氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层材料的理化性质及生物相容性

doi:10.12307/2024.259

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (10): 1477-1483.doi: 10.12307/2024.259

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氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层材料的理化性质及生物相容性

吕尚毅1，2，何惠宇1，2，吾凡别克·巴合提1，3，杨泉1，2，马丽莎1，2，韩祥祯1，2

1新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复种植科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；3新疆维吾尔族自治区医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2023-02-02 接受日期:2023-04-14 出版日期:2024-04-08 发布日期:2023-08-17
通讯作者: 韩祥祯，主治医师，新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔修复种植科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:吕尚毅，男，1996年生，新疆维吾尔族自治区五家渠市人，汉族，在读硕士，主要从事口腔修复学及组织工程基础研究。
基金资助:
2021年新疆维吾尔自治区科技援疆计划项目(2020E02133)，项目负责人：韩祥祯

Physicochemical properties and biocompatibility of graphene oxide-hydroxyapatite composite coating materials

Lyu Shangyi1, 2, He Huiyu1, 2, Wufanbieke · Baheti1, 3, Yang Quan1, 2, Ma Lisha1, 2, Han Xiangzhen1, 2

1Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Department of Stomatology, Xinjiang Uygur Autonomous Region Hospital, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2023-02-02 Accepted:2023-04-14 Online:2024-04-08 Published:2023-08-17
Contact: Han Xiangzhen, Attending physician, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Lyu Shangyi, Master candidate, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital (Affiliated Stomatological Hospital) of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
2021 Science and Technology Aid Plan for Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2020E02133 (to HXZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

氧化石墨烯：是由6个碳原子所组成的六圆环二维原子晶体，拥有较大的比表面积、较强的力学性能、较多的含氧基团，在与其他材料进行结合后可提升复合材料的机械性能、亲水性和与聚合物基体的亲和性。近年来，氧化石墨烯的生物学性能尤为突出，具有促进骨髓间充质干细胞、成骨细胞、成纤维细胞增殖的能力。
生物相容性：是指材料与生物体之间相互作用后产生的各种生物、物理、化学等反应的一种概念，也就是材料植入人体后与人体的相容程度。

背景：医用钛及钛合金种植体在临床应用中已经取得较好的治疗效果，但是仍存在种植体周围炎、松动、脱落等现象。

目的：探究氧化石墨烯涂层材料的理化性能及其对骨髓间充质干细胞的影响。
方法：①采用电化学沉积方法在钛片表面分别制备羟基磷灰石涂层和氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层，通过扫描电镜、X射线能量色散谱、X射线光电子能谱、X射线衍射仪、拉曼光谱仪、接触角测量仪分析涂层的表面形貌、物相结构、官能团、元素成分及表面亲水性能；②分离培养小鼠骨髓间充质干细胞，分别接种于纯钛、羟基磷灰石涂层和氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层表面，利用CCK-8法和扫描电镜对材料表面细胞的增殖、形态和生长状态进行评价。

结果与结论：①扫描电镜、X射线能量色散谱显示，氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层表面较羟基磷灰石涂层、纯钛更平展、致密及均匀；X射线光电子能谱、X射线衍射、拉曼光谱显示，在钛片表面成功制备了羟基磷灰石涂层、氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层；氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层的亲水性能较羟基磷灰石涂层、纯钛更优；②CCK-8检测显示，随着共培养时间的延长，3组材料表面的骨髓间充质干细胞数量增加，共培养1，4，7 d，氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层表面的细胞增殖吸光度值均高于羟基磷灰石涂层、纯钛(P < 0.000 1)；共培养4 d后的扫描电镜显示，3组材料表面的骨髓间充质干细胞均呈纺锤形，其中氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层表面的细胞具有较好的拉伸性能，呈多边形，细胞边缘可见多个触角黏附于涂层表面，且表面的丝状足伸长量较纯钛和羟基磷灰石涂层多；③结果显示，氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层材料是一种理化性能及生物学性能良好的涂层材料。

https://orcid.org/0009-0004-5149-0465(吕尚毅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 氧化石墨烯, 羟基磷灰石, 电化学沉积, 骨髓间充质干细胞, 生物相容性

