2.1   骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定结果   显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态，见图1A，细胞呈梭形或纺锤形。为了评价骨髓间充质干细胞的多向分化潜能，对骨髓间充质干细胞进行了成脂、成骨诱导，对细胞进行成脂培养基诱导后的油红染色结果，见图1B，有脂滴形成，说明骨髓间充质干细胞被成功诱导为脂肪细胞。对细胞进行成骨培养基诱导后的茜素红染色结果，见图1C，有钙结节形成，说明骨髓间充质干细胞被成功诱导为骨细胞，证明了骨髓间充质干细胞具有多向分化能力。



2.2   负载姜黄素的纳米细胞囊泡的表征   在透射电镜下纳米细胞囊泡呈杯状，具有双层膜结构，见图2A。纳米细胞囊泡直径主要在30-200 nm之间，峰值为146.2 nm，见图2B。纳米细胞囊泡的电位在-1至-30 mV之间，峰值为-24.5 mV，见图2C。



2.3   负载姜黄素的纳米细胞囊泡的包封率和载药率    首先，制作了姜黄素在甲醇溶液中的标准曲线，标准曲线拟合度达到99%以上。用甲醇溶解负载姜黄素的纳米细胞囊泡后做了连续7 d的吸光度值检测，发现纳米细胞囊泡中的姜黄素在24 h后就已完全溶解在甲醇中，所以应用24 h时姜黄素在甲醇中的浓度，根据标准曲线计算出姜黄素的量，根据公式计算出纳米细胞囊泡中姜黄素包封率为42%。通过BCA法测得纳米细胞囊泡的质量浓度为0.8 g/L。根据载药率公式计算出纳米细胞囊泡的姜黄素载药率为2.3%。
2.4   纳米细胞囊泡对NIH-3T3细胞增殖、迁移的影响   不同质量浓度纳米细胞囊泡对 NIH-3T3细胞增殖的影响，见图3A，实验结果显示，纳米细胞囊泡的质量浓度在10-80 mg/L时均可促进NIH-3T3细胞的增殖，其最佳作用质量浓度为40 mg/L。因此选择40 mg/L的纳米细胞囊泡继续后续实验。

为了研究纳米细胞囊泡是否影响NIH-3T3细胞的迁移能力，进行了Transwell实验。细胞迁移实验结果，见图3B，C，24 h时实验组(纳米囊泡组)的细胞迁移数量明显高于对照组。



2.5   姜黄素抗炎作用分析   如图4所示，脂多糖刺激巨噬细胞后，肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的mRNA表达明显升高，提示脂多糖诱导巨噬细胞炎症增强；用姜黄素处理脂多糖刺激的巨噬细胞时，肿瘤坏死因子α和白细胞介素6 的mRNA表达水平显著下调，说明姜黄素降低了脂多糖刺激的巨噬细胞的炎症反应。



2.6   负载姜黄素的纳米细胞囊泡对糖尿病小鼠创面愈合的影响
2.6.1   实验动物数量分析   各组小鼠在术后未出现死亡及创面感染情况，24只小鼠全部进入结果分析。
2.6.2   创面愈合大体观察结果   见图5。

B、C、D组造模后14 d的创面面积显著减小，其中D组第14天的创面完全闭合，A组创面面积减小不如其他3组，见表1。这表明负载姜黄素的纳米细胞囊泡可发挥纳米细胞囊泡和姜黄素的协同作用，加速创面愈合进程。



2.6.3   病理观察创面组织学变化   通过苏木精-伊红染色来评估负载姜黄素的纳米细胞囊泡的创面愈合过程中病理学变化，见图6a。A组在创面造模后第7天的肉芽组织较少，而其他3组的创面具有丰富的肉芽组织形成，其中以D组最多；各组创面长度也有显著差异，见图6c。其中D组中最短，其次分别是B、C、A组。创面造模后第14天，4组创面处肉芽组织较第7 天均有不同程度的增多，其中以D组最多，见图6d；尽管与第7天相比，4组的创面长度均有明显减少，但相比于其他组，D组创面长度最短。

适当的胶原蛋白沉积和重塑可以提高组织的抗张强度，并产生更好的愈合效果[25]。各组创面Masson染色结果，见图6b。创面造模后第7天，B、C、D组创面显示出丰富的胶原纤维，并且胶原纤维的数量随愈合时间的增加而增加，尤其是D组，A组创面处的胶原沉积较少。创面造模后第14天，4组创面都有显示出比第7天时更致密且丰富的胶原纤维沉积，其中以D组效果最好。Masson染色结果提示，负载姜黄素的纳米细胞囊泡可以改善胶原蛋白在创面部位的沉积，从而加速皮肤再生。



