无血清培养基和有血清培养基对背根神经节生长的差异

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2191

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (13): 2043-2048.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2191

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

无血清培养基和有血清培养基对背根神经节生长的差异

徐金辉1，秦绪祯1，张鸿程1，马艳霞2，齐士斌1，赛吉拉夫1，2

1苏州大学附属第一医院，江苏省苏州市 215000；2苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215000

收稿日期:2019-12-11 修回日期:2019-12-13 接受日期:2020-04-22 出版日期:2021-05-08 发布日期:2020-12-28
通讯作者: 赛吉拉夫，特聘教授，博士生导师，苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215000
作者简介:徐金辉，男，1993 年生，安徽省阜阳市人，汉族，在读硕士，主要从事神经再生基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81571189，81772353)，项目负责人：赛吉拉夫；国家重点研究开发项目(2016YFC1100203)；江苏省创新创业项目，项目负责人：赛吉拉夫

Difference in the culture of dorsal root ganglion cells in serum-free medium and serum medium

Xu Jinhui1, Qin Xuzhen1, Zhang Hongcheng1, Ma Yanxia2, Qi Shibin1, Saijilafu1, 2

1First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 2Institute of Orthopaedics, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China

Received:2019-12-11 Revised:2019-12-13 Accepted:2020-04-22 Online:2021-05-08 Published:2020-12-28
Contact: Saijilafu, Professor, Doctoral supervisor, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopaedics, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
About author:Xu Jinhui, Master candidate, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81571189, 81772353 (to Saijilafu); the National Key Research and Development Program, No. 2016YFC1100203; an Innovation and Entrepreneurship Program of Jiangsu Province (to Saijilafu)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
电转染技术(Nucleofection)：即电穿孔转染，是德国Amaxa公司的专利技术，在特定的细胞核转染溶液中，通过应用电穿孔技术将外源核酸直接导入真核细胞的细胞核内的转染方法。该技术十分有利于促进外源DNA或siRNA等高效率转染靶细胞，可在数小时内完成整个转染和分析的过程，从而促进通过过表达或干涉手段分析基因功能的研究。
背根神经节(Dorsal root ganglion cells，DRG)：背根神经节是位于各椎间孔内侧面呈卵圆形的半透明膨胀结节，负责接收来自身体感受器的全部神经冲动，通过向心纤维将它们传送到脊髓。
无血清培养基：不必加入血清也可以维持细胞正常生长的人工合成培养基。

背景：有血清培养基和无血清培养基都曾用来培养背根神经节细胞，但两者之间的差异仍不清楚。
目的：探究用无血清培养基是否能完全替代有血清培养基培养背根神经节细胞。
方法：取8-10周 ICR 小鼠背根神经节，并通过胶原酶和胰蛋白酶的处理，之后分为电转有血清组、电转无血清组和非电转有血清组、非电转无血清组，电转组背根神经节细胞加入电穿孔缓冲液和增强型绿色荧光蛋白质粒，进行电穿孔转染。细胞培养3 d，进行Tuj1抗体染色。非电转有血清组和非电转无血清组统计轴突分叉、轴突再生长度、细胞存活数以及轴突再生相关蛋白的表达量；电转有血清组和电转无血清组统计轴突分叉、轴突再生长度、细胞存活数以及电转效率。实验方案经苏州大学附属第一医院实验动物伦理委员会批准。
结果与结论：①非电转有血清组和非电转无血清组在轴突分叉、轴突再生长度、细胞存活数以及轴突再生相关蛋白的表达量上均无明显差异 (P > 0.05)；②电转有血清组和电转无血清组在轴突分叉、轴突再生长度、电转效率上均无明显差异 (P > 0.05)；相比于电转有血清组，电转无血清组的细胞存活数明显较低(P < 0.05)；③电转有血清组和非电转有血清组之间，细胞轴突再生长度无明显变化 (P > 0.05)，非电转有血清组的细胞存活数明显高于电转有血清组(P < 0.05)；④结果表明，在非电转的条件下，有无血清并不影响背根神经节的体外培养，无血清培养基可以替代有血清培养基；而在电转条件下，无血清培养基会使细胞存活数降低，提示在电转条件下，血清对背根神经节的体外培养有重要作用，因此无血清培养基无法取代有血清培养基。

https://orcid.org/0000-0003-2290-9808(赛吉拉夫)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 背根神经节细胞, 无血清, 培养基, 轴突, 轴突分叉, 细胞存活数, 电转, 蛋白