Abstract: BACKGROUND: Medical titanium and titanium alloy have achieved good therapeutic effects in clinical applications, but there are still some phenomena such as peri-implant inflammation, loosening and shedding.
OBJECTIVE: To explore the physicochemical properties of graphene oxide coating materials and their effects on bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: (1) Hydroxyapatite coating and graphene oxide/hydroxyapatite composite coating were prepared on a titanium surface by electrochemical deposition. The surface morphology, phase structure, functional groups, elemental composition and surface hydrophilicity of the coating were analyzed by scanning electron microscopy, X-ray energy dispersion spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy, X-ray diffraction, Raman spectroscopy, and contact angle measurement instrument. (2) Mouse bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured and inoculated on pure titanium, hydroxyapatite coating and graphene oxide/hydroxyapatite composite coating, respectively. CCK-8 assay and scanning electron microscopy were used to evaluate the proliferation, morphology and growth status of the coated cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy and X-ray energy dispersion spectra showed that the surface of graphene oxide/hydroxyapatite composite coating was more flat, compact and uniform than that of hydroxyapatite coating and pure titanium. X-ray photoelectron spectroscopy, X-ray diffraction and Raman spectroscopy showed that hydroxyapatite coating and graphene oxide/hydroxyapatite composite coating were successfully prepared on the surface of the titanium sheet. The hydrophilicity of graphene oxide/hydroxyapatite composite coating was better than that of hydroxyapatite coating and pure titanium. (2) CCK-8 assay showed that the number of bone marrow mesenchymal stem cells on the surface of the three groups increased with the extension of co-culture time. On days 1, 4, and 7, the proliferative absorbance of the cells on the graphene oxide/hydroxyapatite composite coating was higher than that on hydroxyapatite coating and pure titanium (P < 0.000 1). Scanning electron microscopy after 4 days of co-culture showed that bone marrow mesenchymal stem cells on the surface of the three groups of materials were fusiform. The cells on the surface of graphene oxide/hydroxyapatite composite coating showed good tensile properties and were polygonal. Multiple antennae could be seen attached to the coating surface at the edge of the cells, and the elongation of the filamentous foot on the surface was more than that on pure titanium and hydroxyapatite coatings. (3) The results show that graphene oxide/hydroxyapatite composite coating material is a kind of coating material with excellent physicochemical and biological properties.

Key words: graphene oxide, hydroxyapatite, electrochemical deposition, bone marrow mesenchymal stem cell, biocompatibility

中图分类号:

吕尚毅, 何惠宇, 吾凡别克·巴合提, 杨泉, 马丽莎, 韩祥祯. 氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层材料的理化性质及生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(10): 1477-1483.

Lyu Shangyi, He Huiyu, Wufanbieke · Baheti, Yang Quan, Ma Lisha, Han Xiangzhen. Physicochemical properties and biocompatibility of graphene oxide-hydroxyapatite composite coating materials[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(10): 1477-1483.

图/表（结果） 13

2.1 各组样品理化性能表征结果
2.1.1 各组样品表面形貌大体观察发现，纯钛表面经砂纸逐级打磨成“镜面”外观，对照组样品呈乳白色，实验组样品呈浅黄色，相较于对照组样品，实验组样品表面没有明显裂纹和剥脱，见图2。

通过扫描电镜对各组样品的细微形貌进行观察，如图3所示，可以看见空白对照组样品表面有砂纸处理后的划痕；对照组样品表面比较粗糙，有较多裂纹和块状物生成；实验组样品虽然涂层也有部分块状物，但整体相对较为平展、均匀，说明了氧化石墨烯有助于羟基磷灰石的结晶和成核，这种现象出现的原因可能是氧化石墨烯具有较高的比表面积。另外，在高倍镜下可以看到氧化石墨烯纳米结构的折叠，这说明氧化石墨烯在电化学沉积反应过程中可以提供更多的晶核，从而促进羟基磷灰石的结晶更为致密且均匀。

2.1.2 实验组样品涂层X射线能量色散谱分析结果见图4。

表1为实验组样品氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层表面元素分布定量分析结果，结果显示涂层中含有C、Ca、P、O、Cl元素，且在该微型区域中均匀分布，Cl元素应该是在制备复合涂层时加入盐酸调节pH值所导致的。另外，检测结果中没有钛元素，说明制备的氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层是较为致密的。

