存储7，14 d后，纳米粒的大小未见明显改变；纳米粒中IR780的包封率约为93.47%、载药量约为4.20%，RGX104的包封率为84.30%，载药量约为6.68%。
2.2   纳米粒中RGX104药物的释放结果   激光辐照后，PLGA-IR780-RGX104纳米粒中的RGX104释放速率加快，24 h累积释放率达到52.17%；相比之下，无激光照射的PLGA-IR780-RGX104纳米粒中RGX104释放缓慢，24 h累积释放率仅为24.09%，见图3。该结果表明，激光辐照可以加速PLGA-IR780-RGX104纳米粒中RGX104的释放。



2.3   纳米粒的细胞吞噬实验结果    见图4。

激光共聚焦显微镜下可见DiI标记的PLGA-IR780-RGX104纳米粒呈红色，DAPI标记的4T1细胞核、人脐静脉内皮细胞核、巨噬细胞核均呈蓝色。红染的纳米粒进入3种细胞内，随着时间的推移，进入细胞的纳米粒逐渐增多，在3 h时大量纳米粒进入3种细胞内。
2.4   纳米粒的体外光声显像结果   生理盐水与 PLGA-RGX104纳米粒双蒸水溶液几乎检测不到光声信号，而PLGA-IR780-RGX104纳米粒双蒸水溶液可检测到较强的光声信号；随着PLGA-IR780-RGX104纳米粒双蒸水溶液质量浓度的增加，光声信号增强，对应的光声值升高，见图5。



2.5   纳米粒的光热转换性能监测结果   相同激光能量照射后，PLGA-IR780-RGX104纳米粒溶液不同质量浓度分组均快速升温，180 s后趋于稳定，且纳米粒溶液质量浓度越高温度上升速度越快，而对照组照射5 min始终未见温度上升；以不同激光能量照射纳米粒溶液后，纳米粒溶液均快速升温，各组温度均在180 s后趋于稳定，且其照射能量越大纳米粒溶液温度上升速度越快，见图6。



2.6   纳米粒的细胞毒性实验结果   随着纳米粒质量浓度的增加，PLGA-RGX104-IR780+激光照射组细胞存活率依次减低，且明显低于相同质量浓度下其余4组(P均< 0.000 1)；PBS组、PBS+激光照射组、PLGA-RGX104-IR780组、PLGA-RGX104+激光照射组的细胞存活率均较高，4组间两两比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图7。



2.7   体外骨髓源性抑制细胞分化实验结果   PBS组骨髓源性抑制细胞数量多于无4T1细胞组(P < 0.000 1)；PLGA-IR780+激光照射组与PLGA-IR780-RGX104组骨髓源性抑制细胞数量少于PBS组(P均< 0.05)；PLGA-IR780-RGX104+激光照射组骨髓源性抑制细胞数量少于PBS组(P < 0.000 1)，其减少程度明显大于PLGA-IR780+激光照射组、PLGA-IR780-RGX104组(P均< 0.000 1)，且与游离RGX104组及无4T1细胞组水平相当(P > 0.05)，见图8。

乳腺癌发病率逐年上升，严重危害着全球女性的身心健康[1]。在诊断方面，乳腺癌具有早期发病隐匿、常规影像学检查诊断困难的特点[2]，因此提高对乳腺癌的早期准确诊断十分重要。最新研究表明，光声显像技术具有无创、高分辨率、高对比度、高灵敏度等诸多优势，其与纳米递药系统相结合可在分子水平实现对肿瘤的早期监测[3-5]。在治疗方面，单一的治疗方式如手术、化疗、放疗等均具有明显的局限性[6-8]。与单一疗法相比，多种疗法的联合使用则具有优势互补的特点，显示出更强大的抗肿瘤效果[9-11]。其中，光热治疗与免疫治疗的联合引起了人们极大的兴趣，其不但具有保持光热治疗特异性高、创伤小且并发症少等优点，又可改善免疫治疗非靶点不良反应、免疫刺激不足、免疫制剂在循环过程中生物活性丧失等问题[12-14]。另外，免疫治疗还可以弥补光热治疗激活免疫应答反应受限制的不足之处，发挥协同治疗作用[15-18]。