Abstract: BACKGROUND: Both serum-free and serum media have been used to culture dorsal root ganglion cells, but the difference between the two remains unclear.
OBJECTIVE: To explore whether serum-free medium can completely replace serum medium for culture of dorsal root ganglion cells.
METHODS: The dorsal root ganglion of ICR mice at 8-10 weeks was taken and treated with collagenase and trypsin. After that, the mice were divided into the electroporation + serum group, electroporation + serum-free group, non-electroporation + serum group and non-electroporation + serum-free group. In the electroporation groups, the dorsal root ganglion cells were transfected with electroporation buffer and enhanced green fluorescent protein particles. Cells were cultured for three days. After Tuj1 antibody staining, in the non-electroporation + serum group and non-electroporation + serum-free group, axon branches, axon regeneration length, number of cell survival and the expression of proteins related to axon regeneration were counted. In the electroporation + serum group and electroporation + serum-free group, axon branches, length of axon regeneration, number of cell survival, and electroporation efficiency were measured. This study was approved by the Laboratory Animal Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Soochow University.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In the non-electroporation + serum group and non-electroporation + serum-free group, there was no significant difference in axon branches, axon regeneration length, number of cell survival and the expression of axon regeneration related proteins (P > 0.05). (2) In the electroporation + serum group and electroporation + serum-free group, there was no significant difference in axon branches, axon regeneration length and electroporation efficiency (P > 0.05). Compared with electroporation + serum group, the number of cell survival of the electroporation + serum-free group was significantly lower (P < 0.05). (3) There was no significant change in the length of cell axon regeneration between the electroporation + serum group and the non-electroporation + serum group (P > 0.05). The number of cell survival of the non-electroporation + serum group was significantly higher than that of the electroporation + serum group (P < 0.05). (4) The results showed that, in the condition of non-electroporation, the absence of serum does not affect the culture of dorsal root ganglion in vitro, and serum-free medium can replace serum medium. However, under the condition of electroporation, the number of cell survival would be decreased without serum medium, suggesting that serum plays an important role in the culture of dorsal root ganglion in vitro under the condition of electroporation. Therefore, serum-free media cannot replace serum media.

Key words: dorsal root ganglion cells, serum-free, culture medium, axon, axon bifurcation, cell survival number, electrical transfer, protein

中图分类号:

徐金辉, 秦绪祯, 张鸿程, 马艳霞, 齐士斌, 赛吉拉夫. 无血清培养基和有血清培养基对背根神经节生长的差异[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2043-2048.

Xu Jinhui, Qin Xuzhen, Zhang Hongcheng, Ma Yanxia, Qi Shibin, Saijilafu. Difference in the culture of dorsal root ganglion cells in serum-free medium and serum medium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(13): 2043-2048.

图/表（结果） 6

2.1 用光学显微镜观察背根神经节细胞培养3 d的各组背根神经节细胞在光学显微镜下观察，细胞均贴壁良好，分布较为均匀，胞体呈半透亮的球形，细胞形态较为健康，可见轴突和树突生长呈树丛状(图1)。

2.2 背根神经节细胞轴突长度分析结果神经细胞的轴突再生对轴突损伤后功能的恢复至关重要[14]。实验中，在电转有血清组、电转无血清组和非电转有血清组、非电转无血清组中，有趣的是，神经元的轴突再生长度之间无显著差异(P > 0.05)(图2)。说明在电转和非电转条件下，无血清并不影响背根神经节细胞的轴突再生长度。

