微骨折加骨髓间充质干细胞移植治疗膝关节软骨损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.019

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (14): 2243-2249.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.019

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微骨折加骨髓间充质干细胞移植治疗膝关节软骨损伤

扈佐鸿¹，王玉龙¹，蔡郑东²，陈玉泉¹，夏寅¹

¹解放军171医院，江西省九江市 332000；²上海第一人民医院，上海市 200080

修回日期:2015-03-04 出版日期:2015-04-02 发布日期:2015-04-02
通讯作者: 王玉龙，主治医师，解放军171医院，江西省九江市 332000
作者简介:扈佐鸿，男，1963年生，江西省九江市人，汉族，1986年解放军第一军医大学毕业，副主任医师，主要从事骨创伤、膝关节疾病方面研究。
基金资助:
南京军区医药卫生科研基金课题(10MA061)，课题名称：微骨折+干细胞移植治疗膝关节软骨损伤

Microfracture technique plus bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for repair of articular cartilage injury of the knee

Hu Zuo-hong¹, Wang Yu-long¹, Cai Zheng-dong², Chen Yu-quan¹, Xia Yan¹

¹The 171^st Hospital of PLA, Jiujiang 332000, Jiangxi Province, China; ²Shanghai Central Hospital, Shanghai 200080, China

Revised:2015-03-04 Online:2015-04-02 Published:2015-04-02
Contact: Wang Yu-long, Attending physician, the 171st Hospital of PLA, Jiujiang 332000, Jiangxi Province, China
About author:Hu Zuo-hong, Associate chief physician, the 171st Hospital of PLA, Jiujiang 332000, Jiangxi Province, China
Supported by:
the Medical Research Foundation of Nanjing Military Region, No. 10MA061

摘要/Abstract

摘要：

背景：如何利用组织工程学的方法促进膝关节软骨修复及缩短病程成为关节外科亟需解决的问题，而微骨折加干细胞移植疗法有可能为其开辟一条新的道路。

目的：探讨关节镜下微骨折加自体骨髓间充质干细胞移植治疗膝关节软骨损伤的可行性。

方法：2010年10月至2012年3月收治的膝关节软骨损伤患者16例，男12例，女4例；左膝11例、右膝5例；年龄16-52岁，平均38.6岁；所有病例软骨缺损均获得关节镜证实。治疗前2周抽取自体骨髓，分离骨髓间充质干细胞并行体外培养扩增，获取干细胞培养液3-5 mL(约10⁷个细胞)。膝关节镜下清理后微骨折尖锥于软骨缺损区钻孔，造成局部微骨折，排尽关节腔内积液，行微切口置入止血纱布贴覆软骨创面，注入制备好的骨髓间充质干细胞，弹力绷带加压包扎，早期CPM机锻炼。

结果与结论：随访4-18个月，显效13例，有效2例，无效1例。Lysholm膝关节评分治疗前为42分(33-67分)，治疗4周后为89分(75-99分)，平均提高47分，随访均未出现症状反复和加重。结果可见关节镜下微骨折加自体骨髓间充质干细胞移植有效治疗膝关节软骨损伤，显著改善患者膝关节症状及恢复膝关节功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 移植, 微骨折, 膝关节镜, 骨髓间充质干细胞, 关节软骨损伤

Abstract:

BACKGROUND: It has been an urgent problem of how to promote cartilage repair of the knee and shorten the total course through a tissue engineering approach. Fortunately, microfracture plus stem cell transplantation may open up a new path for this issue.

OBJECTIVE: To investigate the clinic feasibility of arthroscopic microfracture technique plus stem cell transplantation for repair of articular cartilage injury of the knee.