因此，此次实验拟制备一种载有光热材料和免疫治疗剂的新型多功能靶向纳米粒PLGA-IR780-RGX104，以实现光声显像对乳腺癌的早期监测，同时通过光热治疗与免疫治疗的协同作用实现对乳腺癌更精准、更高效的治疗。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   体外观察实验，细胞学实验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年9月至2021年9月在重庆医科大学超声影像学研究所完成。
1.3   材料
1.3.1   细胞   小鼠乳腺癌细胞4T1、脐静脉内皮细胞、巨噬细胞，均由重庆医科大学超声影像学研究所提供。
1.3.2   实验动物   雌性babl/c小鼠1只，8周龄，体质量22 g，由重庆医科大学动物实验中心提供，用于骨髓细胞的分离培养。
1.3.3   实验试剂   近红外染料IR780、LXR激动剂(RGX104)(美国 Sigma)；聚乙二醇修饰的乳酸羟基乙酸共聚物(西安瑞禧生物科技有限公司)；CCK8细胞增殖检测试剂盒(日本同仁生物有限公司)；FITC抗小鼠Gr-1和PE抗小鼠CD11b抗体(英国 Abcam)。
1.3.4   实验仪器   声振仪(美国 Sonics)；808 nm激光仪(西安中川光电科技有限公司)；Malvern粒径仪(美国Malvern)；透射电镜(H7500，日本Hitachi)；扫描电镜(S-3400N，日本Hitachi)；激光共聚焦显微镜(A1R，日本Nikon)；光声成像仪(Vevo LAZR，加拿大Visual Sonics)；流式细胞仪(FACS Vantage，美国Becton Dickinson)；紫外分光光度计(UV-23600，日本Shimadzu)；高效液相色谱仪(LC-2010A HT，日本Shimadzu)。
1.4   实验方法   
1.4.1   PLGA-IR780-RGX104纳米粒的制备   ①取50 mg聚乙二醇修饰的乳酸羟基乙酸共聚物、3.5 mg RGX104和2 mg IR780于50 mL试管中，加入二氯甲烷2 mL充分溶解，使用声震仪进行第一次声震2 min；②加入10 mL的4%聚乙烯醇，使用声震仪进行第二次声震2 min；③加入10 mL的2%异丙醇至上述乳化完成后的混合液中，放入磁珠，置于磁力搅拌器搅拌2 h，充分挥发二氯甲烷；④用去离子水洗涤、10 000 r/min 离心5 min，离心3次，弃去上清，收集沉淀，得到PLGA-IR780-RGX104纳米粒。用类似的方法制备了PLGA-RGX104纳米粒，制备的纳米粒均4 ℃保存。
1.4.2   纳米粒的理化性质、药物包封率及载药量的检测   应用透射电镜和扫描电镜分别观察PLGA-IR780-RGX104纳米粒的内部特征及外观形态；马尔文粒径仪检测其粒径、表面电位。将纳米粒存储在4 ℃冰箱，于7，14 d后用马尔文粒径仪再次观察检测其大小、稳定性。用紫外分光光度计和高效液相色谱仪分别检测PLGA-IR780-RGX104纳米粒中IR780和RGX104的包封率及载药量。