2.3 背根神经节细胞存活数分析结果神经细胞在培养基中的存活是进行轴突再生的前提，如图3A，B，E所示，在非电转的条件下，相对于有血清组，用无血清培养基培养背根神经节感觉神经元对细胞的存活没有显著影响(P > 0.05)。图3C，D，E示，在电转的条件下，背根神经节神经元的存活数均减少，且电转无血清组的细胞存活数比电转有血清组明显减少(P < 0.05)，比非电转无血清组更显著的减少(P < 0.001)。电转对细胞会造成一定的伤害，提示在电转条件下，血清对背根神经节神经元有一定的保护作用。

2.4 背根神经节细胞轴突分支分析结果在电转有血清组、电转无血清组和非电转有血清组、非电转无血清组中，神经元的初级分支和次级分支均未受到影响(P > 0.05)(图4)。表明在电转和非电转条件下，无血清并不影响背根神经节细胞的轴突分支。

2.5 背根神经节细胞在不同培养基中的电转效率分析结果背根神经节细胞电转技术常用于机制研究，电转效率对实验的进行非常重要。结果见图5。图5B，E所示，成功电转的细胞为增强型绿色荧光蛋白阳性；图5A，D为神经元细胞，图5C，F中的黄色细胞为成功电转的神经元细胞。无论是在有血清培养基中还是在无血清培养基中培养，神经元的转染效率均为20%左右(P > 0.05)。

2.6 背根神经节细胞在不同培养基中轴突再生相关蛋白的表达变化分析结果轴突损伤常常会伴随与轴突再生相关基因的表达[15-19]。在此次研究中，检测了非电转条件下有血清和无血清组背根神经节细胞的p-STAT3、STAT3、Pten、GAP43、ATF3蛋白的表达水平的变化。将非电转有血清组的各种蛋白表达量定义为1，结果表明两组间无明显差异(P > 0.05)，见图6。

