2.1   姜黄素纳米粒表征结果   扫描电镜下纳米粒分散均匀，形态规则，见图1A。粒度分析仪测得姜黄素纳米粒平均粒径为(129.9±29.7)nm，见图1B。傅里叶变换红外光谱显示370-3 200 cm-1范围内伸缩震动变宽，验证了-OH基团的引入，1 000 cm-1处出现新的吸收峰即C-O键吸收峰，见图1C，证实葡聚糖和牛血清白蛋白反应生成了糖蛋白[30]。通过糖蛋白和姜黄素之间的静电和疏水相互作用，姜黄素被固定在糖蛋白颗粒中形成姜黄素纳米粒[13]。



2.2   缓释微球的表征结果   光镜下缓释微球呈球形，分散性好，无聚集融合现象，见图2A。荧光显微镜下的荧光缓释微球呈球形，姜黄素纳米粒分散均匀，见图2B。图2C是冻干微球的实体图片，左侧为未载药微球，右侧缓释微球因载有姜黄素而呈现淡黄色改变。冻干后缓释微球的平均直径为(102.6±7.4) μm，依旧保持球形，表面呈多孔结构，孔径大小分布主要集中于4-9 μm，表面接触面积显著提升，且表面可观察到姜黄素纳米粒，这区别于未载药微球，见图2D，E。缓释微球在含有胶原酶的PBS中，其质量逐渐减小，至第5周时逐渐消失，见图2F。
2.3   缓释微球包封率、载药率及释放曲线    缓释微球的包封率为(76.47±5.16)%，载药率为(15.36±4.54)%。缓释微球体外药物释放曲线显示，缓释微球在最初1周内释放药物相对较快，占药物总量的(49.43±3.40)%，随后释放逐渐减缓，且释放浓度相对稳定，至28 d时释放姜黄素总量为(84.11±2.71)%，见图2G。



2.4    体外细胞实验结果   
2.4.1    细胞增殖实验结果   

姜黄素的细胞毒性：当姜黄素终浓度在1，10，20，40 μmol/L时，髓核细胞增殖吸光度值与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；当浓度为60，100 μmol/L时，细胞增殖吸光度值出现下降，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，髓核细胞增殖受到抑制，见图3。根据CCK-8实验结果及相关文献报道[31]，选取20 μmol/L姜黄素用于后续实验。

微球的细胞毒性：正常环境条件下，3组髓核细胞均持续增殖，第1-7天细胞增殖吸光度值持续上升，各组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4A。在H2O2诱导的氧化应激环境下，对照组和未载药微球组髓核细胞增殖吸光度值较正常环境下持续降低，缓释微球组髓核细胞增殖虽然也受抑制，但第7天的细胞增殖吸光度值高于对照组、未载药微球组(P <  0.05)，见图4B。



2.4.2    细胞活/死染色结果    在正常环境下，两组微球上的髓核细胞生长良好，活细胞均匀生长于微球表面；在氧化应激环境下，未载药微球组死细胞数量较正常化境下明显增多，缓释微球组死细胞数量与正常环境下相比无明显变化，见图5。



2.4.3    缓释微球在基因水平延缓髓核退变的结果    qRT-PCR检测结果显示，相较于正常环境，氧化应激环境激活了髓核细胞中多种炎症因子相关基因的过量表达。在正常环境下，未载药微球组、载药微球组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、基质金属蛋白酶3、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的mRNA表达量与对照组比较，差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图6。

与正常环境下对照组比较，对照组、未载药微球组应激环境下的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、基质金属蛋白酶3的mRNA表达量升高(P < 0.05)，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的mRNA表达量降低(P < 0.05)；缓释微球组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6及蛋白聚糖的mRNA表达量无明显变化(P > 0.05)，基质金属蛋白酶3的mRNA表达量升高(P < 0.05)，Ⅱ型胶原的mRNA表达量降低(P < 0.05)，见图6。

在应激环境下，载药微球组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6及基质金属蛋白酶3的mRNA表达量降低(P < 0.05)，Ⅱ型胶原与蛋白聚糖的mRNA表达量升高(P < 0.05)，见图6。
2.5   动物体内实验结果   
2.5.1    实验动物数量分析    30只大鼠全部进入结果分析。
2.5.2    影像学评估结果    见图7。

通过X射线片检查评估不同时间各组大鼠尾椎椎间隙高度变化。术后1周时，缓释微球组椎间隙高度下降不明显，与正常组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，退变组、未载药微球组、姜黄素组椎间隙高度明显降低(P < 0.05)。至第4周时，缓释微球组椎间隙高度低于正常组(P < 0.05)，高于退变组、未载药微球组、姜黄素组(P < 0.05)，未载药微球组与退变组类似(P > 0.05)，姜黄素组较退变组、未载药微球组椎间隙高度下降有所放缓，但与缓释微球组相比仍有差距。整体而言，缓释微球组椎间隙高度下降缓慢，椎体形态较好，无明显骨赘形成。

