由表2可以看出，加入戊二醛后交联反应即开始进行。在升温之前交联反应进行得较慢，升温后反应开始加速，乳液出现破乳，颗粒物基本成球形并可以沉积，到120 min时反应基本完成，此时微球表面光滑平整，大小较均匀，这说明升温至70 ℃后再反应120 min即可。 
2.2  确定反应温度  随着反应温度的升高，壳聚糖磁性微球颜色逐渐加深。这是由于在乳化过程中，非极性溶剂中的胶团化过程是放热反应，温度升高不利于乳化过程的进行，并导致非离子分散剂的多分散性增加。因此在加入戊二醛之前，使反应体系在常温下充分搅拌20 min。但温度升高可使交联过程速度加快，交联反应进行的更加彻底，反应产物的颜色也随之加深。所以为了加快交联过程，将反应温度升高。综合考虑，40→70 ℃为最佳反应温度，见表3。



2.3  确定壳聚糖质量浓度  壳聚糖质量浓度对磁性壳聚糖微球的影响，见表4。



       由图4可知，随着壳聚糖质量浓度的增加，微球粒度增大。当壳聚糖质量浓度过大时，反应液的黏度也大，搅拌就困难，分散在油相中的水相体积变大，在此情况下生成的微球粒径也就随之增大，且粘连严重。而较低质量浓度壳聚糖制备的磁性壳聚糖微球球形不佳，大部分Fe₃O₄不能有效分布在壳聚糖的交联网络当中。并且随着壳聚糖质量浓度的增加，反应液的颜色逐渐加深。微球颜色的变化是由于随壳聚糖质量浓度的增加，微球壁增厚，从而颜色加深。同时在较低质量浓度壳聚糖制备的磁性壳聚糖微球中，磁性Fe₃O₄的含量低、磁敏感性低、磁响应不强；随着壳聚糖质量浓度的增加，磁响应增强，质量浓度为0.02 g/mL时达到最高，而后随着壳聚糖浓度质量的增加，微球磁响应降低。作者希望微球的粒径小、磁响应强。综合考虑，选用质量浓度为0.02 g/mL的壳聚糖乙酸溶液制备微球。



2.4  确定Fe₃O₄/壳聚糖质量比  随着反应体系中壳聚糖比例的增大，与等量Fe₃O₄结合的壳聚糖量增大，导致了Fe₃O₄分散性下降，微球粒径增大。随着Fe₃O₄磁性微粉的相对含量减小，产物的磁性先略微升高，后显著降低，外观由黑色过渡到黄褐色，见图5。当Fe₃O₄/壳聚糖质量比为1∶1时，微球粒径较小，但是在万能视频成像装置观察下有部分Fe₃O₄微粒未被包覆，见图6A所示。当Fe₃O₄/壳聚糖质量比为1∶2时，基本没见未被包覆的Fe₃O₄微粒，微球球形见图6B所示。因此，Fe₃O₄/壳聚糖质量比为1∶2为最佳实验条件。

2.5  确定戊二醛用量  当戊二醛浓度较低时，醛基比例小，交联强度低，生成的微球表面粗糙，空隙多，被包裹的Fe₃O₄纳米粒子容易被氧化。随着戊二醛用量的增加，微球颜色加深，成球性能变差，粒径增大，这是由于戊二醛用量的增大也使微球互相交联黏着，球形保持的不好。当戊二醛浓度过高时，戊二醛自身容易发生羟醛缩合，固化成不规则物质附着在微球表面，影响微球的表面孔结构，从而影响酶的固定。实验发现制备磁性壳聚糖微球时，戊二醛用量为8-10 mL比较适宜。考虑后续实验将磁性壳聚糖微球用于乳糖酶的固定化，讨论不同戊二醛量制备的磁性壳聚糖微球对固定化效果产生的影响。 

2.6  确定分散介质液体石蜡用量  由表5可知，当液体石蜡的用量为80 mL时，易搅拌，效果较好。因此，选择液体石蜡的用量为80 mL。

2.7  确定搅拌速度  通过反复实验，选取搅拌速度为1 200 r/min得到了较好的效果。

2.8  磁性壳聚糖微球磁响应性的测定  用分光光度法测定最优因素制备的磁性壳聚糖微球磁沉降曲线。称取20 mg磁性壳聚糖微球溶于20 mL无水乙醇中，超声分散20 min。平均分成2份，其中一份置于磁场中，隔一定时间取溶液1/2处溶液测量其透光率(于波长580 nm处测量)；另一份悬浮液静置，自然沉降，隔一定时间取上层清液在相应的波长处测其透光率。