2.7   纳米细胞囊泡的生物相容性   由细胞增殖实验与动物创面组织学形态观察可知，纳米细胞囊泡具有良好的生物相容性。

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糖尿病是一类以慢性高血糖症状为主要特征的代谢性疾病[1]，目前糖尿病已成为世界范围内造成死亡和残疾的重要原因。据国际糖尿病联盟(IDF)统计，截止到 2021年每10 个20-79岁的成年人中就有1名糖尿病患者，糖尿病总人数达5.37 亿，此外，糖尿病患者数还在逐年增加[2]。目前，中国已经成为糖尿病的高发国家，全球每4个糖尿病患者中就有一个中国人。长期高糖会导致包括难愈合创面等多种并发症的发生，糖尿病难愈合创面已成为截肢的重要原因[3-4]。

细胞工程的出现为糖尿病创面愈合提供了新的思路。间充质干细胞是一类具有无限复制潜力和体外分化为中胚层组织成熟细胞能力的细胞，其治疗潜力主要与其抑制炎症和启动组织再生的能力有关[5-6]。此外，间充质干细胞还具有募集细胞并释放生长因子和蛋白质的能力，因此具有治愈创面的巨大潜力。然而，在以往的皮肤创面愈合研究中，都是将干细胞局部移植到创面或创面周围，存在着干细胞存活率低、细胞去向不可预测、细胞滞留率低、移植后移植率低等局限性[7]。最近的研究也表明，来自间充质干细胞的外泌体(Exo)具有促进损伤组织伤口修复和再生的潜力[8]。外泌体是一类细胞释放的直径40-150 nm的纳米细胞囊泡，其可作为细胞间通讯的媒介，有效传递DNA、RNA、microRNA (miRNA)和蛋白质等功能生物分子[9]。外泌体具有免疫耐受性，与它们所源自的细胞具有相似的生物学功能，因此来源于间充质干细胞的外泌体可以用作间充质干细胞治疗的可能替代方法[10]。外泌体在糖尿病创面治疗中已展现出了广阔的应用前景[11-12]，Guo等[13]报道称富含血小板血浆的外泌体可通过激活YAP促进慢性皮肤创面的愈合。

但外泌体的应用存在很大的障碍，主要是因为它们产率低，且纯化较为困难。针对外泌体存在的问题，jiang等[14]开发了一种生物工程和生物转染的细胞衍生纳米载体——拟外泌体纳米细胞囊泡，其在大小、形态和蛋白质含量等方面具有与外泌体相似的特征，但其产量却高出外泌体100倍。纳米细胞囊泡是一种模拟外泌体的细胞纳米囊泡，是一种很有潜力的纳米载体，具有以下优点，包括体内循环时间长、粒径小、包封药物种类多(疏水药物、多肽和核酸)和可持续释放药物等[15]。

姜黄素[1，7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1，6-庚二烯-3，5-二酮]是一类从姜黄根茎中提取的草本多酚类化合物，具有抗感染、抗炎和抗氧化的特性，因此被认为是潜在的创面愈合剂[16-18]。姜黄素可通过促进肉芽组织形成、组织重塑和胶原蛋白沉积来促进创面愈合[19]，但姜黄素也存在结构相对不稳定、溶解性差、可快速消除等问题，严重制约了其在临床上的应用[20-21]。