MRI图像变化趋势与X射线片结果一致。在T2序列下，正常组术后1，4周均显示为高含水量的正常髓核信号，而退变组、未载药微球组、姜黄素组则出现了明显的信号强度下降。缓释微球组髓核信号强度在第1周时较正常组无明显下降，在第4周时信号稍弱于正常组，但强于退变组、未载药微球组、姜黄素组(P < 0.05)，MRI评分变化趋势与影像学图像结果一致。
2.5.3    组织学评价结果    见图8。

在第4周对各组椎间盘进行组织学评估。苏木精-伊红染色显示，正常组椎间盘结构完好，髓核完整性好，纤维环组织呈环状规律分布，两者界限清晰；缓释微球组出现轻度的髓核组织减少，纤维环组织轻度扭曲(< 30%)，两者边界出现轻微中断；退变组、未载药微球组及姜黄素组均可见髓核细胞大量丢失，髓核组织严重萎缩，纤维环结构紊乱、断裂愈发严重，两者界限模糊，组织学评分均显著低于缓释微球组。 番红固绿染色可观察髓核组织胶原含量，胶原组织经番红O-固绿染色后呈橘红色。番红O-固绿染色显示，正常组髓核组织完好，细胞外基质丰富，呈现橘红色；缓释微球组胶原较正常组减少，并出现细胞外基质轻度凝结；退变组、未载药微球组及姜黄素组髓核细胞外基质丢失严重，胶原含量显著减少。

Ⅱ型胶原免疫组化染色结果与番红固绿染色结果一致，缓释微球组Ⅱ型胶原表达较正常组有轻度下降，但明显高于其他3组。以正常组为对照，可在退变组、未载药微球组、姜黄素组观察到高表达的肿瘤坏死因子α信号，即有较多深染髓核细胞，阳性染色面积率高，而缓释微球组的肿瘤坏死因子α信号较低，与正常组最为接近。组织学评分和半定量分析也进一步证实了上述结果。
2.6    微球的生物相容性    由体外细胞增殖实验、活/死染色、qRT-PCR，以及动物体内实验组织学评估结果，可知姜黄素缓释微球具有良好的生物相容性。