由图7可以看出，磁性壳聚糖微球经磁分离10 min后，透光率就达到80%以上；当无外加磁场时，悬浮液的透光率变化缓慢，说明纳米粒子在重力作用下只是缓慢沉降；当施以外加磁场时，悬浮液的透光率迅速升高，纳米粒子的沉降速率迅速增大，这说明磁性壳聚糖微球在外加磁场下具有强磁性能，在自然状态下具有良好的悬浮稳定性。



2.9  扫描电镜下的磁性壳聚糖微球形态和粒度  图8为最优因素制备的磁性壳聚糖微球扫描电镜图，壳聚糖与Fe₃O₄纳米粒子形成的复合微粒呈球状，纳米粒子被包裹在微球内，为核壳结构，且微球表面较平滑，单分散性好；微球粒径介于1-15 μm之间，该粒径利于微球在反应体系中分散和磁分离。小粒径的微球具有更大的比表面积，同时也可以降低底物和产物扩散限制的影响。壳聚糖在与戊二醛发生交联反应后，使复合微球硬化并易于从混合体系中分离。

磁性高分子微球是一种新型功能高分子材料，它是内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末，从而具有磁响应性的高分子微球。磁性高分子微球不但可以通过共聚、表面改性等化学反应方法在微球表面引入多种反应性功能基团，也可通过共价键来结合酶、细胞和抗体等生物活性物质，还可对外加磁场表现出强烈的磁响应性，进行快速运动或分离^[1]。因其具有“在外界磁场存在下能定向运动”这一特殊性能，在医学、生物工程、化工、环境保护等各个领域研究日益活跃，并具有较好的应用前景^[2]。

磁性高分子微球一般为核/壳式结构，可分为3类：一是以磁性材料为核、高分子材料为壳的核/壳式结构；二是以高分子材料为核、磁性材料作为壳层的核/壳式结构；三是内层、外层皆为高分子材料，中间层是磁性材料的夹心式结构，其中研究较多且具有广泛应用前景的主要是第一类磁性高分子微球^[3]。就目前的研究状况而言，磁性高分子微球的制备主要有2条途径：一是利用天然高分子直接包埋磁性材料形成具有磁核的高分子微球；二是在磁流体存在下通过单体聚合形成磁性微球。马立成等^[4]以Fe₃O₄磁核、环氧氯丙烷为交联剂制备出了粒径为1 mm的磁性交联壳聚糖微球。石凤等^[5]采用化学共沉淀法制备出磁性Fe₃O₄纳米粒子，将其协同海藻酸钠包埋葡萄糖氧化酶，并使用戊二醛交联得到了良好的固定化效果。王楠楠等^[6]采用共沉淀法制备磁性壳聚糖微球，以戊二醛做交联剂将脂肪酶固定在磁性壳聚糖载体上。傅明连等^[7]采用乳化交联法以戊二醛为交联剂制得磁性壳聚糖微球。任娇艳等^[8]利用化学共沉淀法制备Fe₃O₄磁性颗粒，并以此为磁核通过乳化交联法制备磁性壳聚糖微球。王鑫等^[9]采用反向悬浮交联方法制备的磁性壳聚糖微球粒径为12.78 μm和15.27 μm。

壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基的衍生物，属多糖类，是一种直链多糖高分子化合物，具有亲水性、生物相容性、可降解性等特点^[10]。将壳聚糖与磁性物质结合得到磁性壳聚糖，能够提高其稳定性及机械强度，使其容易分离，从而广泛应用于各种领域^[11]。

作者采用反相悬浮交联法制备磁性壳聚糖微球，首先制得聚合物溶液(壳聚糖乙酸溶液)，再将Fe₃O₄粒子直接加入到溶解好的聚合物溶液中，再将其缓慢加入到聚合物油相溶剂中，在制备的油相聚合物溶液中添加一定比例的乳化剂，搅拌均匀，在高速搅拌情况下形成两相分散均匀的微乳液，在一定温度下静置，在形成的微乳液体系中进行交联反应，这个方法称为反相悬浮交联法^[12]。采用该法制备出的微球在外加磁场下具有强磁性能，在自然状态下具有良好的悬浮稳定性，并且微球表面较平滑，单分散性好，微球粒径介于   1-15 μm之间，该粒径利于微球在反应体系中分散和磁分离。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  体外观察实验。

1.2  材料  采用化学共沉淀法合成Fe₃O₄磁性粒子^[13]，见表1。壳聚糖、36%乙酸、液体石蜡、Span-80、25%戊二醛、氢氧化钠、石油醚、丙酮、无水乙醇均购自成都市科龙化工试剂厂。