2.1.3 各组样品表面X射线光电子能谱分析结果图5显示各组样品表面的化学成分存在显著差异，相较于空白对照组样品，实验组、对照组样品表面多了Ca2p、P2p，是羟基磷灰石中的元素组成。另外，实验组、对照组样品未见Ti2p波峰，可以说明涂层完全将基底材料包裹，这与X射线能量色散谱分析结果相一致。

2.1.4 各组样品X射线衍射分析结果图6可见特征性氧化石墨烯衍射峰、羟基磷灰石衍射峰以及基底钛衍射峰，氧化石墨烯有1个主要的特征峰，在35.1°；羟基磷灰石有4个主要的特征峰，在25.9°，31.9°，33.1°，49.6°。此次分析图谱基本与氧化石墨烯和羟基磷灰石粉末衍射标准卡片吻合，说明氧化石墨烯和羟基磷灰石是通过电化学的方法成功沉积在钛表面上的。

2.1.5 各组样品拉曼光谱分析结果图7可见所制备的实验组样品涂层具有明显的1 596 cm-1处的 G 峰和1 357 cm-1处的 D 峰，G峰表示氧化石墨烯特征性的 sp2 结构，D峰是氧化石墨烯无序振动引起的特征峰；而未添加氧化石墨烯的空白对照组、对照组样品则没有上述2种波峰的出现。此外，图中还可以观察到在594，962，588 cm-1处有3个PO43-的特征峰，产生这个特征峰的原因是因为羟基磷灰石中含有 PO43-；同时在786 cm-1处的还有Ti-O的特征峰。结合之前氧化石墨烯的G峰和D峰，可以推断出涂层中不仅含有氧化石墨烯也含有羟基磷灰石晶体，且两者能有效地相融合。

2.1.6 各组样品表面接触角测试结果接触角是涂层材料表面上的半圆形水滴与材料表面所形成的夹角。各组样品表面润湿性评价如图8所示，空白对照组、对照组、实验组的静态接触角分别为(19.16±1.71)°，(11.16±1.63)°，(6.63±1.61)°，3组相互比较差异有显著性意义(P < 0.05)，表明氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层的亲水性最优。

2.2 各组样品生物相容性检测结果
2.2.1 骨髓间充质干细胞培养及鉴定结果第3代小鼠骨髓间充质干细胞体外培养过程中生长良好，镜下呈纺锤形、梭形密集成网状，见图9；流式细胞术检测细胞表面抗原CD29阳性表达，CD31、CD45阴性表达，见图10。

2.2.2 各组样品表面的细胞增殖及DAPI染色骨髓间充质干细胞与3组样品共培养的CCK-8检测结果，如图11所示，随着接种时间的延长3组细胞数量明显增加，在相同时间点下，实验组样品表面的细胞增殖吸光度值高于对照组、空白对照组，反映了随着时间的延长3组细胞都在增殖，但在每个时间点氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层上的细胞增殖更多；但是，阴性对照组的细胞增殖吸光度值最高，说明各样品组异物反应仍然存在。图12是各组样品表面细胞DAPI染色，共培养1，4，7 d时，实验组样品表面的细胞黏附更加密集、数量更多，这与CCK-8实验结果一致。

2.2.3 各组样品表面细胞黏附及生长状况在各组样品上孵育4 d后的骨髓间充质干细胞形态如图13所示，3组样品表面的细胞均呈纺锤形，其中实验组样品表面的细胞具有较好的拉伸性能，呈多边形，细胞边缘可见多个触角黏附于涂层表面，并且表面的丝状足伸长量较空白对照组和对照组多。

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引言

材料方法

1.1 设计材料表征及体外细胞学实验，组间比较行one-way ANOVE分析，多组间的两两比较使用Bonferroni法。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2022年8月在新疆医科大学第一附属医院科技楼干细胞研究实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6-8 周龄Balb/c小鼠5只，体质量 25-30 g，雌雄不拘，由新疆医科大学医学动物实验中心提供，使用许可证号：SYXK(新)2018-0003。实验方案经新疆医科大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准，动物伦理审核项目编号：IACUC-2021902-01。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规，实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