[1] VOS T, ABAJOBIR AA, ABBAFATI C, et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 2017;390(10100):1211-1259. [2] ROBERTS S, EVANS H, TRIVEDI J, et al. Histology and pathology of the human intervertebral disc. J Bone Joint Surg Am. 2006;88A:10-14. [3] FRAPIN L, CLOUET J, DELPLACE V, et al. Lessons learned from intervertebral disc pathophysiology to guide rational design of sequential delivery systems for therapeutic biological factors. Adv Drug Deliv Rev. 2019;149:49-71. [4] RISBUD MV, SHAPIRO IM. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nat Rev Rheumatol. 2014;10(1):44-56. [5] GRUBER HE, HANLEY EN. Biologic strategies for the therapy of intervertebral disc degeneration. Expert Opin Biol Ther. 2003;3(8):1209-1214. [6] GOEL A, KUNNUMAKKARA AB, AGGARWAL BB. Curcumin as “Curecumin”: From kitchen to clinic. Biochem Pharmacol. 2008;75(4):787-809. [7] MA T, GUO C J, ZHAO X, et al. The effect of Curcumin on NF-kappa B expression in rat with lumbar intervertebral disc degeneration. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2015;19(7):1305-1314. [8] Barzegar A, Moosavi-Movahedi AA. Intracellular ROS Protection Efficiency and Free Radical-Scavenging Activity of Curcumin. Plos One. 2011;6(10):e26012. [9] ANAND P, KUNNUMAKKARA AB, NEWMAN RA, et al. Bioavailability of curcumin: Problems and promises. Mol Pharm. 2007;4(6):807-818. [10] TABANELLI R, BROGI S, CALDERONE V. Improving Curcumin Bioavailability: Current Strategies and Future Perspectives. Pharmaceutics. 2021;13(10):1715. [11] AN FF, ZHANG XH. Strategies for Preparing Albumin-based Nanoparticles for Multifunctional Bioimaging and Drug Delivery. Theranostics. 2017;7(15):3667-3689. [12] SADEGHI R, MOOSAVI-MOVAHEDI AA, EMAM-JOMEH Z, et al. The effect of different desolvating agents on BSA nanoparticle properties and encapsulation of curcumin. J Nanopart Res. 2014;16(9):2565. [13] FAN Y, YI J, ZHANG Y, et al. Fabrication of curcumin-loaded bovine serum albumin (BSA)-dextran nanoparticles and the cellular antioxidant activity. Food Chem. 2018;239:1210-1218. [14] YUE K, TRUJILLO-DE SANTIAGO G, MOISES ALVAREZ M, et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 2015;73:254-271. [15] SHI K, HUANG Y, HUANG L, et al. Research progress of hydrogel used for regeneration of nucleus pulposus in intervertebral disc degeneration. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2020;34(3):275-284.  [16] DE GEEST BG, URBANSKI JP, THORSEN T, et al. Synthesis of monodisperse biodegradable microgels in microfluidic devices. Langmuir. 2005;21(23):10275-10279. [17] YANG J, ZHU Y, WANG F, et al. Microfluidic liposomes-anchored microgels as extended delivery platform for treatment of osteoarthritis. Chem Eng J. 2020;400:126004. [18] BIAN J, CAI F, CHEN H, et al. Modulation of Local Overactive Inflammation via Injectable Hydrogel Microspheres. Nano Lett. 2021;21(6): 2690-2698. [19] KOTHA RR, LUTHRIA DL. Curcumin: Biological, Pharmaceutical, Nutraceutical, and Analytical Aspects. Molecules. 2019;24(16):2930. [20] ZAKERIKHOOB M, ABBASI S, YOUSEFI G, et al. Curcumin-incorporated crosslinked sodium alginate-g-poly (N-isopropyl acrylamide) thermo-responsive hydrogel as an in-situ forming injectable dressing for wound healing: In vitro characterization and in vivo evaluation. Carbohydr Polym. 2021;271:118434. [21] 王厚磊,卢伟,李德芳,等.大鼠椎间盘髓核细胞体外凋亡模型的建立[J].中国实验动物学报,2015(6):607-611. [22] CALIARI SR, BURDICK JA. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nat Methods. 2016;13(5):405-414. [23] TAYLOR SC, NADEAU K, ABBASI M, et al. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. [24] ISSY AC, CASTANIA V, CASTANIA M, et al. Experimental model of intervertebral disc degeneration by needle puncture in Wistar rats. Braz J Med Biol Res. 2013;46(3):235-244. [25] XIA K, ZHU J, HUA J, et al. Intradiscal Injection of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Nucleus Pulposus-Like Cell-Seeded Polymeric Microspheres Promotes Rat Disc Regeneration. Stem Cells Int. 2019; 2019:6806540.  [26] MASUDA K, AOTA Y, MUEHLEMAN C, et al. A novel rabbit model of mild, reproducible disc degeneration by an anulus needle puncture: Correlation between the degree of disc injury and radiological and histological appearances of disc degeneration. Spine. 2005;30(1):5-14. [27] BAI JY, ZHANG YZ, FAN Q, et al. Reactive Oxygen Species-Scavenging Scaffold with Rapamycin for Treatment of Intervertebral Disk Degeneration. Adv Healthc Mater. 2020;9(3):e1901186. [28] XU H, SUN M, WANG C, et al. GDF5-GelMA injectable microspheres laden with adipose-derived stem cells for disc degeneration repair. Biofabrication. 2020;10.1088/1758-5090/abc4d3. [29] XU Y, GU Y, CAI F, et al. Metabolism Balance Regulation via Antagonist-Functionalized Injectable Microsphere for Nucleus Pulposus Regeneration. Adv Funct. Mater. 2020;30(52):2006333. [30] ROHIWAL SS, ELLEDEROVA Z, TIWARI AP, et al. Self-assembly of bovine serum albumin (BSA)-dextran bio-nanoconjugate: structural, antioxidant and in vitro wound healing studies. Rsc Adv. 2021;11(8): 4308-4317. [31] KLAWITTER M, QUERO L, KLASEN J, et al. Curcuma DMSO extracts and curcumin exhibit an anti-inflammatory and anti-catabolic effect on human intervertebral disc cells, possibly by influencing TLR2 expression and JNK activity. J Inflamm (Lond). 2012;9(1):29. [32] MAHESHWARI RK, SINGH AK, GADDIPATI J, et al. Multiple biological activities of curcumin: A short review. Life Sci. 2006;78(18):2081-2087. [33] LAO CD, RUFFIN MTT, NORMOLLE D, et al. Dose escalation of a curcuminoid formulation. BMC Complement Altern Med. 2006;6:10. [34] 任爽,董文霞,刘锦芳,等.食品运载体系包埋姜黄素的研究进展[J].食品科学,2021,42(9):264-274. [35] EDWARDS RL, LUIS PB, VARUZZA PV, et al. The anti-inflammatory activity of curcumin is mediated by its oxidative metabolites. J Biol Chem. 2017;292(52):21243-21252. [36] MARTINS C, SOUSA F, ARAUJO F, et al. Functionalizing PLGA and PLGA Derivatives for Drug Delivery and Tissue Regeneration Applications. Adv Healthc Mater. 2018;7(1):10.1002. [37] DALY AC, RILEY L, SEGURA T, et al. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 2020;5(1):20-43. [38] 马晟,贾育松,孙旗.体内腰椎间盘退变动物模型的研究与进展[J].中国组织工程研究,2017,21(11):1790-1797. [39] ZHOU HY, BEEVERS CS, HUANG SL. The Targets of Curcumin. Curr Drug Targets. 2011;12(3):332-347. [40] PENG Y, AO M, DONG B, et al. Anti-Inflammatory Effects of Curcumin in the Inflammatory Diseases: Status, Limitations and Countermeasures. Drug Des Devel Ther. 2021;15:4503-4525. [41] WANG C, YU XH, YAN YG, et al. Tumor necrosis factor-alpha: a key contributor to intervertebral disc degeneration. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2017;49(1):1-13. [42] LIANG H, YANG XJ, LIU C, et al. Effect of NF-kB signaling pathway on the expression of MIF, TNF-alpha, IL-6 in the regulation of intervertebral disc degeneration. J Musculoskelet Neuronal Interact. 2018;18(4):551-556. [43] WANG YJ, CHE MX, XIN JG, et al. The role of IL-1 beta and TNF-alpha in intervertebral disc degeneration. Biomed Pharmacother. 2020;131:110660. [44] 白荣飞,张震,林一峰,等.三种方法建立大鼠腰椎间盘退变模型[J].中国组织工程研究,2018,22(16):2514-2519.

