚度差异无显著性意义。膝关节股骨内髁关节软骨厚度值经SPSS 17.0，Paired-Samples T Test，Hulth模型组t=22.517，P=0.000；前交叉韧带切断模型组t=11.260，P=0.009；Ⅱ型胶原蛋白酶组t=2.011，P=0.073；木瓜蛋白酶组t=0.166，P=0.879。按α=0.05水准，Hulth模型组、前交叉韧带切断模型组关节软骨厚度差异有显著性意义；Ⅱ型胶原蛋白酶组、木瓜蛋白酶组关节软骨厚度差异无显著性意义。见表5。

2.4 大体标本观察 ①右膝关节：Hulth模型组膝关节塌陷变扁，关节周缘大量结缔组织增生，关节面粗糙无光泽，软骨表面充血，重度糜烂、剥脱，形成较大溃疡，表面粗糙不平(图3A)。前交叉韧带切断模型组膝关节变形，关节周缘结缔组织增生，关节面粗糙，关节软骨色泽灰暗，表面充血、不平整，变薄，局部裂纹及溃疡形成(图3B)。Ⅱ型胶原蛋白酶组膝关节外形基本正常，关节周缘轻度结缔组织增生(图3C)。木瓜蛋白酶组膝关节外形正常，关节周缘未见增生结缔组织(图3D)。②左膝关节：膝关节外形正常，关节周缘无增生结缔组织。手术建模组关节面完整，光泽度稍减低，有局灶性充血(图3E)。药物建模组关节面光滑完整，呈现透亮光泽(图3F)。

2.5 组织病理学评价
苏木精-伊红染色组织切片观察：①右膝关节：Hulth模型组关节软骨变薄，关节面毛糙，大量软骨细胞凋亡，留下空的软骨囊。基质染色重度减少(图4A，B)。前交叉韧带切断模型组关节软骨厚薄不均，关节面粗糙，表面可见裂隙。表层及过渡带可见较多软骨细胞坏死区，放射带软骨细胞排列紊乱，部分呈空泡状。基质染色中度不均匀(图4C，D)。Ⅱ型胶原蛋白酶组关节面欠平整，表面有少量胶原纤维，移行层见裂隙形成，正常软骨细胞序列消失，软骨细胞数量增多，排列紊乱(图4E，F)。木瓜蛋白酶组股骨侧关节面平整，软骨细胞数量无明显减少，排列基本整齐，无细胞簇聚现象(图4G，H)。②左膝关节：软骨表面光滑、平整，基质呈粉红色，着色均匀。软骨细胞序列整齐，层次清楚，表层为单层扁圆形幼稚软骨细胞，中间层为柱状排列的圆形成熟软骨细胞，深层为肥大软骨细胞，细胞分布均匀，大小均一(图4I，J)。
软骨组织病理学Mankin评分：右膝关节病理组织学切片示关节软骨Mankin评分Hulth模型组、前交叉韧带切断模型组、Ⅱ型胶原蛋白酶组、木瓜蛋白酶组分别为(12.17±1.47)、(7.83±1.17)、(4.83±0.75)及(2.67±0.52)分。用Levene法行方差齐性检验，统计量为1.765，P =0.188。按α=0.10水准，4组资料的方差齐。经完全随机设计资料的方差分析，F=80.366，P=0.000。4组的Mankin评分数据不同，经SNK检验，各组间两两比较有显著性差异。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2013年5至10月在暨南大学附属第一医院和暨南大学医学院完成。
材料：

构建兔膝关节骨关节炎模型实验主要试剂与仪器
试剂及仪器	来源
Ⅱ型胶原蛋白酶及木瓜蛋白酶、戊巴比妥钠	美国Sigma公司
速眠新Ⅱ号注射液	长春军事医学科学院军事兽医研究所
甲苯胺蓝	美国AMRESCO公司
Lunar Prodigy双能X射线骨密度测量仪、Signa1.5T HD超导磁共振扫描仪	美国GE公司
IX 71 OLYMPUS倒置相差显微镜	奥林巴斯中国有限公司