1.3.2 主要材料、试剂与仪器商用纯钛片(TA1级，纯度> 99.6%，宝鸡泰宇鑫金属有限公司，陕西)；电子天平(BS124S，赛多利斯科学仪器公司，北京)；氧化石墨烯水溶液(苏州先丰纳米有限公司，江苏)；粒径20 nm纳米级羟基磷灰石(埃普瑞纳米材料公司，南京)；α-MEM 基础培养液、PBS(Hyclone，美国)；胰酶、胎牛血清(Gibco，美国)；FITC标记的CD29、CD31、CD45抗体(BioLegend，美国)；扫描电镜(auriga-bu，德国蔡司)；X射线能量色散谱仪(auriga-bu，德国蔡司)；X射线衍射仪(D8 ADVANCE，德国布鲁克公司)，X射线光电子能谱仪(PHI 5000VersaProbe，美国PE公司)；拉曼光谱Ramman(LabRAM HR Evo，法国 Dilor)，接触角测量仪(POWEREACH，上海)；酶标仪(MultiskanGo)。氧化石墨烯与纳米羟基磷灰石的微观形貌，见图1。

1.4 实验方法
1.4.1 涂层的制备以钛片(1 cm×1 cm×0.1 cm)作为基底，表面用#600、#800、#1 000和#1 200水砂纸逐号抛光，钛片边缘打磨圆钝以避免边缘效应，依次在丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗各15 min，最后在空气中干燥。
电解液的制备：将纳米级羟基磷灰石分散在无水乙醇中，磁力搅拌器37 ℃搅拌3 h，形成羟基磷灰石电解液。将氧化石墨烯水溶液分散至无水乙醇，磁力搅拌器37 ℃搅拌3 h，形成氧化石墨烯悬浮液；然后，将纳米级羟基磷灰石加入该悬浮液中，在37 ℃下再次搅拌3 h，形成氧化石墨烯-羟基磷灰石电解液。以上过程均用盐酸(HCI)调节pH值(pH=5.0-6.0)。
涂层的制备：于37 ℃电解槽中行电沉积，加入电解液200 mL(羟基磷灰石电解液，氧化石墨烯-羟基磷灰石电解液)，阳极为石墨棒，阴极为钛片，两电极之间距离为2 cm，同时磁力搅拌器搅拌，搅拌速度为180 r/min，30 V直流电源，电化学工作站的电流密度为i=0.8 mA/cm2，沉积5 min。将制备好的样品从电解液中取出，室温干燥24 h，得到羟基磷灰石涂层(对照组)、氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层(实验组)，以纯钛片作为空白对照。
1.4.2 各组样品理化性能的检测与表征利用扫描电镜对比观察各组样品表面形貌；X射线能量色散谱对各组样品微区成分元素种类与含量进行分析；X射线光电子能谱仪分析涂层表面化学成分，射线源为铜靶 Kα(λ=0.154 11 nm)系，高压为 14.0 kV，功率为 250 W，以 C 1s(284.6 eV)为基准进行结合能校正；X射线衍射仪分析各组样品晶体的化学构成，测试条件：扫描范围 2°-80°；拉曼光谱测定涂层中化学基团的振动吸收光谱；采用接触角测量仪测量各组样品表面与液滴夹角，评估表面亲水性能。
1.4.3 各组样品的生物相容性检测
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定[12]：采用全自动实验动物窒息器处死5只Balb/c小鼠，完全浸泡在体积分数为75%乙醇中消毒 5 min，在严格无菌条件下使用组织剪分离股骨和肱骨并立刻浸泡在含双抗的PBS中。在超净台上，用1 mL无菌注射器吸取含体积分数为15%胎牛血清的α-MEM 条件培养液，从长骨的一端彻底冲洗骨髓腔，将骨髓冲出(反复此过程至长骨颜色呈白色)。置于直径10 cm细胞培养皿中，反复多次吹打培养皿中的液体，使培养皿中的细胞均匀离散。首次换液时间在3 d后，之后每隔2 d换液一次，待原代细胞长至 80%皿底即可进行传代，按1∶3的比例接种于新的培养皿中，将传至第3代的骨髓间充质干细胞用于体外细胞学实验。取细胞浓度为1×108 L-1的骨髓间充质干细胞，PBS重悬至流式管中，避光，分别加入5 μL FITC标记的CD29、CD31、CD45抗体孵育细胞，并设立空白对照组，孵育0.5 h，PBS洗涤，经滤网过滤至标记好的流式管后上机，采用流式细胞术检测干细胞表面标志CD29、CD31、CD45表达。
细胞增殖：将3组样品高温高压消毒；取第3代骨髓间充质干细胞，经细胞计数，以 5×104个/孔的细胞密度分别与各组样品接种到24孔板中，以单独培养的细胞为阴性对照，置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中共培养1，4，7 d。在每个时点，采用CCK-8法通过检测450 nm处的吸光度值来定量评价细胞活力。最后，为直接观察骨髓间充质干细胞增殖在涂层表面，应用DAPI对细胞核进行染色，用共聚焦激光扫描显微镜拍摄有代表性的图像。
细胞形态的观察：将3组样品高温高压消毒后，置于24孔板内；取第3代骨髓间充质干细胞，经细胞计数，以5×104个/孔的细胞密度分别接种到24孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养。培养4 d 后，用PBS彻底冲洗2次，去除未附着的细胞，剩余细胞用2.5%戊二醛固定过夜，固定细胞分别在体积分数30%，50%，70%，80%，90%和100%系列梯度乙醇溶液中脱水10 min，然后对各组样品进行临界点干燥，常规喷金，于扫描电镜下观察样品表面细胞的形态、铺展程度及生长情况。
1.5 主要观察指标各组样品的理化性能与生物相容性。
1.6 统计学分析使用Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析，各实验样本量至少为3个，用x±s来表示定量数据。接触角组间比较行one-way ANOVE分析；CCK-8组间比较采用方差分析，多组间的两两比较使用Bonferroni法。P < 0.05表示差异有显著性意义。以上所有实验均重复3次。该文统计学方法已经新疆医科大学基础医学院生物统计学专家审核。