METHODS: From October 2010 to March 2012, a total of 16 patients with articular cartilage injury of the knee were enrolled, including 12 males and 4 females, with the average age of 38.6 years (16-52). All cases of cartilage injury were confirmed by arthroscopy. Autologous bone marrow was extracted from patients at 2 weeks before treatment to isolate, culture and amplify bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. The cell culture solution of 3-5 mL (about 10⁷ cells) was harvested. The articular cavity was clean by arthroscopy and microfracture technique was performed at the area of cartilage injury that was then covered with hemostatic gauze through a minimally invasive incision and the prepared bone marrow mesenchymal stem cells were injected. The knee was bandaged with the elastic bandage after aspirating the joint cavity effusion by vacuum suction. Functional exercises were performed early by CPM.
RESULTS AND CONCLUSION: After follow-up of 4-18 months, there were 13 cases of excellent, 2 cases of valid and 1 case of ineffective. According to Lysholm knee scores, the average scores were improved from 42 points (33-67 points) to 89 points (75-99 points) at 4 weeks after treatment. The function was satisfied and all patients were followed up without recurrence or worse. Under the arthroscopy, the combination of microfracture technique and autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation is proved to be effective for articular cartilage injury of the knee and it can notably improve the clinic symptoms and recover the function of the knee.

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Cartilage, Articular, Arthroscopes

中图分类号:

R394.2

扈佐鸿，王玉龙，蔡郑东，陈玉泉，夏寅. 微骨折加骨髓间充质干细胞移植治疗膝关节软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(14): 2243-2249.

Hu Zuo-hong, Wang Yu-long, Cai Zheng-dong, Chen Yu-quan, Xia Yan. Microfracture technique plus bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for repair of articular cartilage injury of the knee [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(14): 2243-2249.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞形态 细胞接种于培养皿中，光学显微镜下观察可见细胞呈圆形、类圆形均匀悬浮于培养液中。培养2 d后见细胞呈梭形并有伪足伸出，贴壁于瓶底生长；1周后细胞快速增殖，呈长梭形，并融合成片状、界限不清。第2代骨髓间充质干细胞呈长梭形、呈放射状排列，大小、分布均匀(图2)。

2.2 骨髓间充质干细胞表面抗原表达 流式细胞仪检测细胞表面抗原结果显示：CD44和CD90阳性表达，阳性表达率分别为(96.02±3.24)%和(94.67±5.78)%。CD34和CD45阴性表达(图3)。

2.3 随访患者膝关节功能 随访4-18个月，显效13例，有效2例，无效1例。Lysholm膝关节评分治疗前平均42分(33-67分)，治疗4周后平均89分(75-99分)，平均提高47分。平均11.3个月随访均未出现症状反复和加重。

2.4 典型病例

病例1：患者女，42岁，外伤后致右膝关节肿痛1周入院治疗。患者于1周前下楼梯不慎摔伤致右膝关节肿胀、疼痛。膝关节间隙不同程度压痛，膝关节屈伸时症状明显加重。MRI显示：右股骨内侧髁、胫骨外侧平台见斑片状异常信号影，外侧半月板前角稍高信号影，前交叉韧带肿胀，其内见条状高信号影，关节腔内积液(图4)。Lysholm评分为40分。入院后完善相关检查给予关节镜下关节清理、关节镜下微骨折加自体骨髓间充质干细胞移植。治疗后4周Tegner运动评级为显效，主要症状基本消除，主要关节功能基本恢复或有明显进步。Lysholm膝关节功能评分为86分，随访未出现症状反复和加重。

病例2：患者女，32岁，外伤致左膝关节肿痛10 d入院治疗。患者于10 d前不慎扭伤致右膝关节肿胀、疼痛，活动轻度受限，休息时疼痛减轻。膝关节间隙有不同程度压痛，膝关节屈伸时症状明显加重。MRI显示：股骨外侧髁小片状异常信号影，内侧副韧带高信号影，关节腔内积液(图5)。Lysholm评分为41分。入院后完善相关检查给予关节镜下关节清理、关节镜下微骨折加自体骨髓间充质干细胞移植。治疗后4周Tegner运动评级为显效，主要症状基本消除，主要关节功能基本恢复或有明显进步。Lysholm膝关节功能评分为95分，随访未出现症状反复和加重。