因此，此次实验采用骨髓间充质干细胞来源的纳米细胞囊泡负载姜黄素，探查了骨髓间充质干细胞来源的纳米细胞囊泡对成纤维细胞增殖、迁移的作用，验证了姜黄素的抗炎作用，评估了负载姜黄素的纳米细胞囊泡对糖尿病小鼠模型皮肤创面的促愈合能力，为慢性创面的创伤修复提供了一种新的治疗方法和视角。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   随机对照实验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用Tukey多重检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年9月至2021年10月在牡丹江医学院医药研究中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验细胞   成纤维细胞NIH-3T3和RAW 264.7巨噬细胞购于上海酶研生物科技有限公司。
1.3.2   实验动物   0-3 d内C57BL/6J乳鼠，SPF级，用于骨髓间充质干细胞原代细胞培养；雄性C57BL/6J小鼠，SPF级，七八周龄，体质量约20 g，用于制备糖尿病创面模型，小鼠均购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001，饲养于牡丹江医学院比较医学中心。
1.3.3   药物与试剂   姜黄素购于北京索莱宝科技有限公司；Ⅰ型胶原酶购于美国Worthington公司；聚碳酸酯膜购于德国whatman公司；骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基、骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基购于赛业公司；干细胞培养基购于加拿大STEMCELL公司；DMEM 高糖培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；肿瘤坏死因子α及白细胞介素6引物、β-actin 引物购于上海生工生物工程公司；mRNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒均购于美国Omega公司；异氟烷购于深圳瑞沃德公司。
1.3.4   实验仪器   微型挤出机购于美国Avanti公司；酶标仪购于美国Molecular Devices 公司。
1.4   实验方法   
1.4.1   骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定   参考文献中骨髓间充质干细胞的提取方法[22]。以异氟烷呼吸麻醉处死乳鼠，无菌环境下取下乳鼠四肢股骨和胫骨剪碎，置于配置好的Ⅰ型胶原酶中，200 r/min 震荡1 h后300×g离心10 min。取离心后沉淀，用干细胞完全培养基重悬并接种于T75培养瓶中，置于CO2细胞培养箱中培养，两三天后换液，并在显微镜下观察细胞的形态和生长情况。当细胞生长达到80%-90%融合度时，用0.25%胰酶进行消化，以1∶2传代。取第3代细胞，应用间充质干细胞诱导分化培养基在体外进行为期28 d的成脂诱导和成骨诱导，最后分别进行油红染色和茜素红染色，从而证明骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能。
1.4.2   纳米细胞囊泡及负载姜黄素纳米细胞囊泡的制备   参考文献中的纳米细胞囊泡制备方法[23]。将第3代间充质干细胞消化于15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，使用PBS(pH=7.4)或者姜黄素溶液(10 µmol/L)重新悬浮细胞[24]，使用微型挤出机依次通过5，1，0.2 μm聚碳酸酯膜，每种膜均挤压15次细胞悬浮液，最终挤压样品在室温下10 000×g离心10 min，除去细胞碎片，用100 kD离心过滤器在室温下1 000×g离心15 min，纯化和浓缩纳米细胞囊泡，离心后用等量的PBS重悬纳米细胞囊泡，重复3次。最终样品储存在-80 ℃。纳米细胞囊泡的质量浓度用BCA蛋白检测试剂盒测定，纳米细胞囊泡的大小由马尔文动态光散射仪进行分析，使用透射电镜进一步观察纳米细胞囊泡的形貌。
1.4.3   负载姜黄素的纳米细胞囊泡的包封率和载药率   用甲醇将50 µL的负载姜黄素的纳米细胞囊泡溶液稀释至1 mL，以溶解囊泡；取其中150 µL放入96孔板，用酶标仪在波长434 nm下测每组姜黄素在0，1，2，3，4，5，6，7 d下的吸光度值。根据甲醇溶液中姜黄素标准曲线得到的回归方程，由吸光度值计算出各组中姜黄素的浓度。

包封率=包封姜黄素的量/总姜黄素的量×100%

载药率=包封姜黄素的量/总囊泡的量×100%
1.4.4   纳米细胞囊泡的体外评价

细胞计数法检测纳米细胞囊泡对成纤维细胞增殖的影响：取处于对数生长期的NIH-3T3细胞，在6孔板中以1×105/孔的密度接种。待细胞贴壁后，分别加入PBS及10，20，40，80 mg/L的纳米细胞囊泡，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。24 h后用0.25%胰酶消化细胞并进行细胞计数。每组取3个孔的均值，最后绘制柱形图。

Transwell实验检测纳米细胞囊泡对成纤维细胞迁移能力的影响：取处于对数生长期的NIH-3T3细胞，用0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液；1 000 r/min离心5 min，弃上清，用无血清的DMEM高糖培养基调整细胞浓度为2.5×108 L-1。在Transwell上室内加入200 μL细胞悬液，随后分别加入纳米细胞囊泡(实验组)和与纳米细胞囊泡等量的PBS(对照组)，其中纳米细胞囊泡的质量浓度为40 mg/L；在Transwell下室加入750 μL含血清的DMEM高糖培养基，常规培养24 h后去除上室的旧培养基，以PBS清洗2次；用40 g/L甲醛固定20 min，去除甲醛溶液后以PBS清洗2次；将上室浸泡在结晶紫染液避光15 min，去除结晶紫染液后以PBS清洗2次；用湿棉棒小心擦去上室内侧底膜表面上的细胞，在显微镜下随机取视野计数。
1.4.5   姜黄素的抗炎作用分析   取处于对数生长期的RAW 264.7巨噬细胞，在6孔板中以5×105/孔的密度接种。待细胞贴壁后，分别用脂多糖(100 μg/L)、脂多糖+姜黄素(10 μmol/L)刺激细胞，未经脂多糖处理的细胞作为对照。孵育24 h后，以PBS洗涤细胞，按照生产厂家的说明用RNA提取试剂盒提取总RNA。用260 nm和280 nm处的吸光度值测定所提取的总RNA的浓度和质量。然后将每个样本的总RNA反转录为cDNA。最后进行实时定量PCR(RT-qPCR)。以β-actin作为内源性参照基因进行归一化。用ΔΔCT法计算与对照组的相对基因表达。