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引言

背根神经节细胞是外周神经系统的感觉神经元，是神经传入系统的初级站点[1]，并向大脑传递不同的感觉信号，如疼痛、温度、触摸和身体姿势[2]。每个背根神经节细胞有2个轴突：下行外周轴突分支连接周围的感受器，上行中心轴突分支投射到脊髓。此外，背根神经节感觉神经元的外周和中心分支的再生能力不同，外周支在周围神经损伤后容易再生，而中枢支在脊髓损伤后很难再生。所以，了解外周感觉神经元轴突再生的分子机制将有助于研究中枢神经系统损伤后轴突再生。同时，背根神经节解剖结构简单，易于分辨，取材过程简单，而且在轴突损伤后再生能力较
强[3]。因此，背根神经节感觉神经元的体外培养是研究周围神经轴突再生的理想方法。另一方面，背根神经节感觉神经元的体外电转siRNA或质粒也是研究轴突再生机制的重要方法[4]。
目前，在对动物细胞进行体外培养时，大多数情况下会在培养基中加入一定比例的血清以提供细胞生长所需的营养和各种生长因子[5]，在最新的研究中，体外培养背根神经节感觉神经元也使用到了血清[6]，说明体外细胞培养并没有放弃血清。此次实验中使用的背根神经节感觉神经元的体外培养方法除血清方面外其余与之相同。同时，血清化学组成非常复杂，且不明确，还有可能含有一些对细胞生长有害的物质，在细胞培养中使用不同生产日期或不同公司的血清有可能干扰细胞实验的结果，并使研究结果缺乏可信度[7]。另一方面，有研究表明35%-50%的商业化的含血清培养基病毒检测阳性[8]。用不含有血清的培养基培养背根神经节细胞可以排除不确定性因素，减少潜在的影响因子。在细胞培养中使用血清不仅存在一定的科学问题，还存在严重的伦理问题[9]。
血清使用最广泛的是动物新生儿或胎儿血清，如胎牛血清，全球市场生产的胎牛血清的确切数量仍不得而知，据估计，每年大约销售50万升胎牛血清,这意味着必须杀掉100多万头牛胎儿[10]，这给牛胎儿带来极大的痛苦。另一方面，血清价格昂贵，使科研花费增高，在发达国家，一瓶1 L的血清价格在600-1 000美元之间[11]。因此，在不影响细胞生长的情况下，使用不含血清的培养基显得更有优势。
目前，已有很多前期研究证明无血清培养基不仅可以避免由含血清培养基所带来的各种问题，而且还能在获得良好培养效果的同时保持细胞原有生物学特点[12]。但用无血清培养基培养背根神经节感觉神经元并没有人进行探索，在这个研究中，作者在电转和非电转的条件下分别对背根神经节神经元在有血清培养基及无血清培养基上进行培养，来探究血清对背根神经节感觉神经元的体外培养是否不可或缺。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2019年4月至10月在苏州大学附属第一医院南区骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6只8-12周ICR(Institute of Cancer Research)
雌/雄小鼠，体质量在28-35 g之间，小鼠饲养于苏州大学独墅湖校区903的SPF级动物房，许可证号：SCXK(苏) 2017-0006 。实验所用动物均经苏州大学动物伦理委员会批准。
1.3.2 实验用主要试剂胶原酶(瑞士 Roche 公司) ；胰酶(美国 Life Technology 公司)；胎牛血清(美国 Gibco 公司)；MEM(美国 Hyclone 公司)；层粘连蛋白、多聚-D-赖氨酸、青霉素/链霉素、Tuj1( Neural class Ⅲ β-Tubulin)抗体、Triton X-100(美国 Sigma-Aldric 公司)；多聚甲醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；牛血清白蛋白(广州赛国生物科技有限公司)；增强型绿色荧光蛋白质粒(表达载体：pEx-4，上海吉玛生物有限公司)；山羊抗鼠488和594荧光二抗(美国 Invitrogen 公司)；30%盐酸(江苏强盛功能化学股份有限公司)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；p-STAT3、STAT3、Pten、GAP43、ATF3抗体(Cell Signaling Technology)。
1.3.3 主要仪器电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；正置荧光显微镜(德国蔡司公司)；光学显微镜（苏州欧米特光电科技有限公司)；ECM 830电穿孔仪(美国 BTX 公司)；高速离心机(美国Thermo Fisher公司)；超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；圆形盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司)；细胞培养箱(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 用层粘连蛋白、多聚-D-赖氨酸包被圆形盖玻片在超净台，用镊子挑出用盐酸清洗过的玻片放入24孔板中，照射紫外并通风1 h使玻片干燥。在玻片表面加入70 μL含有多聚-D-赖氨酸(100 mg/L)和层粘连蛋白(10 mg/L)的MEM培养基，放入培养箱中2 h。从培养箱中拿出24孔板，用无菌PBS清洗3次。
1.4.2 背根神经节感觉神经元的获取与体外培养用颈椎脱臼法处死小鼠，小心取出卵圆形半透明的背根神经节组织放于预冷的MEM培养基中。吸除MEM培养基，加入含有1 g/L
胶原酶的MEM培养基在37 ℃的条件下消化90 min，之后换为1×胰酶继续消化15 min。换胰酶为体积分数10%胎牛血清终止消化并吹打组织至无大体观察可见组织块，然后离心(700 r/min，6 min)。去除上清后，有血清组加入有血清培养基(含有体积分数5%胎牛血清及50 U/mL青霉素、50 mg/L
链霉素、20 μmol/L 氟脲苷的MEM培养基)；无血清组加入无血清培养基(含有50 U/mL青霉素、50 mg/L链霉素、
20 μmol/L氟脲苷的MEM培养基)，分别混匀细胞并接种到24孔板中(500 μL/孔)培养3 d。

