激素联合脂多糖建立股骨头缺血坏死模型兔的技术改良

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.20.003

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (20): 3129-3133.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.20.003

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激素联合脂多糖建立股骨头缺血坏死模型兔的技术改良

喻钧伦¹，罗天友¹，吴少平²，唐曦²，肖文²

¹重庆医科大学附属第一医院放射科，重庆市 400016；²成都医学院第一附属医院放射科，四川省成都市 610500

出版日期:2015-05-14 发布日期:2015-05-14
通讯作者: 罗天友，医学硕士，教授，重庆医科大学附属第一医院，重庆市 400016 吴少平，医学硕士，教授，成都医学院第一附属医院，四川省成都市 610500
作者简介:喻钧伦，男，1988年生，四川省邛崃市人，汉族，重庆医科大学在读硕士，主要从事影像医学与核医学方面的研究。
基金资助:
四川省教育厅资助项目(15ZB0243)

Technology improvement in establishing rabbit models of osteonecrosis of the femoral head induced by glucocorticoid and lipopolysaccharide

Yu Jun-lun¹, Luo Tian-you¹, Wu Shao-ping², Tang Xi², Xiao Wen²

¹Department of Radiology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; ²Department of Radiology, the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500, Sichuan Province, China

Online:2015-05-14 Published:2015-05-14
Contact: Luo Tian-you, Master, Professor, Department of Radiology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China Wu Shao-ping, Master, Professor, Department of Radiology, the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500, Sichuan Province, China
About author:Yu Jun-lun, Studying for master’s degree, Department of Radiology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Supported by:
the Project of Sichuan Provincial Education Office, No. 15ZB0243

摘要/Abstract

摘要：

背景：兔是激素性股骨头缺血坏死病因与病理机制研究最常使用的实验模型动物，该建模技术的完善与创新研究至今仍然是一个值得关注的现实问题。
目的：改良激素联合脂多糖建立兔股骨头缺血坏死模型的技术，验证其降低兔死亡率、保证建模成功率等方面的效果。
方法：28只新西兰大白兔随机分为对照组(n=10)和改良组(n=18)，采用不同方法建立激素性股骨头缺血坏死模型。改良组兔左侧臀肌注射青霉素钠5.0 mg/kg、硫酸阿米卡星1.63×10⁴ U/kg，24 h后右侧臀肌注射醋酸泼尼松龙20 mg/kg，48 h后耳缘静脉注射脂多糖5.0 μg/kg，之后每间隔24 h左右侧臀肌交替注射醋酸泼尼松20 mg/kg各1次，期间连续2周腹腔注射青霉素钠5.0 mg/kg、硫酸阿米卡星1.63×10⁴ U/kg。对照组通过兔耳缘静脉注射脂多糖10 μg/kg，之后每间隔24 h肌注醋酸泼尼松龙20 mg/kg，共3次，每周1次肌注青霉素钠20×10⁴ U/只。
结果与结论：两组兔均成功建立激素性股骨头缺血坏死模型。与对照组相比，改良组兔造模后死亡率明显降低，股骨头骨陷窝及骨坏死明显。提示新改良的激素性股骨头缺血坏死模型建立方法可有效减轻了臀肌注射局部的损伤程度，能保证造模成功率，显著降低了兔死亡率。

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 股骨头缺血坏死, 脂多糖, 内毒素, 醋酸泼尼松龙, 空骨陷窝, 成功率, 死亡率

Abstract:

BACKGROUND: The rabbits were widely used as experimental animal models in the research on etiology and pathological mechanism of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head. It is still a valuable and realistic research topic to improve and to innovate the modeling technology nowadays.
OBJECTIVE: To improve the modeling technology on osteonecrosis of the femoral head in rabbits induced by glucocorticoid combined with lipopolysaccharide, with the focus on its reduced mortality and the guaranteed successful rate of modeling.
METHODS: A total of 28 New Zealand white rabbits were randomly divided into the control group (n=10) and improvement group (n=18). Models of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head were established according to different methods. In the improvement group, rabbits were injected with sodium penicillin (5.0 mg/kg) and amikacin sulfate (1.63×10⁴ U/kg) in the left gluteus muscle. Twenty-four hours later, all rabbits were injected with prednisolone acetate (20 mg/kg) in the right gluteus muscle. Forty-eight hours later, 5.0 μg/kg of lipopolysaccharide was intravenously injected via the ear. From then on, two injections of prednisolone acetate (20 mg/kg) were respectively performed alternately in the left and right gluteal muscle at an interval of each 24 hours. Sodium penicillin (5.0 mg/kg) and amikacin sulfate (1.63×10⁴U/kg) were intraperitoneally injected for 2
consecutive weeks. In the control group, 10 μg/kg lipopolysaccharide was injected via the ear vein of rabbit. From then on, prednisolone acetate (20 mg/kg) was intramuscularly injected at an interval of each 24 hours, totally three times. Benzylpenicillin sodium 20×10⁴U/rabbit was intramuscularly injected once a week.
RESULTS AND CONCLUSION: Rabbit models of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head were successfully established in both groups. Compared with the control group, the mortality was significantly reduced after model establishment in the improvement group, and the bone lacuna and osteonecrosis of the femoral head were apparent. These findings indicated that the improved technology of model establishment of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head could be used to alleviate the damage degree on the gluteal muscles, to guarantee the successful rate of modeling, and to noticeably reduce the mortality of rabbits.