实验中使用的引物序列如下：肿瘤坏死因子α：5'-CCC TCA CAC TCA GAT CAT CTT CT-3'和5'-GCT ACG ACG TGG GCT ACA G-3'；白细胞介素6：5'-CTC CCA ACA GAC CTG TCT ATA C-3'和5'-CCA TTG CAC AAC TCT TTT CTC A-3'；β-actin：5'-CTT TGC AGC TCC TTC GTT GC-3'和5'-ACG ATG GAG GGG AAT ACA GC-3'。
1.4.6   负载姜黄素的纳米细胞囊泡的体内评价  

构建糖尿病小鼠模型：取七八周龄雄性C57BL/6J小鼠24只，禁食12 h后，腹腔注射链脲佐菌素(100 mg/kg)，连续注射2 d。2周后用全自动血糖监测仪测定血糖，当连续2 d的血糖水平> 16.7 mmol/L定义为糖尿病小鼠造模成功。

构建糖尿病小鼠创面模型及给药：糖尿病造模成功后制作创面模型，以异氟烷呼吸麻醉小鼠，在其背部应用打孔器制造2个直径6 mm的对称创面。创面造模后随机分为4组干预，A组注射100 μL的 PBS，B组注射100 μL的纳米细胞囊泡(40 mg/L)，C组注射100 μL的姜黄素溶液(0.5 μmol/L)，D组注射100 μL负载姜黄素的纳米细胞囊泡，每组6只。每只小鼠单笼饲养，便于长期创面观察。

创面大体形态及愈合率的观察：每天观察小鼠创面恢复情况，直到创面完全愈合为止。于第0，7，14天测量创面面积，用ImageJ软件计算创面愈合率。

创面愈合率=(初始创面面积-各时间点创面面积)/初始创面面积。

病理观察创面组织形态学变化：创面造模后第7，14天，每组取3只小鼠，取创面及其边缘组织，固定于40 g/L多聚甲醛溶液中24 h后脱水包埋，包埋后进行石蜡切片，切片厚度为5 μm，利用苏木精-伊红染色和Masson染色对创面及其边缘组织进行病理学观察。通过大体看出创面区域，用虚线框出，并用imageJ软件计算创面长度。
1.5   主要观察指标   纳米细胞囊泡对NIH-3T3细胞增殖、迁移的影响，姜黄素的抗炎作用。各组小鼠创面愈合情况。
1.6   统计学分析   使用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析及相关图片的绘制。来自3个单独实验的数据表示为x±s。两组间比较采用t检验，多组间比较采用Tukey多重检验，P < 0.05被认为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过牡丹江医学院统计学专家审核。

糖尿病创面愈合是炎性细胞、修复细胞、细胞因子等多因素调控的复杂过程，任一环节的异常均可导致创面难愈合[26]。目前对于糖尿病创面的常规临床治疗包括血糖控制、清创、药物治疗、手术治疗、中医治疗等[27]，另外新式疗法包括局部应用血小板衍生的生长因子、细胞外基质、再生干细胞疗法等，但创面愈合效果仍然不佳[28]。研究表明，以干细胞产物和姜黄素为基础的治疗可降低截肢率并减轻糖尿病的社会医疗负担[29-30]。创面愈合是一个复杂且动态的过程，需要多种类型的细胞来参与愈合的各个阶段。成纤维细胞是皮肤创面愈合的主要目标细胞和效应细胞，其主要与肉芽组织形成有关[31-32]，在愈合过程中可与周围的角质形成细胞和胶原蛋白相互作用。此次实验首先制备了来源于骨髓间充质干细胞的纳米细胞囊泡，将其作用于NIH-3T3细胞(成纤维细胞类型)进行体外测试，以确定纳米细胞囊泡对NIH-3T3细胞的增殖和迁移的作用，继而又验证了姜黄素的抗炎作用。在体内实验中，将姜黄素负载于纳米细胞囊泡后应用于糖尿病小鼠皮肤损伤模型中，结果显示其有效提高了创面愈合速率。