1.4.3 背根神经节感觉神经元的体外电穿孔转染在背根神经节细胞终止消化并离心后，弃去上清液并加入100 μL电穿孔缓冲液和 3 μg增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒，轻轻吹打使之充分混匀。之后将电穿孔缓冲液转移到电转杯中并在设定条件下(110 V，脉冲10 ms，间隔900 ms，3次)进行电穿孔转染[13]。之后迅速转移到相应培养基中混匀并接种到24孔板中，放入培养箱培养4 h后更换培养基并继续培养3 d。
1.4.4 背根神经节感觉神经元明场下观察培养3 d后，从培养箱中取出24孔板并在显微镜下观察背根神经节细胞的形态及生长状况。
1.4.5 背根神经节感觉神经元的免疫荧光染色从培养箱中取出24孔板，弃去上清，每孔加入40 g/L多聚甲醛200 μL固定20 min，PBS清洗3次后加入含有0.1%Triton X-100的体积分数2%牛血清白蛋白封闭1 h，之后用Tuj1(1∶1 000)在常温下染色90 min，PBS清洗3次后用荧光二抗染色1 h，PBS清洗3次后用抗荧光淬灭剂封固。
1.4.6 背根神经节感觉神经元的轴突长度测量、细胞密度计算、轴突分支统计背根神经节细胞经正置荧光显微镜拍照后，用AxioVision 4.72软件测量神经元轴突长度，每个神经元最长的轴突大于2倍胞体直径会被纳入统计中，每组统计100个细胞的轴突长度并取平均值。然后统计每平方厘米内神经元的数量，得到细胞密度值。最后分别统计神经元轴突的初级分支数和次级分支数，初级分支为从胞体发出的轴突，次级分支为从初级分支发出的分支，每组统计100个神经元，分别计算初级分支数和初级分支数的平均值。实验重复3次。
1.4.7 电穿孔转染效率的统计电转后培养3 d的背根神经节神经元，分别经正置荧光显微镜拍摄增强型绿色荧光蛋白(EGFP)信号(绿色)和Tuj1(红色)。绿色细胞为成功转染了增强型绿色荧光蛋白质粒，红色细胞为背根神经节感觉神经元细胞。统计100个背根神经节感觉神经元中增强型绿色荧光蛋白质粒成功转染的比例得出转染效率。实验重复3次。
1.4.8 蛋白免疫印迹背根神经节感觉神经元分别在有血清和无血清培养基中培养3 d，之后提取蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测所提蛋白的浓度，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液使蛋白样品变性(95 ℃，5 min)。在8%的SDS-PAGE凝胶中加入等质量的蛋白在110 V电压下电泳，之后将蛋白转到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶进行封闭。然后先后孵育一抗(p-STAT3、STAT3、Pten、GAP43、ATF3抗体)和相应二抗，最后用ECL显影液进行显影。检测非电转条件下有血清和无血清组背根神经节细胞的p-STAT3、STAT3、Pten、GAP43、ATF3蛋白的表达。
1.5 主要观察指标 ①明场下背根神经节细胞的形态特征；②背根神经节细胞的轴突再生长度、存活数和分支情况；③电穿孔转染后的细胞存活率；④蛋白免疫印迹的结果。
1.6 统计学分析所有数据以平均值±标准误表示，数据统计分析使用了GraphPad Prism 5.0软件。用独立样本t检验确定两组间是否有差异，P < 0.05时表示2组间差异有显著性意义。