[1]	曹 胜, 孔令伟, 徐 昆, 孙志杰. 颈椎矢状力线参数与颈椎间盘退变患者退变节段及Pfirrmann分级的关联性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1319-1324.
[2]	练诗林, 张 燕, 蒋 强, 张晗硕, 李土胜, 丁 宇. 全血及不同方式制备富血小板血浆对髓核细胞的干预效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1199-1204.
[3]	柳晓琳, 穆新月, 马子雨, 刘树泰, 王文龙, 韩晓谦, 董志恒. 水凝胶复合载辛伐他汀蛋白微球对成骨细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 998-1003.
[4]	高 婷, 马小红, 李晓荣. 三种不同来源卵巢颗粒细胞外泌体的提取及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 860-865.
[5]	李 睿, 刘 珍, 郭子歌, 卢瑞杰, 王 晨. 纯钛表面载阿司匹林微球与聚多巴胺复合涂层促进成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 374-379.
[6]	李 玥, 吕 妍, 冯婉莹, 宋 阳, 闫 语, 关永格. 制备金丝桃苷纳米粒修复子宫内膜损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 360-366.
[7]	李 珍, 刘宏宝. 纳米粒子肾靶向的影响因素及机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 453-460.
[8]	高 旭, 邢文华. 有限元分析法在脊柱外科领域的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(18): 2921-2927.
[9]	李土胜, 丁 宇, 蒋 强, 张晗硕. 腰椎间盘源性神经痛免疫复合物表达及富血小板血浆的治疗机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(18): 2935-2942.
[10]	许大勇, 李云朋, 魏景梅, 刘汝银. 芸香苷改善大鼠椎间盘退变的机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(14): 2139-2145.
[11]	黄燕妮, 杨 华, 杨东梅, 胡旭麟, 高 鸿, 黄毅娜. 聚三亚甲基碳酸酯/β-磷酸三钙微球支架修复大鼠骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(12): 1856-1862.
[12]	范亚茹, 李瑞欣, 李凤集, 罗 睿, 刘 浩, 严颖彬. 载吲哚菁绿聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的表征及其光热效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(12): 1817-1823.
[13]	甘 甜, 王文渊, 晏殊瑾, 郝 兰, 冉海涛, 王志刚, 夏纪筑. 携载LXR激动剂近红外光响应性纳米粒的光热协同免疫效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(12): 1863-1869.
[14]	苏 梦, 王 昕, 张 津, 贝 颖, 黄 玉, 朱彦兆, 李嘉丽, 武 艳. 纳米细胞囊泡负载姜黄素促进糖尿病小鼠创面的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(12): 1877-1883.
[15]	范亚茹, 李瑞欣, 李凤集, 罗睿, 刘浩, 严颖彬. 载吲哚菁绿聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的表征及其光热效应 [J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.

腰痛严重影响人们工作和生活并带来沉重的医疗负担[1]，椎间盘退变是引起腰痛的重要原因之一。椎间盘退变主要表现为椎间盘内环境稳态失衡及细胞外基质进行性丢失，组织结构遭到破坏而无法维持正常生理功能，最终导致脊柱退行性改变[2]。椎间盘内无血管结构，其内部物质交换只能通过软骨终板微孔的弥散作用进行，一旦发生退变自身难以修复[3]。炎症信号通路激活、炎症因子泛滥、活性氧过度积累等均可导致椎间盘内环境失衡[4]，通过药物阻止上述病理过程成为研究的热点[5]。

姜黄素是从姜黄根茎中提取出的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤、抑制动脉粥样硬化等药理活性[6]。有研究证实，姜黄素通过抑制核因子κB通路激活[7]、降低组织内活性氧水平等方式延缓椎间盘退变进程[8]。目前限制姜黄素临床应用的主要原因是其水溶性差、稳定性差、生物利用度低[9]，为了克服这些缺点，可采用药物递送系统如脂质体、纳米粒、水凝胶等将姜黄素包埋其中，提高姜黄素溶解度与稳定性[10]。牛血清白蛋白作为生物载体之一，以其低抗原性、生物可降解性等特性而受到广泛关注[11]。研究人员通过合成姜黄素共轭牛血清白蛋白纳米粒来实现姜黄素的递送[12]，而 FAN等[13]通过美拉德反应将葡聚糖枝接至牛血清白蛋白上提供足够的空间位阻，使用自组装方法制备的牛血清白蛋白-葡聚糖-姜黄素纳米颗粒具备了更高的稳定性和抗氧化活性。