目前对于创面愈合研究许多集中在干细胞疗法上。间充质干细胞具有可分化为各种皮肤细胞、发挥免疫调节、促血管生成、抗氧化、抗凋亡等作用，这使其成为许多皮肤创伤愈合的一种治疗工具[33]。然而，尽管间充质干细胞可以在体外规定的条件下分化成各种体细胞，但它们很少在移植后转化为靶细胞。同时，移植的间充质干细胞会随着恶劣的微环境而发生凋亡或衰老，致使可用的功能干细胞数量有限，影响治疗效果[34-35]。此外，干细胞移植受免疫排斥、致瘤性和伦理问题的限制，导致干细胞疗法在临床上未得到广泛使用[36]。最近大量研究表明，间充质干细胞的治疗作用主要是通过其 旁分泌发挥作用[37]，其中外泌体作为干细胞的关键旁分泌因子，外泌体比细胞更小，不复杂，免疫原性更低，生物相容性更强，应用更安全，外泌体还可调节靶细胞在伤口愈合中的功能；同时，外泌体的质量更可控，更稳定，且外泌体生产、储存和运输更方便。Zhang等[38]的研究发现，脂肪源性干细胞来源的外泌体可加速成纤维细胞的增殖和迁移，并通过PI3K/Akt途径加速胶原蛋白积累，从而加速皮肤创面愈合。外泌体可以调节靶细胞在创面愈合中的功能,但大多数哺乳动物细胞分泌的外泌体较少，且提纯工艺复杂，难以大规模生产。而拟外泌体纳米细胞囊泡是通过挤出机连续挤压而生成的一种与外泌体在大小、形态和功能上相似的纳米级囊泡，且具有产量高、制备过程简单等优势[39]，这有助于构建用于药物输送系统的工程化细胞囊泡[40]。

Wang等[25]采用脂肪间充质干细胞来源的外泌体促进慢性创面愈合，结果显示其外泌体在21 d时明显促进创面愈合。此次实验的创面愈合效果较Wang等的更好，愈合效率更快，在14 d时负载姜黄素的纳米细胞囊泡组的愈合率达到80%以上。另外研究发现，姜黄素可有效减轻巨噬细胞介导的炎症并促进肉芽组织形成，显著促进小鼠创面愈合[41-43]，此次实验结果与之相似，结果显示姜黄素减轻了炎症因子的表达，且促进了创面愈合。采用纳米细胞囊泡负载姜黄素后纳米细胞囊泡与姜黄素发挥了协同效应，进一步增强了创面愈合效果。

此次实验应用了纳米细胞囊泡包封姜黄素来治疗糖尿病创面，纳米细胞囊泡可促进NIH-3T3细胞的增殖和迁移，姜黄素发挥抗炎作用，二者联合治疗糖尿病创面的效果高于各自单独使用的效果。但纳米细胞囊泡在充分发挥新兴市场潜力之前，仍有许多挑战需要克服。纳米细胞囊泡可以负载药物，但是如何高效装载药物仍是目前面临的一个挑战[44]。此外，与外泌体相比，没有关于模拟外泌体纳米囊泡的整体安全性、全身免疫反应和有效性的综合研究，这需要进一步探究[34]。因此，下一步将对负载姜黄素的纳米细胞囊泡促进糖尿病创面愈合的具体分子机制以及纳米细胞囊泡的安全性等问题做进一步探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
姜黄素：是一类从姜黄根茎中提取的草本多酚类化合物，具有抗感染、抗炎和抗氧化的特性，被认为是潜在的创面愈合剂，可通过抗炎作用、促进肉芽组织形成及组织重塑和胶原蛋白沉积来促进创面愈合。
纳米细胞囊泡：是一种模拟外泌体的细胞纳米囊泡，具有与外泌体相似的特征，但其产量却高出外泌体100倍，是一种很有潜力的纳米载体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

此研究主要采用间充质干细胞与姜黄素来协同治疗糖尿病创面。间充质干细胞在皮肤创伤修复中主要通过分泌生物活性分子来发挥作用，其中外泌体作为细胞外囊泡的一种，在糖尿病创面的治疗中广泛应用，但外泌体存在提取、分离、纯化困难等问题。鉴于此，作者制备了一种与外泌体具有相似功能的纳米细胞囊泡，并负载姜黄素来协同治疗小鼠糖尿病创面，研究结果表明创面愈合效率高于单独使用二者，为糖尿病创面治疗提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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