实验动物：健康新西兰大白兔32只，雌雄不限、5-7月龄，体质量2.0-3.0 kg，由广东省医学动物实验中心提供。动物合格证：动物许可证号：SCXK(粤)2008-0002，粤监证字2008A001。
实验方法：
实验分组处理方法：实验设计将32只健康新西兰大白兔分为Hulth模型组、前交叉韧带切断模型组、Ⅱ型胶原蛋白酶组及木瓜蛋白酶组，每组8只。右膝关节造模，左膝关节作为自身对照。造模后第0，4，8周行双能X射线吸收法(DXA)扫描，第8周行MRI扫描。造模后第8周处死动物，取双侧膝关节观察大体形态后脱钙、石蜡包埋制作病理组织学切片，采集膝关节骨密度、股骨内外髁关节软骨厚度、组织切片软骨组织病理学Mankin评分数据行统计学分析。
造模方法：
手术造模方法：速眠新Ⅱ号注射液0.2 mL/kg肌肉注射，麻醉成功后将实验兔取仰卧位固定于动物操作台上，膝关节周围剃毛，常规消毒、铺巾、贴无菌薄膜。取右膝关节前正中切口，长约3 cm，沿髌韧带内侧进入，向外侧牵开髌韧带脱位髌骨，暴露关节腔。Hulth模型组切除膝关节内侧半月板，切断内侧副韧带、前交叉韧带；前交叉韧带切断模型组切断前交叉韧带。左膝关节作为对照仅打开关节囊，不破坏关节内部结构。冲洗关节腔，逐层缝合。动物苏醒后送回动物房，每日强迫活动0.5 h。术前及术后3 d肌肉注射青霉素40×10⁴ U，2次/d。
药物造模方法：将实验兔置于兔盒中固定，助手拉出其后肢使其处于伸直位，膝关节周围剃毛，注射者确定进针位置后消毒，针头穿刺进膝关节腔无阻挡，注射无阻力。Ⅱ型胶原蛋白酶组右膝关节腔内注射0.4%Ⅱ型胶原蛋白酶0.5 mL，木瓜蛋白酶组注射1.6%木瓜蛋白酶0.5 mL，左膝关节注射与右膝关节相同剂量生理盐水。造模需注射 2次，前后间隔3 d。造模后动物置于标准饲养笼中单笼喂养，每日强迫活动0.5 h。
影像学检查：
双能X射线吸收法(DXA)扫描：取造模后0，4，8周新西兰兔，速眠新Ⅱ号注射液0.2 mL/kg肌肉注射，麻醉成功后将实验兔取俯卧位放置于双能X射线骨密度测量仪检测台上，双后肢外展内旋，膝关节尽量伸直，纵向定位线过躯干中线长轴，选择小动物测量专用分析软件，扫描新西兰兔后肢大腿中段至小腿中段区域。在DXA扫描图中选择以膝关节为中心包含股骨、胫骨内外侧髁的20 mm×15 mm大小矩形区域测定膝关节总体骨密度。选择膝关节股骨内外侧髁最突出部位及与之对应的胫骨内外侧髁各2.5 mm×2.5 mm大小4个正方形区域测定膝关节软骨下骨骨密度，4个正方形区域近关节面边线旁开关节间隙边缘1 mm(图1)。

磁共振成像(MRI)检查：取造模后8周新西兰兔，3%戊巴比妥钠注射液30 mg/kg耳缘静脉注射，麻醉成功后将实验兔取仰卧位固定于自制木板上，由左至右进行双膝矢状位检查，使用Sun Advantage Workstation 4.2图像工作站及相关后处理软件进行数据分析。在三维脂肪抑制扰相梯度回波(3D-FS-SPGR)图像上取股骨内、外侧髁前中后3个部位测量关节软骨厚度并取平均值(图2)。

取材及制作标本：耳缘静脉空气栓塞法处死新西兰兔，取双侧膝关节近远侧各2 cm区域组织，置于体积分数4%甲醛液中于4 ℃下固定24 h后置于10%甲酸甲醛脱钙液中脱钙，定期更换脱钙液直至标本可轻松切片。沿矢状面切取硬币厚度标本置于标本盒中过夜流水冲洗，经脱水，透明，浸蜡及包埋，制成石蜡标本，石蜡切片后行苏木精-伊红染色。光学显微镜下观察组织切片，并以Mankin评分标准对关节软骨的病理改变作量化分析。
主要观察指标：膝关节总体及各区域骨密度，股骨内外髁前中后3个部位关节软骨厚度，大体标本及病理组织切片表现。
统计学分析：所得数据结果以x±s表示。多组资料比较运用方差分析，两组资料比较运用t 检验进行统计分析。采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，以P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