IR780包封率(%)=纳米粒中IR780质量/IR780投药量×100%

RGX104包封率(%)=纳米粒中RGX104质量/RGX104投药量×100%

IR780载药量(%)=纳米粒中IR780质量/纳米粒总质量×100%

RGX104载药量(%)=纳米粒中RGX104质量/纳米粒总质量×100%
1.4.3   纳米粒的RGX104药物释放   分别将5 mL的PLGA-IR780-RGX104纳米粒双蒸水溶液置于2个透析袋中，一个袋子激光辐照10 min(808 nm，1.5 W/cm2)，另一个袋子不做任何处理。然后，将2个透析袋置于含有透析缓冲溶液(含30%乙醇、0.02%叠氮钠、0.01%吐温-80)的圆底烧瓶中，在恒温振荡器(37 ℃，120 r/min)中连续摇动。在不同的时间点，分别取1 mL透析液于4 ℃冰箱保存备检，并加入1 mL透析缓冲液替换，利用高效液相色谱仪检测透析液中RGX104的量，并绘制累积释放曲线。
1.4.4   纳米粒的细胞吞噬实验   选择对数期生长的4T1细胞、脐静脉内皮细胞、巨噬细胞，分别以1×105 /孔的密度接种于共聚焦皿中，孵育24 h。将标记了DiI的PLGA-IR780-RGX104纳米粒分别加入到不同的共聚焦皿中，将纳米粒与各细胞共同孵育 1，2，3 h，去掉培养基，终止孵育，按以下步骤进行染色观察：用PBS洗3遍，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min；用PBS洗3遍，DAPI染细胞核15 min；用PBS清洗3遍，共聚焦显微镜下观察并采集图像。 
1.4.5   纳米粒的体外光声显像   取生理盐水、PLGA-RGX104纳米粒双蒸水溶液、PLGA-IR780-RGX104纳米粒双蒸水溶液，应用Vevo LAZR光声成像仪对各组行光声成像，记录光声值。将不质量同浓度(0.1，0.5，1，1.5，2 g/L)的PLGA-IR780-RGX104纳米粒双蒸水溶液加入琼脂凝胶模型中，置于光声成像仪上，以808 nm激光辐照各组样品，采集各组样品的光声图，测量光声信号强度，绘制浓度-光声强度曲线。
1.4.6   纳米粒的体外光热转换性能监测   ①将PLGA-IR780-RGX104纳米粒双蒸水溶液稀释成不同质量浓度(2，3，4，5 g/L)，加入到96孔板中，每孔100 μL，通过808 nm激光辐照(1.5 W/cm2，5 min)，使用近红外热成像仪记录温度变化。设置双蒸水为对照组。②选取4 g/L的PLGA-IR780-RGX104纳米粒双蒸水溶液，用808 nm激光仪在不同能量密度下(0.75，1，1.25，1.5，1.75 W/cm2)辐照5 min，使用近红外热成像仪记录温度变化。
1.4.7   纳米粒的细胞毒性实验   选择处于对数生长期的4T1细胞，以1×104 /孔密度接种于96孔板内，孵育24 h后，分5组处理：PBS组、PBS+激光照射组、PLGA-IR780-RGX104组、PLGA-RGX104+激光照射组、PLGA-IR780-RGX104+激光照射组，每组设置40，50，60，70，80 mg/L 5个质量浓度。

激光照射组在加入相应纳米粒组分后，进行808 nm激光辐照5 min(1.5 W/cm2)，继续培养。每组处理完毕，继续孵育24 h后，去除原始培养基，加入新鲜培养基，并每孔加入10 µL CCK8溶液，再放入恒温培养箱中孵育1 h，用酶标仪测定每孔在450 nm波长处的吸光度值。设定PBS组(对照)细胞生存率为100%，计算各实验组的细胞生存率。

细胞生存率(%)=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%，空白组没有细胞，对照组和实验组内有细胞。
1.4.8   体外骨髓源性抑制细胞分化实验  

骨髓细胞的分离培养：无菌条件下取出babl/c小鼠双侧股骨和胫骨，超净台中剪开干骺端，用5 mL无菌注射器抽取RPMI-1640培养液反复轻柔冲洗骨髓腔4次；100 μm细胞过滤器过滤后，1 200 r/min离心5 min，弃上清；加入无菌红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，在冰上裂解5 min，1 000 r/min离心5 min，弃红色上清以去除红细胞；用RPMI-1640培养液重悬沉淀洗涤2次，获得骨髓细胞悬液。

实验分组处理：用含有10 µg/L的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的RPMI-1640培养基重悬骨髓细胞，将重悬的骨髓细胞加入Transwell小室下室中培养，1×105/孔，同时将处于对数生长期的4T1细胞以1×104/孔的密度接种于Transwell小室上室中，共培养3 d后，分7组处理，分别为无4T1细胞组、PBS组、游离RGX104组、PLGA-IR780组、PLGA-IR780+激光照射组、PLGA-IR780-RGX104组、PLGA-IR780-RGX104+激光照射组，将不同分组的纳米粒加入到Transwell小室的上室中，激光照射组进行激光照射(808 nm，1.5 W/cm2，5 min)，放回孵箱继续培养。共培养第6天，收集骨髓细胞，加入FITC抗鼠Gr-1抗体和PE抗鼠CD11b抗体孵育40 min，随后对细胞进行洗涤，利用流式细胞仪检测细胞中骨髓源性抑制细胞的数量。Transwell小室实验示意图，见图1。

