2.1  羊水干细胞分选结果  将穿刺获取的羊水离心后，接种于羊水干细胞增殖培养基。细胞贴壁较慢，一般需要7-  9 d；贴壁细胞具有增殖能力，而不贴壁细胞不具有明显的增殖能力，随着培养时间的延长，不贴壁的细胞会逐渐死亡；培养7 d后全量换液，继续培养2-4 d，将贴壁的羊水细胞进行扩增，以获得一定基数的羊水细胞进行磁珠分选，其优点是不影响产前诊断的正常进行。磁珠分选细胞表面c-Kit阳性的羊水干细胞，将分选后的干细胞种植在6孔板内，羊水干细胞呈单层扩增，增殖迅速，倍增时间大约需要48 h，多呈成纤维细胞样的形态，见图1。

2.2  羊水干细胞表达干细胞标记物Oct-4和Sox2  免疫荧光鉴定羊水干细胞Oct-4和Sox2的表达，发现胚胎干细胞标记物Oct-4与神经干细胞标记物Sox2的表达都呈强阳性^[23]；(75.0±4.6)%的羊水干细胞表达胚胎干细胞标记物Oct-4；(86.0±2.8)%的羊水干细胞表达神经干细胞标记物Sox2；(72.0±4.9)%的羊水干细胞共同表达Oct-4和Sox2，见图2。

2.3  羊水干细胞多次传代不影响其干性  将羊水干细胞多次传代，用RT-PCR方法检测干细胞标记物c-Kit、Oct-4、Sox2和Nestin的表达，见图3A；半定量检测统计分析发现羊水干细胞干性标记物的mRNA表达量在第5代和第30代基本相同，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3B。结果说明干性标记物的表达量并不随细胞传代数的增加而改变。

2.4  拟胚体的形成  将羊水干细胞悬滴培养4 d，在重力的作用下可形成类似于胚胎干细胞的拟胚体，见图4A，B，胚体饱满，边界清楚，其内细胞连接紧密，生长旺盛，呈立体球形结构，外形极其规整，形成率96%。拟胚体表达胚胎干细胞标记物Oct-4，见图4C-E，说明羊水干细胞可能具有与胚胎干细胞类似的生物学特性。

2.5  免疫荧光鉴定羊水干细胞Tuj1表达  未经诱导的多个不同样本的羊水干细胞都能检测到神经元标记物Tuj1的表达；(92.0±1.0)%的羊水干细胞表达神经元标记物Tuj1，呈强阳性，但无典型的神经元形态特征，见图5。

2.5  免疫荧光鉴定羊水干细胞Tuj1表达  未经诱导的多个不同样本的羊水干细胞都能检测到神经元标记物Tuj1的表达；(92.0±1.0)%的羊水干细胞表达神经元标记物Tuj1，呈强阳性，但无典型的神经元形态特征，见图5。

2.6  羊水干细胞Tuj1 mRNA表达  随机选取3个不同的羊水样本，分别提取其中的羊水干细胞，通过RT-PCR检测发现3个样本的羊水干细胞均表达神经元标记物Tuj1 mRNA；同一个羊水干细胞样本经多次传代后，仍然能检测到Tuj1 mRNA的表达，见图6。

2.7  羊水干细胞向神经元方向诱导分化  第1阶段是将羊水干细胞向神经干系诱导分化，在含有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中诱导8 d，免疫荧光检测发现超过(90.0±2.3)%的羊水干细胞表达神经干细胞标记物Neuro D，见图7；第2阶段将诱导后的神经干细胞给予脑源性神经营养因子、神经营养因子3诱导分化6 d，免疫荧光检测发现经诱导后的羊水干细胞表达神经元标记物Tuj1，见图8A-C，且细胞形态发生了明显改变，细胞胞体回缩，呈典型的梭状纺锤体样结构，经诱导后的羊水干细胞排列规整，细胞与细胞之间互相平行，与未经诱导的羊水干细胞形态特征不同，见图8D。