甲基丙烯酸酰化明胶由明胶和甲基丙烯酸酐聚合而成，具有优异的可塑性和生物相容性，是组织工程学领域的热门载体[14]。通过微流控技术将甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶制成微米级的微球，进而使用微量注射器注射至椎间盘组织内实现微创应用[15]。微流控技术通过调整各通道的直径和流速获得特定尺寸范围的单分散微球[16]，相对温和的制造条件不会破坏包载药物的活性[17]。冻干后的甲基丙烯酸酰化明胶微球表面孔隙丰富[18]，不仅利于细胞的黏附增殖，同时可提升姜黄素的生物利用度。

此次实验采用了一种简便有效的策略，首先将姜黄素组装至枝接有葡聚糖的牛血清白蛋白中形成稳定的纳米粒，进一步利用甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶将姜黄素纳米粒固定于水凝胶基质网络中，生产用于延缓椎间盘退变的姜黄素缓释微球；通过体外髓核细胞实验验证其抗炎、抗氧化性能，最终注射至大鼠退变椎间盘内，利用影像学、组织学等评估姜黄素缓释微球对于退变椎间盘组织的治疗效果。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   体外细胞培养实验，随机对照动物体内实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年1-10月在苏州大学附属第一医院骨科研究所完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物    雄性SD大鼠32只，清洁级，3月龄，体质量350-400 g，购自苏州大学实验动物中心。饲养于室温20-26 ℃、相对湿度为40%-70%的环境中。所有的外科手术以及动物喂养的方案均按照苏州大学第一附属医院伦理委员会批准的方案进行。
1.3.2    主要药物与试剂    葡聚糖、姜黄素、肉豆蔻酸异丙酯(阿拉丁试剂有限公司)；牛血清白蛋白、Live/Dead染色试剂盒(北京索莱宝生物公司)；甲基丙烯酸酐化明胶(苏州永沁泉智能设备有限公司)；H2O2(国药集团上海化学试剂有限公司)；司盘80、透析袋光引发剂、(美国Sigma公司)；FTIC-BSA(北京博奥森生物技术有限公司)；Trizol溶液(上海碧云天有限公司)；F12-DMEM培养基、胎牛血清、双抗混合液、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；CCK-8试剂盒(日本东仁生物公司)；反转录试剂盒(日本Takara公司)；甲醛溶液、EDTA脱钙溶液(中国上海源叶生物有限公司)；兔抗大鼠肿瘤坏死因子α抗体、兔抗大鼠Ⅱ型胶原抗体(美国Abcam公司)。
1.3.3    主要仪器    微流控装置(Longer)；细胞培养箱(Thermo)；荧光显微镜、倒置显微镜、石蜡包埋机(Leica)；真空冷冻干燥器(Christ)；傅里叶红外光谱仪FTIR(Nicolet)；高速离心机(Eppendorf)、扫描电子显微镜(Hitachi)；紫外可见分光光度计(天津津维)、X射线机(美国GE)；核磁共振仪器(美国GE-HDx1.5T)。
1.4   实验方法   
1.4.1   姜黄素纳米粒及缓释微球的制备    将牛血清白蛋白(20 g/L)和葡聚糖(40 g/L)溶解于去离子水中，pH值调至7。样品冻干后，置于干燥器中60 ℃孵育24 h，生成葡聚糖糖基化牛血清白蛋白。将姜黄素(5.0 g/L)溶解于乙醇中，以 1∶25的体积比添加到牛血清白蛋白-葡聚糖缀合物(5 g/L)溶液中，匀浆器混合3 min后，调pH值至5.2；80 ℃加热30 min，得到负载姜黄素的牛血清白蛋白-葡聚糖纳米粒悬液，8 000×g离心10 min，去除游离姜黄素沉淀并冻干。

通过微流控技术制备缓释微球[17]。将水相(去离子水，含质量分数5%甲基丙烯酸酰化明胶、质量分数2.5%姜黄素纳米粒和质量分数0.5%光引发剂)和油相(含质量分数5%司盘80的肉豆蔻酸异丙酯)分别从2个注射器注入微流控装置，水相流速设为20 μL/min，油相流速为600 μL/min。产生的球状微滴在蓝光照射下光交联固化，形成固态微球[18]。收集上述微球，用PBS反复洗涤去除表面活性剂，纯化后的微球冻干得姜黄素缓释微球。水相不添加姜黄素纳米粒即获得未载药微球。使用异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白替代上述流程中的普通牛血清白蛋白，可得载荧光纳米粒微球。
1.4.2    纳米粒与缓释微球表征及评估

表征：通过粒度分析仪分析姜黄素纳米粒的粒径分布。通过傅里叶变换红外光谱检测纳米粒的化学键，分辨率设为4 cm-1，范围为500-4 000 cm-1。光学显微镜下观察微球形态及大小，荧光显微镜下拍摄载有荧光纳米粒的缓释微球。将冻干后的纳米粒、微球置于电镜样品台导电胶上，表面喷金后放入扫描电镜内，观察纳米粒、微球形态并拍照。

