2.1   两组脱细胞血管支架形态观察   
2.1.1   表观形态   从大体形态上观察可见天然血管的颜色呈现淡黄色，脱细胞处理血管支架和肝素化修饰的脱细胞血管支架表面均呈白色透明状，血管壁完整(图1)。




2.1.2   微观形貌   扫描电镜显示天然血管壁表面相对完整，经脱细胞处理后血管支架表面出现大量的纤维丝，表面微观结构发生了较明显改变，表明脱细胞处理对血管的微观结构产生影响，血管中的细胞脱离较完全；与对照组血管支架相比，实验组血管支架微观形貌并未发生较大变化(图2)。



2.1.3   苏木精-伊红染色   天然血管的细胞外基质完整且呈现暗红色，细胞核呈现蓝色，有较多的细胞；两组脱细胞血管支架几乎没有细胞，仅剩下细胞外基质，呈现红色(图3)，表明已经去除了细胞。



2.2   两组脱细胞血管支架的亲水性   水接触角值表征支架亲水性能强弱，其值越小支架亲水性能越强。对照组和实验组脱细胞血管支架的水接触角分别为(67.50±3.61)° 和(62.67±4.13)°，都明显小于天然血管(P < 0.000 1)，两组脱细胞血管支架的水接触角比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。由此可见，与天然血管相比，脱细胞血管支架的亲水性能更加优良。



2.3   两组脱细胞血管支架复钙化凝血时间的比较   实验组血管支架的复钙化凝血时间长于对照组[(241±23)，(210±19) s，P=0.028]，见图5。表明脱细胞血管支架经过肝素化修饰后的抗凝血效果更好。



2.4   两组脱细胞血管支架体外血小板黏附的比较   对照组、实验组脱细胞血管支架膜上黏附的血小板平均数量分别为(15.33±0.89)，(8.67±0.58)个，组间比较差异有显著性意义(P < 0.000 1)，见图6。表明血管支架经Triton-x100/肝素钠处理后的血液相容性能更好。




2.5   两组脱细胞血管支架动态凝血时间的比较   实验组和对照组脱细胞血管支架凝血指数在10 min时分别为(78.2±1.39)%，(73.3±2.5)%，组间比较差异有显著性意义(P=0.001 8)，在其他各时间点均存在类似情况，见图7。较低的凝血指数值表示较高的凝结率，结果表明实验组脱细胞血管支架具有优良的抗凝作用。



2.6   两组脱细胞血管支架体外溶血实验结果   阳性对照组因红细胞吸水胀破发生溶血。阴性对照组因使用生理盐水红细胞能够维持自己的形态，没有发生溶血。对照组、实验组脱细胞血管支架的溶血率分别为2.8%，1.9%，都满足溶血率低于5%的国家标准(表1)。



2.7   两组脱细胞血管支架补体激活实验结果   放射免疫测定法检测结果显示，对照组、实验组脱细胞血管支架的补体水平分别为(0.97±0.08)，(0.76±0.07) μg/mL，组间比较差异有显著性意义(P=0.000 5)。