神经元细胞在炎症、退化、药物毒性、理化、外伤等诸多因素作用下，可能出现变性、脱髓鞘、凋亡等不同程度的退化或死亡。由于神经元及胶质细胞的分化程度高，一旦损伤往往难以修复，甚至不可逆。神经元的病变如累及中枢神经系统，表现为帕金森病；如累及外周感觉神经(听觉平衡系统等)，表现为神经性耳聋、眩晕、耳鸣等症状。神经性耳聋为耳科临床上常见的疾病之一，目前减缓损伤或保护神经元的药物(例如糖皮质激素、神经生长因子)总体效果不理想；人工耳蜗植入或助听器能在一定程度上改善耳聋患者的听力，但前提是耳聋患者具有完整的功能性螺旋神经元结构。对由于螺旋神经元损伤导致的神经性耳聋患者，其临床治疗策略仍需要进一步的深入研究。

利用干细胞分化代替受损神经元的设想^[1-7]，逐渐受到越来越多科研工作者的关注。胚胎干细胞和诱导性多能干细胞虽然具有良好的神经元分化潜能^[8-9]，但由于接种活体动物具有致瘤性，限制了胚胎干细胞的进一步深入研究。2007年，DE COPPI等^[10]在《Nature Biotechnology》杂志中首次提出羊水细胞中含有c-Kit标记的干细胞，具有全能干细胞的特性^[11-14]，已证实在体外可成功诱导分化为3个胚层组织，包括肝细胞、内皮细胞、脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、平滑肌细胞等。较之胚胎干细胞，羊水干细胞又具有来源易取、无致瘤性等特点。

从神经性耳聋的治疗角度出发，课题组前期采用内耳支持细胞和羊水干细胞三维培养模式，发现羊水干细胞可分化为听觉神经元样细胞，初步具备螺旋神经元特性^[15]，研究重点围绕内耳支持细胞的促分化作用展开介绍。羊水干细胞在今后神经元疾病治疗的前景广阔，但由于前期的分化方式较复杂，例如内耳支持细胞获取困难、数量有限，难以利用三维培养模式诱导羊水干细胞获取足够数量的神经元。因此课题组结合前期经验进行拓展研究，探讨有无其他方式可诱导羊水干细胞向神经元样细胞定向分化，以及建立稳定的分化体系，为神经元的再生提供参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  细胞学体外观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2015年10月至2019年3月在广州医科大学附属第二医院过敏反应实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验标本  羊水取自广州医科大学附属第二医院的产前检查孕妇，夫妻双方均签署了知情同意书。在孕19-22周期间，经B超引导下抽取孕妇羊水10 mL。广州医科大学附属第二医院医学伦理委员会审核并同意此项研究。

1.3.2  实验试剂  α-MEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清、谷氨酸、N2、B27(GIBICO公司)；ChangB、ChangC (Irvine Scientific公司)；碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子3 (R&D System公司)；Sox2、Tuj1一抗(Abcam公司)；c-Kit磁珠抗体(Miltenyi Biotec公司)；Oct-4、Neuro D一抗(Santa cruz公司)；荧光显微镜下(Leica，德国)。

1.4  方法

1.4.1  分离并培养扩增羊水干细胞  将孕19-22周10 mL羊水移入15 mL离心管，2 000 r/min离心5 min；吸除上清液，加入4 mL羊水干细胞增殖培养基(α-MEM培养基+体积分数为15%胎牛血清+1%谷氨酸+18%ChangB+2% ChangC)接种于25 cm²培养瓶，置入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内，培养7-9 d。第7天，根据羊水贴壁细胞的增殖情况进行全量换液，加入4 mL新的增殖培养液，继续培养2-4 d，观察羊水贴壁细胞的生长状态，决定是否需要传代。用c-Kit磁珠抗体分选羊水细胞中具有c-Kit标记的羊水干细胞^[10，15-16]。

1.4.2  免疫荧光检测羊水干细胞Sox2、Oct-4、Tuj1的表达  样本用40 g/L多聚甲醛室温固定15 min；吸净40 g/L多聚甲醛，PBS洗涤两三次；加入0.5% Triton-100X-PBS室温15 min；吸净0.5% Triton-100X-PBS，PBS洗涤两三次；加入10%BSA-PBS室温封闭15 min；PBS稀释一抗：Oct-4(1∶400)；Sox2(1∶400)；Tuj1(1∶200)；吸净封闭液，分别加入稀释好的一抗，4 ℃湿孵过夜；PBS洗涤两三次，按照1∶400的比例用PBS稀释荧光标记的二抗，吸尽洗涤液，加入稀释好的二抗，常温避光孵育2 h；PBS避光洗涤两三次，PBS稀释DAPI(100 mg/L)，吸尽洗涤液，加入稀释好的DAPI常温孵育5 min；PBS避光洗涤两三次，吸净洗涤液体，室温避光晾干，荧光抗衰减封固剂封固；荧光显微镜下观察。