缓释微球的包封率及载药量测定：将2 mg缓释微球重悬于2 mL丙酮中，超声处理20 min，置于摇床培养箱中37 ℃摇动24 h，18 000 r/min离心30 min弃去沉淀。上清液置于透析袋(截留分子质量12 kD)中，在PBS中透析24 h，收集透析袋外的液体，使用UV-Vis光谱在425 nm处测量吸光度值[19]，通过标准曲线方程计算姜黄素含量[20]。测量重复3次。包封率=微球中的姜黄素总质量/最初加入的姜黄素总质量×100%。载药率=微球中的姜黄素总质量/微球总质量×100%。 

缓释微球体外药物释放测定：将缓释微球悬浮溶液转移到透析袋中(截留分子质量12 kD)，随后置于40 mL的PBS中，37 ℃下搅拌(100 r/min)孵育。在不同的时间间隔取出透析液(2 mL)，随后补充等量的新鲜PBS。然后，在425 nm处测量透析液的吸光度值，并通过姜黄素的标准曲线进行计算，绘制释放曲线。

缓释微球体外降解测定：称量100 mg缓释微球投入含有0.1 μmol/L Ⅱ型胶原酶的PBS(pH=7.4，5 mL) 中，置于恒温摇床(37 ℃，80 r/min)中。每3 d更换含Ⅱ型胶原酶的PBS溶液。在指定的时间点收集微球，洗涤后冻干称质量，计算降解率。降解率BP(%)=(m0-mt)/m0×100%，其中m0是降解前初始质量，mt是指一定时间后的样品质量。
1.4.3    髓核细胞的分离培养    参照王厚磊等[21]的方法分离培养髓核细胞。取2只3月龄SD大鼠，使用3%戊巴比妥钠过量麻醉处死后，无菌条件下分离尾椎骨并取出髓核组织，置于0.1%的Ⅱ型胶原酶中消化3 h。悬浮液用滤网过滤后，1 000 r/min离心5 min，弃上清；无菌PBS洗涤3次，加入F12-DMEM完全培养基，置于细胞培养箱中培养。每72 h更换培养基，当细胞融合度至80%左右时传代。实验采用的髓核细胞为2-4代(P2-P4)。
1.4.4    体外细胞实验

微球与髓核细胞共培养：冻干后的未载药微球和姜黄素缓释微球辐照灭菌后，使用F12-DMEM完全培养基重悬。将髓核细胞重悬后计数3次，取1 mL的悬液(含有6×106细胞)滴入1 mL上述微球溶液中，适当搅拌使微球充分吸附细胞，置于细胞培养箱中共培养3 h[22]。吸去未吸附的细胞后，使用F12-DMEM完全培养基将载有细胞的微球重悬，接种至24孔板进行后续实验。

细胞增殖实验：①首先评估各浓度下姜黄素对细胞的毒性作用。96孔板中每孔加入100 μL髓核细胞，细胞浓度4×107 L-1，待细胞贴壁后分别加入由F12-DMEM培养基配置的姜黄素溶液至500 μL，姜黄素终浓度分别为0，1，10，20，40，60，100 μmol/L，培养24 h，用CCK-8试剂盒测定各浓度姜黄素下的细胞增殖情况。②评估髓核细胞处于氧化应激环境下在两种微球上的增殖能力。将适量的两种微球分别置于96孔板孔底，每孔中加入500 μL细胞悬液，细胞浓度4×107 L-1，孵育6 h；在其中一部分96孔板内，每孔加入50 μmol/L的H2O2模拟氧化应激环境，剩余的96孔板在正常环境下继续培养。两种环境下均以单独培养的细胞为对照。培养1，3，7 d后，采用CCK-8试剂盒测定髓核细胞的增殖情况。按说明书描述方法配置CCK-8工作液，即1∶10比例混合CCK-8溶液和F12-DMEM培养基，吸去培养液后PBS洗涤3次，每孔滴加100 μL CCK-8工作液，移至培养箱中避光孵育2 h，用酶标仪测定吸光度值，波长设为450 nm。

细胞活性实验：通过活/死染色试剂盒对不同环境下生长于微球上的髓核细胞进行活/死染色。将上述接种至24孔板中的载髓核细胞微球(每孔20个微球，共400 μL)在正常环境及氧化应激环境下培养3 d后，配置活/死染色工作染液(每2 mL PBS溶液中加入1 μL A液与2 μL B液)，每孔加入工作染液200 μL后避光孵育1 h。吸去染液后，倒置荧光显微镜下观察细胞活性状态，绿色荧光为活细胞，红色荧光为死细胞。
qRT-PCR分析：载细胞微球在正常环境及氧化应激环境下培养干预5 d后，通过qRT-PCR检测肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶3、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和的基因表达量。使用甲基丙烯酸酰化明胶裂解液裂解微球，1 200 r/min离心5 min，弃上清液得细胞沉淀，每孔细胞沉淀加入1 mL Trizol充分裂解，采用Trizol法提取RNA，并测定RNA浓度。随后进行反转录反应[23]，反应条件为：42 ℃进行15 min，95 ℃进行3 min。反应结束后进行qRT-PCR分析，检测上述基因表达量，按试剂盒说明书配置PCR反应体系上机检测，反应条件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，重复40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达水平。引物序列见表1。