讨论

牙列缺损、缺失是口腔临床的常见病和多发病，随着人民生活水平的提高和齿科材料技术的完善，使用种植的方式来修复缺失牙已成为大的趋势[1，13]。近年来骨组织工程发展十分迅速，其修复方法在经历了切除-修补-替代-再生过程后得到了更新与完善[14]，研究具有良好骨修复能力的骨移植物并用于修复受损部位及功能重建是骨组织工程的最终目标。支架材料、种子细胞和生物活性分子作为组织工程的三要素，在修复骨缺损的过程中发挥着重要的作用[15]。
医用钛及钛合金依靠其优良的力学性能和抗腐蚀性在临床应用中取得较好的治疗效果，但是仍存在种植体周围炎、松动、脱落等现象[16-18]。在最近的文献中，许多学者用不同的表面涂层对钛表面进行了改性，一些涂层对钛的生物相容性能有一定的改善作用。近年来，由于羟基磷灰石有良好的生物相容性和骨导电性[19-20]，常作为生物分子缓释载体被应用于种植体表面生化修饰[20-21]。有研究表明，羟基磷灰石表面涂层种植体植入体内后可以和骨组织界面以化学性形式相结合[22]，但因其本身固有的力学性能和抗疲劳性差、微溶于水等缺点限制了其在人体内的运用[23]。然而，SHI等[24]在钛基体上的壳聚糖/羟基磷灰石涂层中加入氧化石墨烯以增强钛的力学性能，该复合涂层也表现出良好的生物相容性。近年来，生物材料科学家们研究了制备氧化石墨烯-羟基磷灰石复合材料的方法，并证明了该复合材料具有更高的机械性能和生物活性。氧化石墨烯-羟基磷灰石复合材料可以以粉末、体块、支架和涂层的形式制备[25-27]，粉末或块状复合材料可用于修复较小的，不连续的骨缺损；对于较大的缺损或骨缺失，可以在损伤的硬组织中加入三维多孔氧化石墨烯-羟基磷灰石复合材料，加速其再生，该复合材料材料还可以涂覆在骨科医用金属钛上以增强其骨结合能力。另有研究表明，氧化石墨烯不仅能够促进骨髓间充质干细胞、成骨细胞、成纤维细胞的增殖[28]，还能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化和提高其分化速率[29-30]。基于以上研究，此次实验将羟基磷灰石涂层和氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层的表面形貌、物相结构、生物学性能进行研究比对，为骨组织工程选择适宜的新型植入体材料提供参考。
为了在钛表面形成均匀、致密的涂层，将纳米级羟基磷灰石粉末和氧化石墨烯水溶液分散在无水乙醇中，伴随磁力搅拌器搅拌，以获得更好的粒子分布[31]，通过电化学沉积的方法在基底钛上制备了均匀、致密的氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层。在此次实验中，从扫描电镜观察到羟基磷灰石涂层表面存在裂纹且比较粗糙，有较多块状物质，虽然氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层也有块状物，但外表相对较为平展、均匀，造成这种现象的原因在于氧化石墨烯具有较高的比表面积；涂层材料边缘附近可以看到有纳米结构的折叠，另外氧化石墨烯在电化学反应过程中还能提供更多的晶核，使羟基磷灰石结晶更为致密和均匀。X射线能量色散谱分析图谱也再次证明了氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层是均匀、致密的，涂层中的Cl元素应该是在制备电解液时加入盐酸调节pH值所导致的。从X射线光电子能谱分析图谱中未检测出C-C、-COO-、C=O等官能团的特征峰，而这些对应的正是氧化石墨烯碳骨架sp2杂化后碳原子形成的化学键和官能团。在X射线衍射分析图谱中氧化石墨烯的衍射峰较少，只有一个，这可能是因为氧化石墨烯为单层片状二维结构、为弱结晶物质、其原子分布轴向不规律所导致[32]。然而在拉曼光谱图中看到了氧化石墨烯的特征峰G峰和D峰，恰好证明了涂层中是含有氧化石墨烯的。另外，此次实验研究结果还表明氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层的表面润湿性最好，亲水性较好可能与其表面形貌均匀、平展有关。涂层的亲水性在细胞反应中起着重要的作用，许多研究报道良好的亲水性涂层可以促进细胞黏附。