2.5 不良反应 目前随访的患者中并没有发现与移植细胞相关的不良反应。

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引言

创伤及慢性局灶性关节软骨损伤是临床中十分常见膝关节损伤，尤其好发于青少年，主要表现为半月板破裂、关节软骨缺损、韧带撕裂等损伤，这些病症常合并存在，也可单独出现，其中关节软骨的损伤占60%-66%^[1]。关节软骨损伤伴随的症状包括疼痛、关节僵硬、关节表面隆起及关节畸形等，严重影响患者正常工作及生活质量。当膝关节软骨损伤单独出现时，临床诊断较为困难，需借助MRI、体格检查及经验丰富的医师方可诊断。目前传统的治疗方法包括保守治疗、关节镜下关节清理及冲洗术、微骨折术、骨软骨移植等^[2]。这些方法对于缓解疼痛症状、延缓关节退行性变和恢复一定的关节功能都具有一定作用^[3]。由于关节软骨没有血液供应及神经支配，其营养代谢仅通过关节液进行，故而愈合修复能力及其有限，一旦发生损失几乎无法再生，病损关节损害也常逐步加重，严重影响关节功能。微骨折术目前已成为软骨损伤的一线治疗手段且创伤小、操作简单，术后疼痛症状及关节功能得到改善^[4-6]。自体骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能并可在一定因素诱导下发生定向分化且可在体外扩增，大量的文献已经报道自体骨髓间充质干细胞移植后可产生透明质酸样软骨组织^[7-8]。近年来，关节镜下自体及异体骨髓间充质干细胞移植的基础及临床研究为关节软骨损伤的治疗提供了新的思路。目前临床上运用干细胞治疗骨软骨缺损、股骨头坏死、脊髓神经损伤等骨科疾病已取得了大量的研究成果^[9-10]。然而单纯微骨折治疗仅能获得数量有限的骨髓间充质干细胞，且随着年龄增大，体内干细胞和生长因子数量明显下降，严重影响软骨修复能力，且仅适用于较小的软骨缺损^[11-13]；对于关节退变严重、年龄过大、软骨缺损面积过大、体质量较大将严重影响患者的临床疗效^[14]。目前骨髓间充质干细胞的移植主要通过2条途径：一是直接将骨髓间充质干细胞移植到缺损的软骨处^[15]，二是将体外培养的细胞注入载体或支架中，再将其黏附于软骨缺损处^[16]。大量的基础研究已经证实微骨折联合骨软骨移植治疗关节软骨损伤比单纯微骨折治疗疗效更好、适应证更广、关节功能恢复更快^[17-18]。目前国内外关于关节镜下微骨折联合骨髓间充质干细胞移植治疗膝关节软骨损伤的研究还很少，大多处于动物实验阶段。课题组旨在将此方法用于临床治疗研究，寻找一种全新的、安全有效的治疗软骨缺损的方法。解放军171医院骨科自2010年10月至2012年3月采用关节镜下微骨折加骨髓间充质干细胞移植治疗膝关节软骨损伤患者，随访发现临床效果满意，报道如下。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学水平，临床对照观察。

时间及地点：于2010年10月至2012年3月在解放军171医院完成。

对象：通过膝关节MRI检查选择软骨损伤患者16例，男12例，女4例；左膝11例，右膝5例；年龄16-52岁，平均38.6岁。所有病例软骨缺损均获得关节镜证实：其中股骨内髁11处，髌骨关节面6处，胫骨内侧平台7处，股骨滑车4处；合并半月板损伤13例，单纯软骨缺损3例。

纳入标准：所有患者均存在膝关节疼痛，合并半月板损伤者活动弹响及交锁感。查体见膝关节间隙或髌骨缘不同程度压痛，膝关节屈伸时症状明显加重。膝关节MRI检查股骨髁或髌骨软骨信号改变。

排除标准：膝关节韧带损伤、胫骨平台骨折，痛风性膝关节炎等。

方法：

自体骨髓间充质干细胞分离培养：髂后上嵴常规消毒铺巾，局麻下无菌注射器穿刺抽取自体骨髓8 mL，采用密度梯度离心法离心、洗涤细胞并接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM细胞培养基中，37 ℃，体积分数为5%的CO₂孵箱中培养，3 d后更换培养基，洗涤弃去未贴壁细胞，定期更换培养基，细胞长到80%时汇合时传代，光学显微镜下观察并拍照。