1.4.5    动物体内实验

实验造模与分组处理：经皮穿刺已被证明是诱导椎间盘退变的有效方法[24]。以3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)腹腔内注射麻醉大鼠，消毒骶尾部，X射线片拍摄鼠尾椎正位片辅助定位，用21G针头经皮穿刺大鼠尾椎7-8(Co7-8)和8-9(Co8-9)节段，针头穿过纤维环后旋转360°并维持30 s[25]。术后再次消毒，将30只大鼠按随机抽签法分为5组，每组6只：正常组(未做穿刺)、退变组(注入PBS)、未载药微球组(注射未载药微球)、姜黄素组(注射姜黄素溶液)、缓释微球组(注射姜黄素缓释微球)。穿刺诱导退变后通过微量注射器将20 μL上述溶液注入动物模型对应椎间盘内，术后转移至动物房饲养，注意查看大鼠存活情况。

影像学评估：术后1，4周时对大鼠的尾椎进行影像学分析[26]。大鼠麻醉后取仰卧位固定于模具，分别进行X射线片、MRI检查。计算椎间盘高度指数(DHI)，DHI%表示实验组椎间盘DHI与正常组椎间盘DHI的比值[27]。使用MRI仪获取大鼠椎间盘矢状面T2加权信号图像，由对实验不知情的影像科医师对髓核T2信号强度分级评分，评估依据为改良Thomson分类法，其分级标准如下：Ⅰ级，正常，1分；Ⅱ级，非常小信号强度下降，但是可见的高信号区域面积的减小，2分；Ⅲ级，中等强度的信号减弱，3分；Ⅳ级，严重的信号强度的下降，4分。
组织学评估：术后4周对大鼠实施安乐死，无菌条件下手术分离获取对应椎间盘组织，置于甲醛中固定，脱钙完成后石蜡包埋切片，厚度为5 μm，进行苏木精-伊红染色与番红O-固绿染色，评估椎间盘组织结构改变[28]。采用Masuda方法进行组织学分级[29]，评分最低4分，为正常椎间盘；最高12分，为严重退变椎间盘。

免疫组化分析：通过免疫组化染色评估肿瘤坏死因子α、Ⅱ型胶原在大鼠椎间盘内的改变。上述切片经抗原修复后，置于过氧化氢溶液中室温避光孵育，PBS清洗后置于3%BSA溶液中封闭处理。加入相应一抗(兔抗大鼠肿瘤坏死因子α抗体、兔抗大鼠Ⅱ型胶原抗体，1∶200稀释)室温孵育，PBS清洗后加入HRP标记的特异性二抗(1∶200稀释)室温孵育。加入显色剂进行显色后充分清洗，复染，封固，干燥后于显微镜下采集图片，分析比较单位面积内阳性染色细胞数量及阳性染色面积率。
1.5   主要观察指标   缓释微球的细胞相容性、对氧化应激环境下髓核细胞炎症因子表达的影响，以及缓释微球用于椎间盘退变模型的效果。
1.6   统计学分析   数据结果以x±s表示。采用SPSS 20.0及Origin 9.1软件进行统计分析及绘图。采用单因素方差分析比较组间差异，P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经苏州大学附属第一医院生物统计学专家审核。

姜黄素是从中国传统中药材姜黄中提取的一种天然多酚，含有多种活性基团[32]，药理作用广泛。相较于骨形态发生蛋白等细胞因子，姜黄素提取成本低、分子质量小易于渗透、生物安全性高[33]，然而其水溶性小、生物半衰期短等局限性限制了姜黄素的应用，随着药物递送领域的进步，研究人员提出了化学修饰、脂质体包封、纳米载体递送等策略[34]。此次实验选择合成姜黄素-葡聚糖-牛血清白蛋白纳米粒，葡聚糖枝接至牛血清白蛋白上提供了足够的空间位阻，相较于游离姜黄素及姜黄素-蛋白纳米粒其稳定性和抗氧化活性得到提升[13]。进一步通过微流控技术制备载姜黄素纳米粒的甲基丙烯酸酰化明胶微球，将姜黄素纳米粒固定于甲基丙烯酸酰化明胶微凝胶基质网络中，微凝胶的物理屏障作用有效避免了姜黄素的突释。随着缓释微球从表面至内部的缓慢降解过程[17]，包裹于水凝胶基质中的姜黄素也随之释放，药物释放曲线和微球体外降解曲线也印证了这一过程。