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随着生活水平的提高和生活节奏的加快，人们罹患心脑血管方面的疾病越来越多，且患病年龄趋于低龄化，对于该类疾病比较有效的治疗手段之一就是血管移植[1]。在心脏冠状动脉或外周旁路的血管移植手术中，常用自体静脉或不太常见的动脉取代病变动脉[2]。然而，部分患有血管系统性病变或者以前进行过静脉采集的患者，就不能使用自体血管进行移植，他们需要人造血管作为替代品进行手术。目前常用的人工合成血管假体材料如涤纶和膨化聚四氟乙烯，其在高流量、低阻力条件下(如大的外周动脉)作为导管有其自身的优点，但作为小口径血管移植的性能远不能达到要求[3]，因为小口径血管的内径比较小，血液的流经体积小，并且很容易形成血栓堵塞，这是造成后期移植问题的难点[4]。目前还没有能在临床应用的小口径人工血管移植物，小口径血管移植物的研究成为热点。组织工程学的发展为小口径血管移植问题的解决带来新的希望[5]。组织工程血管移植物含有细胞，能够对血流动力学和化学刺激作出生理反应，成为一种潜在的供体来源。自从WEINBERG和BELL首次应用明胶与内皮细胞和平滑肌细胞复合培养构建人工血管移植物后，组织工程血管领域得到了快速发展。组织工程血管的构建主要涉及血管支架、细胞和生长因子三大要素，其中血管支架主要包括生物衍生血管支架、高分子合成血管支架和脱细胞血管支架[6-7]。
脱细胞血管支架由于来源于动物体含有丰富的胶原蛋白纤维等细胞外基质，且其多孔的微观结构能有效模拟细胞生长的微环境[8]。应用组织工程技术构建基于脱细胞血管支架的小口径组织工程血管，是一种有应用潜力的血管移植物[9]，但是脱细胞血管支架在制备过程中出现部分细胞外基质丢失，导致其血液相容性受到影响，影响了脱细胞血管支架在临床上的应用[10]。通过对脱细胞血管支架表面的改性进而增强其血液相容性，成为研究的热点[11-12]。夏成勇等[13]采用等离子体处理对脱细胞支架表面进行改性，经处理后其具有良好的亲水性和抗凝血性。DU等[14]通过在脱细胞血管支架内填充多巴胺溶液，经沉积形成聚多巴胺涂层后在涂层上黏附比伐芦定，形成比伐芦定修饰的脱细胞血管支架，发现比伐芦定修饰的脱细胞血管支架具有较好的血液相容性、低免疫原性、生物相容性和良好的力学性能。虽然前人的研究在一定程度上都提升了脱细胞血管支架的血液相容性，但是目前还无法应用于临床，其中一个主要原因是目前所用的修饰方法还难以达到临床上满足血液相容性能的程度[15]。人们尝试利用各种抗凝血剂来修饰材料的表面以增强其血液相容性，其中肝素化修饰近年来研究最为热门，肝素钠已经在临床中应用，相对其他修饰剂而言，肝素钠的生物安全性良好，肝素化修饰也相对简单且易于操作，因而应用肝素化修饰的脱细胞血管支架有较大的潜力应用于临床研究与实践[16-17]。
鉴于此，此次研究拟应用Triton-x100对天然血管进行脱细胞处理，然后应用肝素钠进行修饰处理获得肝素化脱细胞血管支架，对其微观形貌、体外溶血率、复钙化凝血时间、动态凝血时间、血小板的黏附及补体激活情况等进行评价与分析，探究经修饰脱细胞血管支架的血液相容性变化，为其应用于小口径组织工程血管的构建和临床应用奠定基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   随机对照实验，组间比较采用单因素方差分析与LSD-t检验。
1.2   时间及地点   实验于2022年2-6月在新乡医学院完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   32只7周龄SD大鼠，体质量约250 g，雌雄不拘，由北京鑫源顺康科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2016-0008。分笼饲养，饲养环境模拟自然昼夜条件，明暗周期12 h，温度(21±2) ℃，湿度40%-50%，自由饮水。实验方案经新乡医学院伦理委员会批准(批准号为XYLL-20210237)。动物的使用符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。
1.3.2   主要试剂   Hank’s溶液(美国sigma公司)；DNAse、RNAse(合肥博美生物科技有限公司)；肝素钠(美国Hyclone公司)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐[N-(3-dimethylaminopropyl)-N´-ethylcarbodiimide hydrochlorid，EDC] (上海延长生化公司)，N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、2-(吗啡啉)乙磺酸(京莱博生物实验材料研究所)；戊二醛溶液(天津市德恩化学试剂有限公司)；Triton-x100 (北京索来宝生物科技有限公司)；CaCl2溶液、无水乙醇(天津市德恩化学试剂有限公司)。
1.3.3   实验仪器   37 ℃恒温水浴箱(北京光明医疗仪器有限公司)；高速离心机(美国Thermo Fisher公司)；UV-1100型紫外可见分光光度计(美国Thermo Fisher公司)；恒温培养箱(美国Thermo Fisher公司)；JSM-7500F型冷场发射扫描电子显微镜(日本电子株式会社)。
1.4   方法   
1.4.1   抗凝血的制备   从12只大鼠心脏共采集80 mL新鲜血液，用抗凝剂为EDTA-K2的一次性真空采血管收集，上下来回颠倒直至血液与EDTA-K2充分混匀，4 ℃条件下保存备用。同时采集部分腹主动脉，用于与脱细胞血管支架进行对比。
1.4.2   配制脱细胞溶液   血管脱细胞溶液组成：0.25%脱氧胆酸钠，0.25% Triton-x100，0.02% DNase，0.02% RNase，0.02%乙二胺四乙酸。配制100 mL的脱细胞溶液，在4 ℃条件下保存备用。
1.4.3   制备脱细胞血管支架   腹腔注射3%戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉20只SD大鼠，解剖腹部，用剪刀剪取腹主动脉，随机分成2组，分别标记为对照组和实验组，每组10条血管。
对照组处理方法：用体积分数75%乙醇反复消毒处理腹主动脉，然后用PBS多次冲洗直至液体澄清为止，应用脱细胞溶液行脱细胞处理48 h(37 ℃，100 r/min)，用PBS冲洗干净，然后把血管放进盛有Hank’s溶液的EP管内，在4 ℃条件下保存[18]。