流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表型：培养2周后，取生长良好第2代细胞，PBS洗涤3次，胰酶消化制成细胞悬液，离心并用PBS洗涤2次，最后将细胞悬浮于100 µL PBS中，加入荧光标记抗体10 µL，室温孵育30 min，PBS洗涤细胞2次并悬浮于100 mL PBS中。流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原CD34、CD44、CD45和CD90表达。

膝关节镜下微骨折联合骨髓间充质干细胞移植治疗：连续硬膜外麻醉下行膝关节镜手术，修整破损半月板、清理关节腔增生滑膜；修剪软骨缺损区周缘不规整、松动的软骨组织，直至稳固的正常软骨边缘；关节镜下微骨折尖锥(Microfracture)于软骨缺损区钻孔(自缺损边缘向中间钻孔，孔径3 mm、间距4 mm、孔深3 mm，降低关节腔内压力，孔中可见脂肪滴或渗血为度)，制造局部微骨折；行微创切口显露软骨创面，负压吸引，尽量排除关节腔内积液，贴覆止血纱布后注入制备好的第2代骨髓间充质干细胞(经过患者皮试结果为阴性)3-5 mL(约10⁷个细胞)，使其很好地敷贴在软骨缺损处，缝合皮肤后，行弹力绷带加压包扎。术后15 d，膝关节穿刺下再次注射骨髓间充质干细胞3-5 mL (约10⁷个细胞)，见图1。

治疗后康复：治疗后次日即行膝关节CPM机锻炼，提供关节软骨面的低强度摩擦。每日关节被动运动6 h，4周内避免剧烈及负重活动。治疗当天即可行踝关节功能运动，促进患肢血液循环，防止静脉血栓事件发生。

主要观察指标：所有患者均通过门诊或者电话随访了解治疗后恢复情况，根据患者临床症状改善程度、Tegner运动评级^[19]、以及Lysholm膝关节评分标准综合评定。①治疗后4周进行疗效评估。显效：全部症状消除或主要症状消除，关节功能基本恢复，能参加正常工作和劳动，Tegner运动评级4级以上；有效：主要症状基本消除，主要关节功能基本恢复或有明显进步，Tegner运动评级3-4级；无效：和治疗前比较，症状和功能无明显改善。②Lysholm膝关节功能评分：治疗前、治疗后及随访时根据Lysholm膝关节功能评分问卷进行评分。治疗前包括患者行走、疼痛、关节不稳及体力活时的表现，治疗后包括疼痛、活动及关节活动度等指标，均由高年资住院医师随访统计。

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讨论

膝关节软骨损伤的治疗一直是骨科医师面临的难题。目前临床采用的治疗方法包括Pridie钻孔、软骨移植、组织工程修复、关节镜下微骨折等。这些方法对于缓解损伤所带来疼痛症状、延缓关节退行性变和恢复一定的关节功能都具有重要作用。但由于关节软骨没有神经支配，也缺乏血运，其营养代谢仅通过关节液进行，故而修复起来十分困难。如何促进软骨修复，缩短病程就成为一个亟需骨科医师解决的课题。关于软骨损伤的研究表明：全层损伤时修复组织的细胞来源，完全由骨髓间充质细胞的增殖和分化完成^[20]。

微骨折术通过在裸露的软骨下骨板打孔，造成软骨下骨小梁微骨折，使骨髓成分溢出，软骨缺损区局部形成表层血凝块，为骨髓间充质干细胞的增殖和转化提供可能，最终在多种因素的共同作用下形成纤维软骨，修复缺损，并且微骨折术并不会影响其他关节软骨修复方法的实施^[21-24]。但单纯微骨折术所能获得的骨髓间充质干细胞数量有限，且随着年龄增大，患者体内干细胞和未分化细胞数量会明显减少。年龄超过40岁时的骨髓间充质干细胞和体内生长因子数量明显下降，修复能力减弱^[2-4^，^25]。