既往有研究人员选择通过灌胃、腹腔注射的方式研究药物对椎间盘的疗效[35]，然而口服与腹腔注射均存在生物利用率低、不良反应大、难以在椎间盘内形成有效药物浓度的问题。此次实验选择将缓释微球通过微量注射器微创注射至退变部位，在椎间盘组织内形成有效治疗浓度，靶点明确并提高了姜黄素的利用率。生物材料直接植入可能会造成局部炎症及免疫反应，如乳酸/羟基乙酸共聚物制备的微球降解后产生的酸性产物会降低细胞外基质pH值，诱导炎症导致细胞凋亡[36]。此次实验选用的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶富含利于细胞黏附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列及可降解的MMP序列[37]，可模拟髓核细胞外基质成分，且降解产物无毒性、抗原性低[14]。缓释微球冻干后表面形成多孔结构，接触面积显著提升，可为椎间盘组织修复提供三维立体微环境。在CCK-8实验和活/死染色中，髓核细胞与缓释微球共培养后生长情况良好，细胞在微球表面均匀生长，证实了缓释微球具有良好的生物相容性。

在H2O2诱导的氧化应激环境下，姜黄素缓释微球能显著抑制髓核细胞的凋亡，通过qRT-PCR进一步研究缓释微球在基因水平上的调控作用，H2O2诱导的氧化应激条件使髓核细胞过表达肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6炎症因子及基质金属蛋白酶3，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达受到抑制，而姜黄素缓释微球可抑制上述条件下髓核细胞过表达炎症因子，下调基质金属蛋白酶3基因表达，上调Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因表达。选取大鼠尾椎穿刺退变模型进一步评估缓释微球的治疗效果[38]，在注射载姜黄素缓释微球治疗4周后，DHI%、MRI评分、组织学评分及免疫组化结果较退变组均有明显改善；而未载药微球组4周后的影像学与组织学评估较退变组无明显差异，由此可见未载药微球对于退变的椎间盘组织无明确治疗效果。姜黄素组的椎间隙高度及MRI评分在第1周时较退变组和未载药微球组虽有一定程度改善，但在第4周时其影像学与组织学评估均显著差于缓释微球治疗组，说明单纯的姜黄素溶液在短时间内尚能发挥一定的治疗作用，但由于缺乏糖蛋白的稳定作用以及水凝胶微球的包裹，普通姜黄素溶液难以实现理想的治疗效果。

对于姜黄素延缓椎间盘退变的机制，有研究表明姜黄素对核因子κB、MAPK、AP-1、JAK/STAT等信号通路具有调控作用[39]，并能抑制炎症递质的产生[40]。此次实验通过qRT-PCR及免疫组化染色证实，姜黄素对于肿瘤坏死因子α等炎症因子具有抑制作用。肿瘤坏死因子α作为一种多效细胞因子，具有强大的促炎、诱导凋亡作用[41]，在退变的椎间盘组织中肿瘤坏死因子α水平呈上升趋势[42]。大量研究证实，肿瘤坏死因子α通过核因子κB通路加速髓核细胞外基质降解[43]，加快椎间盘退变进程。而姜黄素通过降低上游激酶IKKβ及核因子κB复合物中p65的磷酸化，抑制IκBα蛋白酶体的降解，从而抑制核因子κB信号通路的激活，达到延缓椎间盘退变的目的。此外，KLAWITTER等[31]通过体外髓核细胞实验证实，姜黄素通过下调TLR2表达并抑制MAP激酶JNK来抑制MAPK通路的作用，显著降低了髓核细胞表达促炎因子和基质降解酶的水平，这与此次实验qRT-PCR检测结果一致。

实验尚存在一些不足之处：尽管大鼠椎间盘针刺退变模型已被广泛应用[44]，但因种属不同，其与人椎间盘退变的病理过程仍存在一定差异；另外，实验仅初步探讨了姜黄素缓释微球延缓椎间盘退变进程的疗效，没有深入研究姜黄素延缓组织退变的分子机制，这也将是下一步研究的重点。

综上所述，姜黄素缓释微球可抑制椎间盘组织中肿瘤坏死因子α等炎性因子的表达、上调Ⅱ型胶原蛋白的表达，并最终延缓大鼠椎间盘组织退变进程，为椎间盘退变的治疗提供了有效策略。所使用的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶微球负载纳米颗粒体系也可作为药物缓释系统，实现其他疏水性药物有效递送。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
微球：是用特定材料如明胶、聚乳酸、蛋白制备的微小球状分散体系的统称，其作为一种组织工程学载体可用以负载药物、因子在特定部位实现缓释，达到治疗目的。
姜黄素：是从传统中药材姜黄中提取的一种二酮类化合物，其分子中含有羟基、羰基等活性基团，被证实具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用，生物安全性高，应用前景广阔。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

此次实验构建出的载姜黄素缓释水凝胶微球，具有良好的生物相容性和药物缓释性能。体外能够有效地下调炎症因子的表达及抑制氧化应激环境下的细胞凋亡，体内动物实验验证了缓释微球具有延缓椎间盘退变进程的作用，为治疗椎间盘退变提供了新的策略。姜黄素作为中国传统药材姜黄的提取物，药理作用广泛，然而水溶性小、稳定性差等局限性限制了药物的应用，缓释微球体系也为姜黄素等疏水性药物的靶向递送提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

	阅读次数
	全文
	摘要