讨论

前人的研究表明，血清常用于动物细胞培养中，含有非人工合成的自然来源的营养物质可以补充人工合成培养基中所不具备的、对细胞的生长及分化有利的化学物质[20]。但这些化学物质成分并不明确，到底起着怎样的作用也不得而知。大量研究证明，不同组织来源的细胞对营养成分有不同的需求[21]。在此次研究中，血清中所含有的未知的化学成分对轴突再生长度和轴突分叉并没有起到决定性作用，无血清培养基中的物质基本可以满足神经元再生的需要。
啮齿类神经元与人类相似，常用于体外培养的研究[22]。成年小鼠背根神经节组织中除了含有高度分化且不增殖的感觉神经元，还含有胶质细胞和成纤维细胞[23-24]，成纤维细胞在一定程度上影响神经轴突再生[25]。同时胶质细胞和成纤维细胞分裂旺盛，因此在培养基中加入有丝分裂抑制剂抑制非神经细胞的增殖[26]。与此同时，无血清培养基可以抑制胶质细胞和成纤维细胞的增殖[27]。所以在背根神经节神经元培养过程中，非神经细胞在多大程度上影响神经细胞的轴突再生依然不清楚。
在进行神经元数目统计时发现统计的细胞数远小于接种的细胞数，说明在细胞培养过程中有细胞死亡，考虑有以下原因：①laminin虽然能促进神经元的贴壁和黏附，但并不是每个神经元都能成功贴壁，未贴壁的细胞在后期的染色中就被清洗掉了；②在取材的过程中动作要迅速，且要避免干燥和污染，背根神经节神经元长时间在体外会对神经元造成一定的损害；③氟脲苷在抑制细胞增殖的同时对神经元有一定的毒性[28]，在一定程度上导致神经元的死亡；④在电转组，电穿孔转染会对细胞造成损害[29]，因此细胞培养3 d后细胞数目锐减。⑤在操作的过程中使用的超净台或仪器有污染。
来自轴突的分支是功能性神经回路的主要组成部分[30-31]，单个轴突可通过分支激活多个靶细胞[32]。轴突分支的形成能力在一定程度上决定了神经元突触的数量,这使神经元能与多个树突相联系[32-33]。因此在此次实验中，统计了神经细胞的轴突分支数目，在一定程度上能反映细胞突触形成的数目。文中只统计了初级分支和次级分支，并没有统计其余分支。因为初级轴突和次级轴突辨识度较高，其余轴突则较为杂乱不易统计，且细胞之间的差别较大。
增强型绿色荧光蛋白质粒对神经细胞的毒性较小，因此常用来标记神经元[34]。有报道称在间充质干细胞中电转增强型绿色荧光蛋白质粒，电转效率能达到40%左右[35]，而在此次研究中电转效率只有20%左右，提高电转的电压和脉冲时间也许可提高电转效率，但同时也会导致更多的细胞死亡。
目前人类已经证实了很多蛋白可以影响神经轴突的再生，如果无血清培养基对神经轴突再生有影响，必然会改变与轴突再生有关基因的表达。此次课题选择了有代表性的几个蛋白进行检测发现表达量并无差异，与轴突再生相关的蛋白众多，实验所选的蛋白并不能代表全部。
此次实验依然有一些不足之处：首先，实验中使用的背根神经节神经元为成熟神经元，但有血清和无血清培养基对培养胎鼠背根神经节神经元的影响尚未探究；其次，实验中，细胞只培养了3 d，对更长时间的培养没有深入研究，因此也缺乏一定的连续性；最后，明场观察的结果无法量化，主观性较大，不利于业内人士的交流。
研究探索了在电转条件下和非电转条件下，用有血清培养基和无血清培养基对培养成熟背根神经节神经元的影响。研究发现，在电转和非电转条件下，有血清培养基和无血清培养基对背根神经节神经元的轴突再生长度、轴突分支没有明显影响。说明在一定程度上无血清培养基可以替代有血清培养基。在电转条件下，无血清培养基培养背根神经节神经元会导致细胞一定程度的死亡，提示在电转条件下，血清对背根神经节神经元有一定的保护作用，提示无血清培养基不能完全取代有血清培养基。期望未来无血清培养基能够有所改进以完全取代有血清培养基。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

无血清培养基和有血清培养基对背根神经节生长的差异

Difference in the culture of dorsal root ganglion cells in serum-free medium and serum medium

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