实验组处理方法：用体积分数75%乙醇反复消毒处理腹主动脉，然后用PBS多次冲洗直至液体澄清为止，应用脱细胞溶液行脱细胞处理48 h(37 ℃，100 r/min)，用PBS冲洗干净后，把血管支架放进含有1 mg/mL肝素钠的50 mmol/L 2-(吗啡啉)乙磺酸溶液中，其中肝素钠与血管支架的质量比为1∶40，1 h后添加1 mg/mL的EDC溶液和0.5 mg/mL的NHS溶液，置于摇床上处理48 h(37 ℃，100 r/min)。取出后再用PBS冲洗干净，然后把血管放进盛有Hank’s溶液的EP管内，在4 ℃条件下保存备用[19]。
1.4.4   脱细胞血管支架形态观察
大体观察：大体观察血管支架的外观形貌，查看是否有空隙，并用数码相机拍摄。
微观形貌：将两组血管支架沿轴向剪开，裁剪成2 mm×2 mm大小的膜，应用导电胶将膜固定在载物台之上，喷金处理约50 s，利用扫描电镜观察血管支架的微观形貌。
苏木精-伊红染色：每组各取3根血管，40 g/L多聚甲醛固定24 h，将锡箔纸卷成圆柱状，用OCT将血管包埋在锡纸柱内-20 ℃冷冻至凝固，放到-20 ℃恒冷箱切片机里操作切成薄片，然后将载玻片放在-20 ℃ 冰箱保存。取各组切片复温30 min后进行苏木精-伊红染色，观察各组脱细胞情况，并比较两种方法是否会影响血管的胶原纤维。
1.4.5   脱细胞血管支架亲水性能评价   将两组脱细胞血管支架修剪成方形膜，将约5 μL蒸馏水滴在膜上，在25 ℃条件下应用SL200B型自动接触角仪测量支架的水接触角，选取6个部位测量，计算平均值[20]。
1.4.6   脱细胞血管支架复钙化凝血时间实验   每组取出3支脱细胞血管支架，放进含有PBS的试管内，PBS要完全浸没血管支架，在4 ℃条件下浸泡24 h。取出1.5 mL大鼠抗凝血，在27 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，吸取上清，把血浆放到37 ℃恒温水浴箱水浴内，预热好后在每个试管内加入200 µL血浆，用枪头吹打均匀后再预热，10 min后向每个试管内加入0.2 mL氯化钙溶液，轻轻倒转试管摇匀，每隔15 s缓慢倾斜1次。在混合液中开始出现弥漫白色颗粒纤维蛋白丝，即为复钙化凝血时间。大体观察在每个试管中出现第一条白色纤维时停止计时，记下耗时值[21-22]。
1.4.7   脱细胞血管支架体外血小板黏附实验   将两组脱细胞血管支架用剪刀纵向剪开，裁成小正方形，浸没在PBS中24 h。
取出2 mL大鼠抗凝血，在27 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，小心吸取上清，置于37 ℃恒温水浴箱预热备用。将浸泡好的血管支架放入96孔板内，铺展完全后在样本中央滴加血浆0.5 mL，迅速转到37 ℃的水浴箱中。2 h后取出，用PBS冲洗干净，置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，配好不同浓度的乙醇分次脱水，材料干燥后置于扫描电镜下观察拍照[23]。
1.4.8   脱细胞血管支架动态凝血时间实验   两组各取3个脱细胞血管支架，放进盛有3 mL Hank’s溶液的离心管内，再放入水浴箱，37 ℃孵育15 min后加入1 mL大鼠抗凝血，再次恒温孵育5 min后分别滴加0.2 mL CaCl2溶液，摇晃致使CaCl2与抗凝血充分混合。再次恒温水浴，每隔10 min吸取0.2 mL溶液，放入盛有用30 mL蒸馏水的试管内，上下颠倒均匀后静置沉淀，依照时间间隔重复5次，使用UV-1100型紫外可见光分光光度计在540 nm处测定上清溶液的吸光度值，并记录[24]。用蒸馏水做空白对照，提前在试管中加入30 mL蒸馏水，再加入1 mL大鼠抗凝血，上下颠倒摇晃均匀后放置1 h，在540 nm处测定上清溶液的吸光度值，并记录[25]。
凝血指数=Is/Iw×100%，其中，Is为抗凝血与样品、CaCl2溶液接触一定时间后的相对吸光度值，Iw为蒸馏水混合抗凝血后的相对吸光度值。
1.4.9   脱细胞血管支架体外溶血实验   将大鼠抗凝血用生理盐水按比例稀释，体积比为2∶1。取两组各3个血管支架，放到盛有生理盐水的离心管内并浸没，置于37 ℃水浴箱恒温预热。1 h后加入0.1 mL稀释后的抗凝血，继续恒温孵育1 h；在37 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，使用分光光度计在540 nm处测上清的吸光度值[26]。溶血率=(样品组吸光值－阴性组吸光值)/(阳性组吸光值－阴性组吸光值)×100%。
阳性对照组：提前把3个盛有蒸馏水的离心管在37 ℃水浴箱恒温预热，1 h后加入0.1 mL抗凝血，再次水浴1 h；把水浴好的EP管放入离心机内，在37 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，在540 nm处测上清的吸光度值[27]。
阴性对照组：提前把3个盛有生理盐水的离心管在37 ℃水浴箱恒温预热，1 h后加入0.1 mL抗凝血，再次水浴1 h；把水浴好的EP管放入离心机内，在37 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，在540 nm处测上清的吸光度值[28]。
1.4.10   脱细胞血管支架补体激活实验   将两组脱细胞血管支架用过PBS反复冲洗后，分别裁剪成0.5 cm×0.5 cm 大小的膜，各3片。然后将两组膜分别置于预先载有SD大鼠血浆的细胞培养板微孔中，以不添加膜但有血浆的微孔作为空白组，每组设计3个平行。将细胞培养板置于CO2细胞培养箱培养30 min，然后取出细胞培养板，采用放射免疫鉴定法测定血浆中补体 C3a des Arg 的质量浓度。
1.5   主要观察指标   两组脱细胞血管支架的形貌、亲水性及血液相容性。
1.6   统计学分析   运用SPSS 20.0软件进行分析，所有测得的数据都采用x±s表示。结果采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，服从正态分布且方差齐的数据组间比较采用LSD-t 检验法，方差不齐时采用Welch检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经新乡医学院生物统计学专家审核。