Key words: Femur Head Necrosis;, Lipopolysaccharides, Hormones, Models, Animal

中图分类号:

R318

喻钧伦，罗天友，吴少平，唐曦，肖文. 激素联合脂多糖建立股骨头缺血坏死模型兔的技术改良[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(20): 3129-3133.

Yu Jun-lun, Luo Tian-you, Wu Shao-ping, Tang Xi2, Xiao Wen. Technology improvement in establishing rabbit models of osteonecrosis of the femoral head induced by glucocorticoid and lipopolysaccharide[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(20): 3129-3133.

图/表（结果） 3

2.1 激素性股骨头缺血坏死模型兔数量变化及一般状况对照组静脉注射脂多糖后兔状态不佳，精神萎靡；第2天死亡5只，存活兔状态仍不佳；第3天注射醋酸泼尼松龙后，兔状态开始好转，仍死亡2只；注射激素后1周，死亡1只；4周总死亡率80%。改良组第1次肌注醋酸泼尼松龙后6 h，全组18只兔精神状态佳，能站立、转身，正常进食、饮水，粪便正常；静脉注射脂多糖后6 h，全组兔均开始出现精神萎靡，活动量明显减少，拒绝作站立、转身动作，拒进食、饮水，无尿便；第2次注射激素后6 h，8只兔开始少量进食、饮水，精神状态好转，活动量有所增加，能作站立动作，其中4只兔有排便；第3次注射激素后6 h，11只兔状态明显好转，能作站立、自由转身动作，正常进食、饮水，粪便正常(图2)。

2.2 激素性股骨头缺血坏死模型兔的体质量、腹围及体长的变化改良组兔体质量、腹围随造模时间的延长而减低(P < 0.05)，腹围/体长比逐渐减小，体长无明显变化(P > 0.05；表1)。对照组第3天兔已死亡80%，未再行体质量、腹围及体长随访测量。

2.3 激素性股骨头缺血坏死模型兔的存活情况对照组兔分别于造模后第2，3，11天死亡5，2，1只，合计死亡8只，余2只存活，总死亡率为80%(8/10)。改良组18只兔在造模第3，4，5，8，11天分别死亡2，3，2，1，1只，合计死亡9只，余9只健康存活，总死亡率为50%(9/18)；其中，第1周死亡率为39%(7/18)，均发生于脂多糖注射后72 h之内，第2周死亡率为18%(2/11)。两组实验兔存活率差异有显著性意义(P < 0.05)。 2.4 激素性股骨头缺血坏死模型兔股骨头的病理变化苏木精-伊红染色显示，改良组造模第8天兔股骨头软骨下骨小梁变细，稀疏，不连续，成骨细胞沿骨小梁成串分布，细胞核形态不均一，大都变扁，位于骨陷窝边缘；空骨细胞散在分布，呈空泡状；第11天骨小梁内脂肪细胞增多，骨髓造血细胞减少，空骨细胞大量出现。造模第8，11天空骨陷窝百分率分别为81%和92%(2/2)(图3)；4周后9只存活兔空骨陷窝百分率为50%-72%，11只观察对象骨坏死发生率为100%。对照组因80%兔死亡，未再行病理学观察。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：全部实验于2014年3至12月在成都医学院第一附属医院实验中心完成。
材料：
实验动物：SPF级新西兰大白兔28只，雌雄不拘，两组体质量分别为(3.59±0.47)，(3.56±0.33) kg，兔龄均为10个月，购于成都达硕生物科技有限公司，动物许可证号SCXK(川)2013-14。单笼饲养于成都医学院第一附属医院实验中心动物实验室，标准颗粒饲料喂养，自由饮水，通风良好。实验经成都医学院第一附属医院动物伦理学委员会批准，并按动物实验的3R原则给予人道的关怀。