实验用主要仪器：HH-S数显恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)；7200型可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)；ZK-82B型真空干燥箱(大连第四仪表厂)；ME100系列生物显微镜(江西省上饶市光学路)；电子天平BS200S(北京塞多利斯太平有限公司)；托盘天平(北京医用天平厂)；JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝)；pHS-3C酸度计(成都世纪方舟科技有限公司)；万能视频成像装置(成都励扬精密机电有限公司)；88-1大功率磁力搅拌器(金坛市丹瑞电器厂)；高速离心机HC-2064(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。      

1.3  实验方法

1.3.1  磁性壳聚糖微球的制备流程  以戊二醛为交联剂、液体石蜡为分散介质，采用反相悬浮交联法制备磁性壳聚糖微球。

交联时间对微球性能的影响：将0.5 g Fe₃O₄与50 mL壳聚糖乙酸溶液(0.02 g/mL)混合，进行20 min超声分散。再在搅拌下缓慢加入到80 mL液体石蜡和4 mL Span-80中，常温下充分搅拌20 min，加入10%戊二醛8 mL，40 ℃下搅拌反应1 h，用1 mol/L NaOH将其pH值调到9-10，70 ℃水浴中反应一定时间(0，20，40，60，80，100，120，150，180 min)，得到产物用磁铁收集。再依次用石油醚、丙酮、蒸馏水充分洗涤，13 132×g离心5 min，60 ℃真空干燥得到磁性壳聚糖微球。

反应温度对微球性能的影响：将0.5 g Fe₃O₄与50 mL壳聚糖乙酸溶液(0.02 g/mL)混合，进行20 min超声分散。再在搅拌下缓慢加入到80 mL液体石蜡和4 mL Span-80中，常温下充分搅拌20 min，加入10%戊二醛8 mL，在一定温度(T1)下搅拌反应1 h，用1 mol/L NaOH将其pH值调到9-10，再于一定温度(T2)水浴中反应2 h(T1→T2：20→50 ℃、30→60 ℃、40→70 ℃、50→80 ℃)，得到产物用磁铁收集。再依次用石油醚、丙酮、蒸馏水充分洗涤，13 132×g离心5 min，60 ℃真空干燥得到磁性壳聚糖微球。

壳聚糖质量浓度对微球性能的影响：固定壳聚糖乙酸溶液为50 mL、Fe₃O₄质量0.5 g、液体石蜡80 mL、Span-80 4 mL和10%戊二醛8 mL、反应温度为40→70 ℃等反应条件不变，改变壳聚糖质量浓度(0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g/mL)，测试其对产物成球性的影响。

Fe₃O₄/壳聚糖质量比对微球性能的影响：固定液体石蜡80 mL、Span-80 4 mL、10%戊二醛8 mL、反应温度为40→70 ℃等反应条件不变，改变Fe₃O₄/壳聚糖质量比 (1∶1，1∶2，1∶3，1∶4)，测试其对产物成球性的影响。

戊二醛用量对微球性能的影响：为了得到一定刚度的壳聚糖微球，在反应时要加入交联剂戊二醛。不同种类的双官能团试剂(如戊二醛、对苯二甲酞氯、乙二醇二环氧甘油醚)都能作为交联剂，而其中戊二醛是使用最多的^[14]。改变戊二醛用量(8-10 mL)，研究其对微球性能的影响。

分散介质液体石蜡用量对微球性能的影响：有机分散介质对反相悬浮交联产物微粒的成球性、粒径及分布均匀性影响很大。液体石蜡由于其比重与水的比重较为接近，较易制得乳液，反应平稳，产物微球极易与有机相分离，所得微球粒度和粒度分布也较好，因此将其作为有机分散介质。改变液体石蜡用量(40，60，80，100 mL)，研究其对微球性能的影响。

搅拌速度对微球性能的影响：搅拌速度为壳聚糖溶液提供了在分散介质中分散所需的能量，随着搅拌速度的加快，微球的粒径减小，这是因为搅拌速度越快越有利于反应体系的分散，这也利于Fe₃O₄粒子能够均匀分散到微球中，从而减少其在表面的负载，避免其对壳聚糖的修饰带来负面影响。但是速度过快会使微球遭到破坏。88-1大功率磁力搅拌器的搅拌速度范围是0-2 000 r/min，研究其对微球性能的影响。

       此外，微球内Fe₃O₄/壳聚糖复合的作用机制可能为：由于壳聚糖分子表面富含氨基和羟基，Fe原子的3D空轨道与氨基N原子上的孤对电子或羟基的O原子作用形成配位键，使得该复合过程的进行，其作用机制见图3所示。