1.5   主要观察指标   PLGA-IR780-RGX104纳米粒的体外光声显像及光热联合免疫协同治疗乳腺癌的效果。

1.6   统计学分析   采用GraphPadPrism 8统计分析软件，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，两变量之间关系采用线性相关分析。P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经西南医科大学附属医院统计学老师刘军祥统计学工作者审核。

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一严重影响着患者的身心健康，改善乳腺癌患者预后的根本在于早期诊断和早期治疗[19]。基于纳米递药系统的光热治疗策略具有精确性高、稳定性佳、不良反应少等优势，它不仅可将光能转换为热能诱导肿瘤细胞坏死，实现肿瘤消融[20-21]；同时，还可通过刺激肿瘤细胞的免疫原性死亡，释放大量相关抗原触发适应性免疫应答，增强抗肿瘤治疗作用。然而，肿瘤微环境的免疫逃避机制会严重限制光热治疗激活的免疫应答反应[22-25]，从而降低其疗效，其中癌细胞通过募集骨髓源性抑制细胞将肿瘤微环境改变为高度免疫抑制状态，就是其实现免疫逃避的重要机制之一[26-28]。因此，调节肿瘤微环境中骨髓源性抑制细胞的活性成为提高光热治疗肿瘤效果的关键之一。最新研究表明，LXR激动剂激活LXR/ApoE轴可以直接抑制肿瘤微环境中骨髓源性抑制细胞的存活，增强肿瘤微环境局部T细胞抗肿瘤免疫反应，逆转免疫逃避[29-30]。因此，通过联合LXR/ApoE轴介导的免疫治疗与光热治疗，不仅可以充分发挥强大的光热治疗肿瘤作用，同时还可以弥补其激活免疫应答不足的局限性。

乳腺癌发病隐匿，早期诊断困难，患者常常错过最佳治疗时机。光声显像技术作为一种新兴的生物医学显像方式，具有无创、高分辨率、高对比度、高灵敏度等诸多优势，受到广泛关注。将光声显像技术与纳米递送系统相结合，可以在分子水平实现对乳腺癌的早期监测及靶向治疗，实现诊疗一体化[31-33]。基于此，课题组拟设计一种携载光热材料(具有光声显像功能)和LXR激动剂(RGX104)的新型多功能靶向纳米递送体系，期望实现光声显像引导下光热治疗联合免疫治疗协同抗乳腺癌的目的。

光热材料经历了从无机材料到有机材料的发展过程。与无机材料相比，以ICG为代表的有机材料具有成本低、毒性小、生物相容性高、近红外光吸收能力强等优点，在肿瘤诊疗一体化应用中具有巨大潜力[34-37]。而最新研究表明，IR780较ICG等其他有机材料展现出更多优势：首先，IR780的疏水性质决定了其更高的载药量和包封率；其次，IR780对多种肿瘤细胞线粒体具有主动靶向作用，不需要额外的靶配体的化学结合来进一步提高治疗效率；另外，IR780还具备极高的近红外光热转换效能和光声显像能力[38-40]。因此，IR780作为一种光热和光声材料，具有广阔的应用前景。