3.1 诱发性骨关节炎动物模型的构建方法构建实验性骨关节炎动物模型是进行骨关节炎发病机制、治疗干预、疾病预防等实验研究的重要手段之一。骨关节炎模型主要包括自发性和诱发性动物模型两大类。从研究目的、动物体型、实验周期、成本控制等方面考虑，诱发性骨关节炎模型在科研工作中应用范围更为广泛。构建诱发骨关节炎模型的主要方法包括机械制动、药物注射和手术方法3种手段。
机械制动：研究表明，无论膝关节处于何种体位，关节制动一段时间后均可出现关节软骨退变。伸直位固定后，肌肉、关节囊处于紧张状态，关节面压力增大，更容易导致骨关节炎的发生。关节退变与制动时间长短密切相关。Okazaki等^[4]的研究表明：家兔膝关节伸直位制动一两周后，关节软骨即出现早期退变，4周后关节软骨中度退变，6周后出现严重退变，他们将兔膝关节于伸直位制动五六周，成功复制出了骨关节炎动物模型。
药物注射：将木瓜蛋白酶^[5]、胶原蛋白酶、菲律宾菌素、肾上腺皮质激素、透明质酸酶等注入膝关节腔内，均可诱导关节软骨退变，导致骨关节炎的发生，其中前2种药物作用肯定，最为常用。药物诱导骨关节炎模型早期以关节组织炎性反应为主，后期出现关节软骨退变。骨关节炎模型病变部位及严重程度与进针点、穿刺方向，使用药物的种类、浓度，注射频率等相关。关节腔内药物注射诱导骨关节炎病变程度较手术方法轻微。
手术方法：手术方法包括关节外手术和关节内手术。前者主要通过改变关节应力、破坏关节血液循环及改变激素水平等手段构建[6]。关节内手术较直接，包括Hulth法(切断前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，不损伤关节软骨面)^[7-8]、ACLT法(前交叉韧带切断)^[9]、半月板切除^[10-11]、关节划痕等方法[12]。手术方法骨关节炎模型诱导成功率高，稳定性好，病变严重程度个体差异小，应用广泛。
3.2 软骨下骨影响关节软骨退变的生物力学效应软骨下骨主要有维持关节形状、吸收应力和缓冲震荡等功能。软骨下骨的数量比关节软骨多，但弹性模量相对较低，在缓冲震荡中主要起衬垫作用。在正常关节中，软骨下骨密度和厚度并不均一，不同部位的软骨下骨具有不同的生物力学特性，其缓冲震荡的衬垫作用随应力而改变，使软骨下骨的力学特性与其衬垫作用保持平衡，从而维持关节的正常生理环境。软骨下骨硬化时，吸收应力和缓冲震荡的能力减弱，并由此增加传递至关节软骨的冲击力，加速关节软骨破坏^[13]。国内学者亦研究发现，在骨关节炎进程中，周期性的张应力载荷可影响p38 MAPK 的表达及磷酸化程度，骨关节炎的发展发生与应力在细胞分子水平的影响相关^[14]。
McKinley等^[15]通过高分辨率数字显影技术测量人尸体软骨下骨硬化模型关节周围骨小梁应力改变情况，发现骨小梁所受应力明显增加，并间接引起关节软骨改变。Day等^[16]对正常人群及膝关节轻微软骨损害患者的胫骨关节面软骨下骨小梁进行显微CT扫描、力学测试及组织弹性模量有限元分析发现，与正常人相比，关节软骨破坏者软骨下骨组织弹性模量值降低。作者认为软骨与骨组织间的正常平衡在骨关节炎早期即被打破，骨关节炎早期关节软骨破坏与软骨下骨小梁弹性模量降低直接相关。Lampropoulou-Adamidou等^[17]通过ACLT术式构建兔膝骨关节炎模型，通过唑来膦酸进行干预治疗，通过对比发现，实验组软骨下骨吸收明显减弱，并由此延缓了骨关节炎病程进展。