选用骨髓间充质干细胞作为种子细胞，经流式细胞术鉴定其表面标志物CD29(+)，CD31(-)，CD45(-)，镜下观察呈纺锤形、梭形密集成网状。有研究表明，羟基磷灰石和氧化石墨烯涂层均有促进细胞增殖、黏附的能力。此次实验将骨髓间充质干细胞传至 P3代时将其接种于3组材料的表面培养1，4，7 d，利用细胞计数CCK-8 法评价氧化石墨烯涂层材料对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响，结果显示3组的细胞增殖吸光度值均随着细胞接种时间的延长明显增加，但在每个时间点，氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层组的吸光度值都明显高于羟基磷灰石涂层组与纯钛组。对3组材料上骨髓间充质干细胞培养 1，4，7 d 进行的细胞核染色后也表现出上述结果，随着培养时间的延长，3组细胞数量都是增多的，但每个时间点氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层组的细胞数目明显多于羟基磷灰石涂层组与纯钛组。这些结果表明氧化石墨烯的加入优化了原涂层材料的表面活性，且进一步促进了骨髓间充质干细胞的增殖。骨髓间充质干细胞与各组材料共培养4 d后，扫描电镜观察发现：氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层表面的骨髓间充质干细胞能够充分伸展、细胞生长状态更佳，细胞形态大致为长梭形，同时还能清晰观察到丝状伪足和更多的基质；但纯钛和羟基磷灰石涂层表面的骨髓间充质干细胞伸展不足，且细胞伪足较少，甚至没有。由此可以确定，加入氧化石墨烯使细胞的黏附与铺展能力得以加强：一方面，这是因为氧化石墨烯表面含有大量含氧基团，前期实验也证明其具有良好的亲水性，能更好地吸附粘连蛋白，从而诱导骨髓间充质干细胞的早期黏附[33]；另一方面，此次实验使用了纳米级材料制备复合涂层，其表面的纳米级粗糙度也促进了涂层表面的蛋白吸附，利于细胞早期黏附。初步表明，3组材料表面都符合骨髓间充质干细胞的生长条件，但氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层表面对骨髓间充质干细胞的增殖和黏附更有利。细胞黏附是细胞行使其功能的重要前提，如细胞迁移、细胞增殖、细胞分化、蛋白质合成和钙化的形成等[34]。
综上，此次研究采用电化学沉积的方法在钛表面成功制备了羟基磷灰石涂层、氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层，且氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层的理化性能更为优秀；在体外细胞学实验中，与羟基磷灰石涂层、纯钛相比，氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层在促进骨髓间充质干细胞黏附、增殖方面具有更好的生物活性。复合涂层的长期稳定性、载药能力、对细胞的分化能力及相应的体内实验等将是以后研究的方向[35]。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

氧化石墨烯-羟基磷灰石复合涂层材料的理化性质及生物相容性

Physicochemical properties and biocompatibility of graphene oxide-hydroxyapatite composite coating materials

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