兔股骨头坏死模型实验用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
脂多糖	Sigma公司，美国
醋酸泼尼松龙注射液	浙江仙琚制药股份有限公司
青霉素钠	华北制药股份有限公司
硫酸阿米卡星注射液	天津药业集团新郑股份有限公司
0.9%氯化钠注射液	华润双鹤药业股份有限公司
Excelsior ES自动组织脱水机、Histostar组织包埋机、Finesse ME+全自动石蜡切片机、VaristainTM Gemini ES自动染色机	Thermo scientific公司，美国
Leica DM4000 B LED正置显微镜	Leica公司，德国

方法：
实验动物分组及处理：28只新西兰大白兔随机分为对照组(n=10)和改良组(n=18)。
激素性股骨头缺血坏死模型的建立：对照组适应性喂养1周后，参照Qin等^[8]方法，通过兔耳缘静脉注射脂多糖10 μg/kg，之后每间隔24 h肌注醋酸泼尼松龙20 mg/kg，共3次。每周1次肌注青霉素钠20×104 U/只。
改良组适应性喂养1周后，左侧臀肌注射青霉素钠 5.0 mg/kg、阿米卡星1.63×104 U/kg，24 h后右侧臀肌注射醋酸泼尼松龙20 mg/kg，48 h后耳缘静脉注射脂多糖 5.0 μg/kg，以后每间隔24 h左右侧臀肌交替注射醋酸泼尼松龙20 mg/kg，共2次。期间每间隔24 h连续性腹腔注射青霉素钠5.0 mg/kg、阿米卡星1.63×104 U/kg，持续2周(图1)。
生存状况观察：药物注射后连续观察4周，每6 h记录兔精神状态、进食、饮水、活动、体质量、腹围及体长等一般状况，记录死亡兔的死亡时间，记录死亡兔数量。
组织学观察：造模1周起，解剖濒死实验兔及4周后的存活兔，取双侧股骨标本，40 g/L多聚甲醛组织固定液固定48 h，酸性脱钙液进行脱钙，沿股骨头冠状面切开取材，放入组织盒内，梯度乙醇脱水，浸蜡、包埋，作3-5 μm切片。苏木精-伊红染色，光镜下随机取10个高倍镜视野(×400)观察。记录股骨头空骨陷窝百分率、骨坏死发生率。骨坏死诊断标准为：骨小梁内见弥漫性空骨陷窝或核皱缩，伴有周围骨髓细胞坏死[9]。空骨陷窝百分率(%)=空骨陷窝数/总骨陷窝数×100%，计算出骨坏死发生率(%)=任何一侧股骨头出现骨坏死的动物数/组内动物总数×100%。
主要观察指标：实验动物生存状况及股骨病理形态。
统计学分析：应用IBM SPSS Statistics 22软件包进行统计分析，体质变化比较采用单因素方差分析，存活率比较行Kaplan-Meier生存分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