此次实验选择了IR780作为光热材料、LXR激动剂(RGX104)作为免疫治疗剂，构建了新型多功能靶向纳米粒PLGA-IR780-RGX104，其粒径约275 nm，呈具有核壳结构的球形，稳定性良好。此次实验以4T1细胞为模型细胞，对PLGA-IR780-RGX104纳米粒的体外抗肿瘤效果进行了评价。首先，肿瘤细胞对纳米粒的有效摄取对于成像和治疗至关重要，实验观察到PLGA-IR780-RGX104纳米粒以时间依赖的方式在肿瘤细胞内累积，这与IR780介导的肿瘤细胞线粒体靶向作用有关；另一方面，内皮细胞和巨噬细胞等间质细胞对纳米粒的有效摄取也一定程度上保障了LXR/ApoE轴的有效激活，也是实现免疫治疗的基础之一。其次，高光热转换效率是光热治疗的关键。IR780已被证明具有很强的近红外吸收和光热转换能力。此次体外光热转换实验结果显示，携载IR780的PLGA-IR780-RGX104纳米粒也具有较高的光热转换效率，在激光辐照下，纳米粒的温度随质量浓度和激光照射能量的增加而升高，随着纳米粒质量浓度的增加，温度甚至可以达到60 ℃，这足以实现有效杀死肿瘤细胞并激活肿瘤部位免疫应答反应的目的。另外，细胞毒性实验结果显示，PLGA-RGX104-IR780+激光照射组的细胞活性明显低于其余各治疗组，这表明该纳米粒能够发挥光热治疗作用有效地杀伤乳腺癌细胞。最后，为了改善肿瘤部位的免疫抑制微环境，此次实验使用了LXR激动剂(RGX104)来实现对肿瘤微环境中骨髓源性抑制细胞的消除。骨髓源性抑制细胞分化实验结果显示，当在骨髓细胞与4T1细胞共培养系统中加入PLGA-RGX104-IR780纳米粒并激光辐照时，该系统中骨髓源性抑制细胞数量较PBS组大幅度降低，与无4T1细胞组水平相当。这可能与在激光辐照下上室中RGX104大量释放有关，释放的RGX104与下室中内皮细胞、巨噬细胞等间质细胞结合并激活其胞内肝X受体，ApoE表达增加，最终实现了对肿瘤微环境中骨髓源性抑制细胞的靶向消除。此外，此次实验还验证了PLGA-IR780-RGX104纳米粒的体外光声显像效果，结果显示该纳米粒在激光辐照下可产生强烈的光声信号，且随着纳米粒质量浓度增加，信号逐渐增强，这为实现光声显像引导下乳腺癌的光热协同免疫治疗提供了可能。

综上所述，此次实验成功制备了PLGA-IR780-RGX104纳米粒，它既能通过IR780介导的光热治疗作用直接杀死乳腺癌肿瘤细胞，又能通过LXR激动剂(RGX104)激活的LXR/ApoE轴直接靶向和消除肿瘤微环境中的骨髓源性抑制细胞，逆转肿瘤免疫逃避，增强光热治疗的效果，同时还具备优异的光声显像能力，有望实现光声显像引导下乳腺癌的光热协同免疫治疗。因此，此次实验为乳腺癌的精准诊疗提供了一种新策略，但尚未评价该纳米粒在体内的寻靶能力和抗肿瘤治疗效果，有待进一步探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
骨髓来源抑制性细胞：在正常情况下，是树突状细胞、巨噬细胞和粒细胞的前体，能迅速分化为成熟的树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞，发挥正常免疫功能。在肿瘤、感染等其他病理条件下，受细胞因子的作用，这些髓系来源的前体细胞成熟受阻，停留在各个分化阶段，成为具有免疫抑制功能的骨髓来源抑制性细胞。骨髓来源抑制性细胞通过产生各种免疫抑制性分子抑制肿瘤微环境中的先天免疫和获得性免疫。
LXR激动剂：通过激活LXR/ApoE通路诱导骨髓来源抑制性细胞耗竭，增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活，引发强大的抗肿瘤免疫反应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

实验设计并制备了一种载有光热材料(IR780)和LXR激动剂(RGX104)的新型多功能靶向纳米粒。首先，此纳米粒可以通过光声显像功能实现对乳腺癌肿瘤部位的早期监测；其次，此纳米粒可以通过光热治疗实现对乳腺癌肿瘤部位的原位消融；最后联合免疫治疗激活LXR/ApoE通路，直接抑制肿瘤微环境中骨髓来源抑制性细胞的存活，增强肿瘤微环境局部T细胞抗肿瘤免疫反应，弥补光热治疗激活免疫应答反应不足的局限性，最终实现光声显像引导下光热疗法联合免疫疗法协同治疗乳腺癌的目的，为乳腺癌的治疗提供了新思路，具备广阔的发展前景。

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