1.4.3  细胞计数  免疫荧光染色后选取6个样本，每个样本随机选取5个视野，计数10倍镜视野下Sox2、Oct-4、Tuj1阳性的细胞数目，计算Sox2、Oct-4、Tuj1阳性细胞数目与DAPI阳性细胞数目的比值，共30个视野求平均值。

1.4.4  RT-PCR检测羊水干细胞Oct-4、Sox2、c-Kit、Nestin、Tuj1的表达  将上述分选的羊水干细胞(检测干性标记物的表达用第5代和第30代羊水干细胞，检测Tuj1的表达用第3，5，8，12，15，19，21，27，30代羊水干细胞)消化、离心去上清，并进行细胞计数，用传统RNA提取方法一般需要1×10⁶个细胞；在离心去上清后的细胞中加入 1 mL Trizol，吹打混匀至液体澄清且无细胞团块，移入  1.5 mL离心管中；每加入1 mL Trizol，就按比例加入200 μL氯仿，颠倒振荡混匀15 s，室温静置5 min；4 ℃ 12 000×g离心15 min，吸取上层的水相(400-500 μL)，转入另一个1.5 mL EP管；加入0.5 mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10 min；4 ℃ 12 000×g离心10 min，弃上清，加入1 mL体积分数为75%乙醇，轻轻洗涤沉淀；4 ℃     7 500×g离心5 min，弃上清，晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解；吸取1.0-2.0 μg RNA，使用Invitrogen的反转录试剂盒获取PCR的模板cDNA；将获取的模板cDNA通过PCR试剂盒进行扩增，PCR引物的设计合成及参数的设定参见文献[17-18]；电泳及图像扫描：取PCR产物6 μL，用2%琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色，在Image Master VDS-CL上扫描，目标基因的相对表达含量为目的基因及内参基因的电泳条带灰度积分比值。各基因引物序列见表1。

1.4.5  羊水干细胞悬滴培养  取传代后两三天的羊水干细胞，PBS洗2次，加入0.25%胰酶37 ℃消化两三分钟，镜下观察到细胞变圆时加入含体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基终止消化并用吸管反复吹打，使细胞充分脱壁，收集细胞悬液，离心去上清，细胞计数，用羊水干细胞增殖培养基(α-MEM培养基+体积分数为15%胎牛血清+1%谷氨酸+18%ChangB+2% ChangC)重悬羊水干细胞，使每40 μL培养基内包含3 000-4 000个细胞。将羊水干细胞悬液接种于直径60 mm的培养皿盖上，每滴液体控制在40 μL，将盖子翻转并放置在充满PBS的培养皿上，每隔2 d半量换液^[19-21]，每日在显微镜下观察拟胚体的形成，用免疫荧光染色观察胚胎干细胞标记物Oct-4的表达。

1.4.6  羊水干细胞向神经元方向诱导分化  将分选后的第3代羊水干细胞用神经干系诱导分化培养基(48.5 mL DMEM/F12、1 mL B27、0.5 mL N2、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)诱导8 d，再将诱导后的羊水干细胞转移至神经元诱导分化培养基(DMEM/F12培养基中添加20 μg/L脑源性神经营养因子和20 μg/L神经营养因子3)诱导分化 6 d，隔天半量换液^[22]。采用免疫荧光染色观察Neuro D、Tuj1的表达。

1.5  主要观察指标  ①免疫荧光检测羊水干细胞Sox2、Oct-4、Tuj1的表达；②RT-PCR检测羊水干细胞Oct-4、Sox2、c-Kit、Nestin、Tuj1的表达；③羊水干细胞悬滴培养4 d拟胚体的形成情况；④免疫荧光染色检测羊水干细胞向神经元方向诱导分化不同时间Neuro D、Tuj1的表达。

1.6  统计学分析  计量资料以x(_)±s表示，所有数据输入SPSS 17.0进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