1994年，基于细胞层面的关节软骨细胞移植治疗被首次提出以来^[15]，大量的研究已经证实：自体软骨细胞经体外培养后移植到软骨缺损的部位可形成透明软骨样组织；但也有诸多缺陷，如需行2次手术、获得软骨细胞及其有限且体外增殖缓慢，易发生供体感染和手术费用高等^[26-28]；此外也有研究报道：自体软骨细胞移植与更加简单安全的微骨折术相比，2年和5年临床疗效无明显差异^[29-30]。近年来，随着细胞体外扩增技术的发展，间充质干细胞在一定因素诱导下可定向分化为骨组织和软骨组织^[31]。临床上运用干细胞治疗骨软骨缺损、股骨头坏死、脊髓神经损伤等骨科疾病方面已取得了大量的研究成果^[12-13]。干细胞与软骨细胞移植相比膝关节功能恢复更好、并发症更少。对于45岁以上患者的疗效也优于软骨细胞移植^[32]。

基于上述原因，试验将骨髓间充质干细胞行体外培养扩增，待微骨折术后行膝关节腔内注射移植治疗软骨损伤。该疗法需注意的几个关键问题：①膝关节软骨损伤的诊断。膝关节MRI是检查膝关节损伤的有效手段，必要时可联合放射科有经验的高职医师阅读膝关节MRI影像资料，做出诊断。亦有超声界学者提出：膝关节软骨不同退变时期有不同声像学表现^[33]。超声检查或可作为临床诊断膝关节软骨损伤的另一辅助手段。②骨髓间充质干细胞体外培养扩增。诊断软骨损伤后，治疗前2周于髂后上棘处抽取骨髓，由专门人员培养扩增，制备细胞悬液。③膝关节腔干细胞注射技术：膝关节腔能够提供软骨细胞生长所需的各种细胞因子及应力刺激等因素，为骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化提供所需的诱导因子及微环境^[34-35]，并能促使诱导后的骨髓间充质干细胞在体内形成成熟的软骨组织。支架对于软骨的形成也起到了举足轻重的作用，支架主要包括胶原蛋白类^[35]、透明质酸^[36]、藻酸盐支架等^[37]。本研究用胶原蛋白类止血纱布作为支架，行微创切口显露软骨创面并贴覆止血纱布后注射干细胞，利用止血纱布的吸附作用维持缺损区干细胞聚集，利于软骨修复。但注射前应负压吸引排净关节腔内积液，避免过多液体稀释干细胞浓度，注射后即行弹力绷带加压包扎。治疗后次日行膝关节CPM机锻炼，提供关节软骨面的低强度摩擦。每日关节被动运动6 h，4周内避免剧烈活动及下地负重。研究表明：治疗后严格系统的康复锻炼对于促进血凝块中的骨髓间充质干细胞增殖、分化成为类软骨样组织至关重要^[8]。治疗后微骨折创面的锻炼及磨造过程，可促使创面新形成的纤维软骨向类透明软骨转化，从而更接近正常软骨^[38]。治疗后4周Tegner运动评级结果显示：13例患者全部症状消除或主要症状基本消除，关节功能基本恢复，能参加正常工作和劳动；2例患者主要关节功能基本恢复或有明显进步；1例症状和功能无明显改善，这可能与患者治疗后功能锻炼、年龄及关节症状较重有关。Lysholm膝关节评分由治疗前平均42分提高到治疗后89分，平均提高47分，功能明显改善，平均11.3个月随访均未出现症状反复和加重。总之，关节镜下微骨折加骨髓间充质干细胞移植是治疗膝关节软骨损伤的一种安全有效的方法，临床实践证明可显著改善患者功能和减轻症状，治疗效果满意。

间充质干细胞依赖于膝关节内细胞、因子及支架诱导向软骨分化。本研究在注入间充质干细胞时未额外加入外源性生长因子而紧靠体内各种细胞因子、内环境、支架及应力刺激等因素作用诱导其向软骨分化，这可能在一定程度上降低软骨细胞生成的数量。目前国内外对微骨折术联合干细胞移植的基础及临床研究较少，还需要大量的临床及基础研究去证实其有效性与安全性。

微骨折加骨髓间充质干细胞移植治疗膝关节软骨损伤

Microfracture technique plus bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for repair of articular cartilage injury of the knee

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