随着人类寿命的延长，血管的堵塞、硬化和老化导致的心脑血管疾病发病率越来越高，血管移植是一种较好的治疗方法[29-30]。血管移植物目前主要有两种来源，然而都存在一定的问题，比如自体血管移植来源有限且会造成二次创伤，人工合成的不可降解高分子聚合物血管移植物又只适用大口径(> 6 mm)的血管移植需求。近年来，组织工程与再生医学的发展为获得新型小口径血管移植物提供了新的思路[31]。基于组织工程学原理构建组织工程血管主要涉及到生长因子、血管支架和种子细胞三大要素。其中血管支架在其中起着重要作用，一方面可以作为生长因子释放的载体，另一方面也是种子细胞增殖和分化的载体[32-33]。脱细胞血管支架来源于动物体，细胞和组织相容性较好，保留了血管原有的三维形态结构，有利于内皮细胞和平滑肌细胞的黏附和增殖，是一种优良的血管支架材料。然而脱细胞血管支架在制备过程中由于经过脱细胞溶液的处理，其纤维结构受到一定的破坏，导致其部分性能会受到影响，血液相容性有所降低，因而有必要对其进行修饰改性，增强其抗凝血性能[34]。肝素是一种高度硫酸化的多糖，含有硫酸盐、磺胺和羧酸基团等离子官能团，被广泛用作抗凝剂，可抑制动静脉血栓的形成，在临床上常用于脑梗死、冠心病的治疗，在预防和治疗血栓栓塞性疾病时有显著疗效[35]。
此次研究尝试应用肝素对脱细胞血管支架进行修饰改性，以提高其血液相容性能。研究结果表明，实验组和对照组血管支架的形态结构类似，均呈现透明白色，管壁完整，由此可见肝素修饰未对血管结构造成影响。在苏木精-伊红染色中，细胞核被染成蓝紫色，细胞外基质染成了红色，两组血管支架几乎没有蓝色，这表明两组血管支架脱细胞较完全。两组脱细胞血管支架的水接触角值比较无统计学差异，表明肝素化修饰并不会导致亲水性能的改变。有研究者应用传统的Triton-x100法与Triton-x100和丹参酚酸B法制备脱细胞血管支架， 经过Triton-x100和丹参酚酸B制备的脱细胞血管支架的水接触角为(76.36±4.65)°，与单纯Triton-x100法制备的脱细胞血管支架相比差异无统计学意义[36]。
近年来，复钙化凝血时间、体外血小板黏附、动态凝血时间和体外溶血率等指标被广泛应用于生物材料体外血液相容性的评价[37]。在临床应用上，患者会面临血管移植物内壁区域再次血小板沉积和活化导致血栓的可能性，因此血管支架的表面质量对长期通畅性至关重要，血管支架的粗糙度、静电和化学性质等因素都会影响蛋白质吸附的顺序和血小板聚集[38]。如果脱细胞血管支架在内膜化形成之前具有足够的抗凝血活性，能够防止血小板黏附和聚集，则可提高血管重建成功的概率[39]。研究结果表明，与对照组相比，肝素化脱细胞血管支架的抗凝血性能显著增强。在复钙化凝血时间测定和动态凝血时间实验结果中，实验组脱细胞血管支架的复钙化凝血时间长于对照组，凝血指数值高于对照组，表明了经Triton-x100与肝素钠双重处理的血管支架具有更加优越的血液相容性。王学宁等[40]将成年犬的颈动脉进行脱细胞并经肝素修饰，应用雄性大白兔行动物移植实验，B超结果表明24只兔双侧移植血管均无血肿和血管阻塞，仅有部分移植血管区域内发现血栓，研究表明肝素化修饰显著提升了血管支架的抗凝血性能，与此次研究的有关结果一致。血小板黏附实验结果表明两组脱细胞血管支架都具有一定的抗血栓性能，并且实验组脱细胞血管支架的血小板黏附数目比对照组少。由体外溶血实验数据中可知，两组脱细胞血管支架的溶血率满足国内对于组织工程血管材料制品溶血率的检验标准(< 5%)。C3a是分子质量较低(约9 kD)且包含77个氨基酸的蛋白质片段，其本身寿命很短，会被血清酶羧肽酶N快速代谢转化为更稳定的76个氨基酸形式C3a des Arg，C3a des Arg含量是植入材料是否引起免疫反应的评价指标。补体激活实验表明，实验组脱细胞血管支架的C3a des Arg质量浓度低于对照组，提示经过Triton-x100和肝素钠双重处理后的脱细胞血管支架免疫排斥性低。总之，各血液相容性指标结果表明，脱细胞血管支架经肝素修饰后的血液相容性能获得显著改善，为其临床应用奠定了基础。
此次研究采用Triton-x100/肝素钠双重处理方法成功制备了肝素化脱细胞血管支架，并对其形态结构、亲水性和血液相容性等指标进行了评价，结果表明肝素化脱细胞血管支架具有优良的血液相容性，这为其体内移植修复缺损动脉研究奠定了基础，有望在未来应用于临床。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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文题释义：