3.3 软骨下骨影响关节软骨退变的生物学效应核因子κB受体激活因子在破骨细胞发育过程中表达，核因子κB受体激活因子配体通过核因子κB受体激活因子受体进行信号转导，诱导破骨细胞基因表达，将破骨细胞前体细胞激活为成熟破骨细胞。研究发现，核因子κB受体激活因子在骨关节炎病程中表达活跃，破骨细胞增多，加速了软骨下骨重塑过程中的骨吸收进程。Harada等^[18]取骨关节炎关节的软骨下骨组织进行培养，结果显示骨细胞代谢异常，并能合成促进关节软骨退变的细胞因子。Hulejova等^[19]检测骨关节炎患者关节软骨及软骨下骨中细胞因子和基质金属蛋白酶水平，发现基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9和白细胞介素10过表达，作者认为软骨下骨区域血管化促进了基质金属蛋白酶和多种细胞因子合成，并加速了软骨退变。另有研究表明，骨关节炎软骨下骨中的成骨细胞在甲状旁腺激素和前列腺素的刺激下合成环磷酸腺苷的能力较正常的成骨细胞差^[20]，成骨细胞的功能缺陷导致软骨下骨合成代谢异常。Orth等^[21]的研究进一步证明，甲状旁腺激素引起关节下骨松质改变^[22-34]，进而影响钙化软骨，导致骨关节炎关节软骨的退变。骨关节炎病程中，在血浆酶-血浆酶原系统调节下，胰岛素样生长因子及胰岛素样生长因子连接蛋白系统被激活，促使软骨下骨中的成骨细胞过度增殖并多层排列，同时合成、分泌Ⅰ型胶原形成矿化结节，导致软骨下骨增厚和硬化，诱发软骨基质损伤并导致关节软骨微骨折^[22]。
3.4 软骨下骨在骨关节炎中的异常骨重塑现象软骨下骨和钙化软骨的反复微损伤将启动骨重塑过程^[23]。研究发现，骨关节炎病变发展过程中，软骨下骨进行着广泛的骨重塑，骨吸收与骨形成活跃进行，但相互之间的平衡被打破。Huebner等^[24]认为在骨关节炎病变早期，软骨下骨进行着活跃的骨重塑，软骨下骨局部区域骨转化增加。Saito等^[25]发现，在骨关节炎早期到进展期，软骨下骨血管再生加速，然后侵及骨软骨接合区域。Pelletier等^[26]用犬构建骨关节炎模型，发现在骨关节炎早期软骨下骨吸收增加，呈现出软骨下骨质疏松的表现。Hayami等^[27]构建大鼠膝骨关节炎模型，建模2周后大鼠膝关节软骨下骨量丢失，骨吸收发生在关节软骨明显磨损及软骨下骨硬化之前，揭示了软骨下骨重塑在早期骨关节炎病理进程中呈现出以骨吸收为主的特点。由于骨重塑区局部血流增加和破骨细胞的溶骨作用，软骨下骨区域表现出短暂的骨质疏松。软骨下骨重塑具有时序性，关节软骨修复和软骨下骨重塑具有不同的速度，且相互缺乏关联，重塑的软骨下骨板不再对关节软骨退变的修复产生正向作用[28]。重塑过程后期纤维血管长入钙化软骨，导致潮线的扩展和软骨下骨硬化，从而加速关节软骨的退变。有学者研究发现，阿仑膦酸能够抑制软骨下骨重塑[29]，增强软骨下骨质量^[30]，改善骨关节炎关节软骨代谢微环境，从而抑制关节软骨产生潜在保护作用。
3.5 本实验各组骨关节炎模型的比较 4组骨关节炎动物模型在建模后0，4，8周行影像学检查，DXA扫描发现建模侧膝关节骨密度进行性降低，膝关节MRI扫描发现股骨内外髁关节软骨厚度变薄，手术组指标变化较药物组显著，股骨及胫骨内侧髁指标变化较外侧显著，Hulth组为甚。软骨下骨密度下降与关节软骨厚度变薄两种指标变化相互关联，呈正向关系。造模后8周处死实验动物观察发现，手术组骨关节炎病变明显较药物组严重，Hulth组呈重度骨关节炎改变，前交叉韧带切断组呈中重度改变，胶原蛋白酶和木瓜蛋白酶组骨关节炎病变轻微。组织学切片定性观察及软骨组织病理学Mankin评分定量分析发现，各组动物模型的组织学表现体现了骨关节炎各期的特点，从药物组到手术组呈现由轻到重的变化，木瓜蛋白酶组骨关节炎病变最轻，Hulth组病变最重。
综上所述，关节内手术及关节腔内注射蛋白酶均能建立骨关节炎动物模型。手术造模可复制出中晚期骨关节炎，药物诱导可产生骨关节炎早期改变。关节软骨退变和软骨下骨改变同时发生，相互关联，病变进行性发展。骨关节炎病变严重程度与软骨下骨骨密度呈负相关。Hulth术式产生骨关节炎病变最重，适于关节软骨修补、关节置换手术等方面的实验研究；ACLT术式所致骨关节炎病变相对较轻，适于创伤性骨关节炎发病机制、药物干预等方面的研究；酶诱导骨关节炎病变最轻，且病变以关节软骨病变为主，最适于关节软骨保护剂的治疗研究。