1.4  主要观察指标

磁性壳聚糖微球平均粒径的测定：将20 mg磁性壳聚糖微球干燥粉末溶于10 mL无水乙醇中，进行40 min超声分散，然后在生物显微镜下观察并用万能视频成像装置测定其中任意10颗磁性壳聚糖微球的粒径，取其平均值，得到平均粒径。小粒径意味着微球具有较大的比表面积，可以结合更多的酶，利于微球在反应体系中分散和磁分离。

磁性壳聚糖微球磁响应的测定：将优磁性壳聚糖溶液置于磁场中，沉降5 min后取试管1/2处液体，在580 nm处测定其透光率。透光率越大磁响应越强。

实验发现制备磁性壳聚糖微球的最佳条件为：从加入交联剂戊二醛开始计时，先于40 ℃反应1 h，再升温至70 ℃继续再反应120 min，壳聚糖质量浓度为0.02 g/mL，Fe₃O₄/壳聚糖质量比为1∶2，液体石蜡用量为80 mL，搅拌速度为1 200 r/min，戊二醛用量为8-10 mL。

磁性壳聚糖微球经磁分离10 min后透光率就达到80%以上，当无外加磁场时，微球悬浮液的透光率变化缓慢，说明纳米粒子在重力作用下只是缓慢沉降；当施以外加磁场时，微球悬浮液的透光率迅速升高，纳米粒子的沉降速率迅速增大，这说明磁性壳聚糖微球在外加磁场下具有强磁性能，在自然状态下具有良好的悬浮稳定性。

壳聚糖与Fe₃O₄纳米粒子形成的复合微粒呈球状，纳米粒子被包裹在微球内，为核壳结构，微球表面较平滑，单分散性好。制备的磁性壳聚糖微球粒径介于1-15 μm之间，该粒径利于微球在反应体系中分散和磁分离。

由于具有良好的磁响应性及粒径，该磁性壳聚糖微球主要可作为固定化酶的载体，在后续有相关的研究得到了较好的应用。与游离酶相比，固定化酶具有以下优点：回收后固定化酶可反复使用，降低了成本；将磁性载体固载酶放入磁场稳定的流动床反应器中，可以减少持续反应体系中的操作，适合于大规模连续化操作；利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。后续的研究进一步发现：与游离酶相比，该磁性微球作为固定化乳糖酶的载体有更宽的pH适用范围；固定化酶最佳催化温度较游离酶提高了5 ℃，这样升温进行酶促反应可以提高反应速度，节省反应时间；经磁性壳聚糖微球固定化后的酶米氏常数比游离酶下降，说明酶在固定化后其结合底物的能力有所增强；固定化酶反复使用5次后酶活仍保持65%；酶被固定化后，其贮存稳定性也有所提高。

论文中的工作尚处于探索阶段，亟待进一步的研究，具体而言，涉及以下几个方面：①进一步对磁性高分子微球的基础理论进行研究，如：不同结构的磁性高分子微球的形成机制；磁性高分子微球的磁性起源、结构和性能的关系；磁性高分子微球的物理性质，尤其是磁性能；②如何对磁性微球进行大小分离，使微球的粒径分布集中，对于应用比较重要；③如何调节磁性载体表面特性，提高固定化酶在实际操作条件下的稳定性等。

高分子磁性微球集磁性与分离的优点于一体，能简单方便和高选择性地从复杂生物体系中分离出目标生物分子，已在细胞分离、免疫检测、靶向药物、固定化酶及亲和分离等诸多方面展现出重要的应用前景。更深入地研究磁性高分子微球的基础理论及尽快使已取得的成果由实验阶段进入应用阶段，将成为今后磁性高分子微球研究的重点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：
磁性高分子微球：是指通过适当的方法使有机高分子与无机磁性物质结合起来形成的具有一定磁性及特殊结构的微球，其不但可以通过共聚、表面改性等化学反应方法在微球表面引入多种反应性功能基团，也可通过共价键来结合酶、细胞和抗体等生物活性物质，还可对外加磁场表现出强烈的磁响应性，进行快速运动或分离。
壳聚糖：为甲壳素脱乙酰基的衍生物，属多糖类，是一种生物相容性好、易生物降解、无毒、廉价易得的天然高分子生物材料，易于加工成粉、膜、多孔微球、凝胶、纳米粒子等多种形态。

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实验制备的磁性高分子微球能有效结合酶、细胞和抗体等生物活性物质，还可对外加磁场表现出强烈的磁响应性，可用于靶向药物、固定化酶及亲和分离等领域。作者在后续研究中将其应用于固定化酶的制备，得到了较好的效果。与游离酶相比，用该磁性壳聚糖微球制备的固定化酶具有可反复使用，可控制运动方式和方向，结合底物的能力增强，贮存稳定性提高等优点。

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