血液相容性：植入体内的生物医学材料与血液的生物学反应和起有效作用的能力。
溶血实验：是对生物体内的红细胞进行红细胞破裂溶解检测，主要用于溶血性贫血的病因诊断。溶血是指红细胞破裂溶解现象，很多理化因素都可以引起溶血。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

脱细胞血管支架由于来源于动物体含有丰富的胶原蛋白纤维等细胞外基质，且其多孔的微观结构能有效模拟细胞生长的微环境。应用组织工程技术构建基于脱细胞血管支架的小口径组织工程血管，是一种有应用潜力的血管移植物，但是脱细胞血管支架在制备过程中出现部分细胞外基质丢失，导致其血液相容性受到影响，影响了其在临床上的应用。通过对脱细胞血管支架表面的改性进而增强其血液相容性，成为研究的热点。人们尝试利用各种抗凝血剂来修饰材料的表面以增强其血液相容性，其中肝素化修饰近年来研究最为热门，肝素钠已经在临床中应用，相对其他修饰剂而言，肝素钠的生物安全性良好，肝素化修饰也相对简单且易于操作，因而应用肝素化修饰的脱细胞血管支架有较大的潜力应用于临床研究与实践。鉴于此，此次研究拟应用Triton-x100对天然血管进行脱细胞处理，然后应用肝素钠对其修饰处理获得肝素化脱细胞血管支架，对其微观形貌、体外溶血率、复钙化凝血时间、动态凝血时间、血小板的黏附及补体激活情况等进行评价与分析，探究经修饰脱细胞血管支架的血液相容性变化，为其应用于小口径组织工程血管的构建和临床应用奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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