理想的股骨头缺血坏死动物模型应具有与人体类似的解剖和生理特点，可复制自早期组织形态学改变到晚期股骨头塌陷的全程改变，且可重复性好，便于检测和评价^[10]。目前，激素性股骨头缺血坏死建模动物仍以鼠和兔为主。鼠股骨头骺生长板终生存在，常用于建立儿童股骨头骨骺坏死动物模型^[11]。成年兔骨骺板闭合，价格较低，在激素性股骨头缺血坏死模型中应用较多，其建模技术主要包括：单纯激素注射、激素联合异体血清注射、激素联合脂多糖注射等。
兔单次单纯臀肌注射甲基强的松龙相关实验表明，激素剂量增加，激素性股骨头缺血坏死发生率增高，二者之间具有相关关系^[12]。实验动物死亡率低是该技术的优点，但是，不同学者得出的坏死率结果差别较大，被认为是一个可重复性较差的技术^[6]，已逐渐被小剂量连续臀肌激素注射技术所取代。刘伟等^[13]使用小剂量甲泼尼龙琥珀酸钠(4.0 mg/kg)每周1次连续兔臀肌注射建模，给药后4，6，8 周空骨陷窝率分别为9%、23%、30%，实验过程中兔死亡1只；赵广辉^[14]使用地塞米松磷酸钠(8.0 mg/kg)每周2次兔臀肌注射建模，第3，6 周空骨陷窝率分别为16%、27%。尽管后者的建模成功率有所提高，但仍究偏低，且周期较长，难以满足病因与病理机制研究的实验需求。作者所在课题组也曾尝试使用小剂量醋酸泼尼松龙(8.0 mg/kg)，每周2次连续兔臀肌注射建模，观察6周，兔死亡率为44%(14/32)，显著高于相关文献的报道，动物死亡前3 d食量减少，精神状态差，皮毛毛糙无光泽，皮下脂肪减少。
Tian等^[15]报道静脉注射马血清10 mL/kg、2 周后肌注甲泼尼龙45 mg/kg，3 周后再次静脉注射马血清7.5 mL/kg的技术建立兔激素性股骨头缺血坏死模型，2，4，8周空骨陷窝率分别为22%，31%，37%，造模成功率为54%，未报道动物死亡率。王伟等^[16]行兔耳缘静脉间隔3 周、共2次马血清注射(10 mL/kg)预实验，动物死亡率高达83%(5/6)，死亡均发生于第2次马血清注射后5 min内。因此，尽管该方案可利用异体血清所致免疫变态反应，模拟激素性股骨头缺血坏死发病机制中存在的血管炎改变^[17]，但死亡率偏高，仍须改进完善。
近年，激素联合脂多糖建立兔激素性股骨头缺血坏死模型的研究报道较多。该技术可利用脂多糖中类脂质A成分引起的微循环障碍提高建模成功率，同时也可能因其发热、内毒素休克及播散性血管内凝血等作用导致动物死亡。Qin等^[8]使用小剂量脂多糖(10 μg/kg)单次静脉注射，随后每间隔24 h、连续3次肌注甲基强的松龙(20 mg/kg)的方式建模，造模后6周实验兔骨坏死率93%(13/14)、无实验动物死亡。Wu等[18-20]运用同样的方案建模，造模成功率分别为85%(17/20)、100%(6/6)、89%(16/18)，但均有动物死亡，死亡率分别为17 %(4/24)、25 %(2/8)、5%(1/19)。另有Wu等[18]改用间隔24 h、2次静脉注射低剂量脂多糖(10 μg/kg)，随后每间隔24 h连续3次肌注甲基强的松龙(20 mg/kg)的方式建模，其末次注射激素后4 d有3只兔死亡，死亡率15% (3/20)，骨坏死率88%(15/17)。上述文献都肯定了该技术建模成功率高的优点，但实验动物的死亡率差别较大，相关数据报道也欠详细。作者所在课题组前期使用此单次脂多糖(10 μg/kg)诱导方案建模，注射后12 h，兔精神状态极差，10只兔给药1周内即死亡7只，第2周死亡1只，2周总死亡率高达80%(8/10)。
针对作者所在课题组实验中所遇实验兔死亡率高，以及现有文献造模方案叙述较粗略、部分实验中的处死兔均计算为存活样本可能导致系统误差等问题，同时基于前期实验的教训及他人的一些经验^[8，21-24]，以提高动物存活率、兼顾造模成功率为目标，对方案进行了调整、细化，主要体现在：提前12 h预防性使用抗生素，连续使用2周；推迟注射脂多糖，改于第1、2次激素注射期间使用；减少脂多糖用量(5.0 μg/kg)；规定了各种药物的给注途径。改良目的分别是：持续使用青霉素钠、硫酸阿米卡星2种抗生素防治感染并发症；提前使用激素以对抗脂多糖休克、播散性血管内凝血反应；减少脂多糖剂量以降低其毒性作用；减少臀肌注射次数以减轻实验观察部位的损伤程度。
技术改良后，实验兔单侧臀肌注射合计仅有2次，避免了局部水肿、跛行现象的发生。4周观察50%的兔死亡率，也明显低于改良前实验80%的兔死亡率(P < 0.05)，提示该改良方案具有降低兔死亡率的应用研究前景。而第8，11天2只兔股骨头骨陷窝百分率分别达81%、92%，4周后9只存活兔空骨陷窝率为50%-72%，明显高于李瑞琦等^[25]脂多糖联合激素建模32%的空骨陷窝百分率，表明本改良方案对于保证造模成功率具有较高的应用价值，并给脂多糖再减量以进一步降低死亡率的研究提供了依据。鉴于本实验样本量较小，病理检查取材时间不一，2只濒死兔股骨头空骨陷窝百分率更高的原因尚不明确。

激素联合脂多糖建立股骨头缺血坏死模型兔的技术改良

Technology improvement in establishing rabbit models of osteonecrosis of the femoral head induced by glucocorticoid and lipopolysaccharide

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