该研究通过羊水干细胞的获取、鉴定、培养和诱导分化，为神经元再生的替代研究找寻新的细胞库，为羊水干细胞向神经性耳聋的应用提供依据。

该研究结果提示，羊水干细胞多次传代并不影响其干性。免疫荧光实验发现羊水干细胞具有向神经元样细胞定向分化的特性。羊水中的细胞为胎儿来源，可能是较成体干细胞更原始的一类细胞，更接近胚胎干细胞的全能    性^{[8-9，24-25]}，较成人骨髓或脂肪来源间充质干细胞具有更强的体外增殖分化能力，羊水干细胞具有明显的优越性。

早期羊水干细胞表达成熟神经元标记物Tuj1，但缺乏典型的神经元形态特征。与以往的单一分化模式或其他诱导方式有所区别^[26]，课题组采用两阶段分化方法，稳定地建立了羊水干细胞向神经元样细胞分化模式。首先，用碱性成纤维细胞生长因子将羊水干细胞向神经干系诱导分化，碱性成纤维细胞生长因子对神经外胚层的细胞具有强烈的促增殖作用，是早期维持神经前体细胞存活与发展的重要细胞因子。当大部分羊水干细胞表达神经干系标记物Neuro D时，再经脑源性神经营养因子、神经营养因子3诱导其向神经元方向分化，经诱导过后的羊水干细胞形态发生了明显改变，具有神经元样细胞的形态特征。因此，该研究建立的稳定分化体系适合于神经元再生研究。

国外学者曾采用其他方法进行羊水干细胞诱导分化。MOSCHIDOU等^[26]在人胚胎干细胞培养基中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠后，发现c-kit阳性人早孕羊水干细胞可完全重组为多能干细胞。这些细胞与人胚胎干细胞共有82%的转录体同源性，能够在体外形成拟胚体，长期传代后仍保持遗传稳定性、关键多能干细胞因子的蛋白水平表达、高细胞分裂动力学、端粒酶活性、X-失活抑制以及分化为3个胚层谱系的能力。但是这种方法可能导致受体体内形成畸胎瘤，考虑可能与加入丙戊酸钠等有关，这种诱导方法可能不适用于今后的干细胞体内治疗。

移植细胞可以在正常动物体内存活并向多个大脑区域迁移，而移植细胞在缺血大鼠体内则向损伤区迁移。双重免疫染色分析显示，成人羊水干细胞移植后10 d表达未成熟神经元标记，10，30，90 d表达胶质细胞标记。研究证实人羊水细胞有可能存活并整合到成年大鼠脑组织中，可以作为治疗策略的有效干细胞^[27]。2000年KAKISHITA等^[28]首先发现羊水上皮细胞可以合成多巴胺。将羊水上皮细胞移植入帕金森模型大鼠的纹状体，可以促进帕金森大鼠的存活和脑功能的改善。PAN等^[29]用斯普拉-道来(氏)大鼠建立周围神经损伤模型，羊水干细胞通过植入纤维蛋白黏合剂被输送到受损部位，联合高压氧持续治疗7 d，观察发现大鼠神经髓鞘的生成显著增多，运动功能得到明显改善。以上信息提示羊水干细胞可能有促进神经生长的作用，但缺乏具体的实验体系介绍，不利于国内学者特别是耳鼻咽喉科学者参考和开展相关科研工作；另一方面，内耳及听觉方面的研究相对较少。课题组前期研究证实，羊水干细胞接种于基底膜组织来源的内耳干细胞空心球体制备的饲养层上，饲养层细胞表达内耳支持细胞标志物P27^kip1，不添加外源性神经生长因子及神经元信号诱导因子，支持接触三维培养模式下羊水干细胞可以定向分化为功能性神经元，并表达听觉神经元标记物GATA-3。内耳干细胞来源的饲养层成功地促进了羊水干细胞向功能性神经元的定向分化，而Wnt信号可能在触发神经发生中起重要作用^[15]。

当然，如何诱导羊水干细胞向特定性质和类型的神经元样细胞分化，以及实现功能性神经元的再生，仍需在这个分化体系的基础上深入探讨和摸索。文中取材的羊水干细胞，如能再用其他神经元的标志物(微管相关蛋白2蛋白、神经丝蛋白等)进行验证，将更具说服力。

综上所述，该研究重点从神经元再生角度出发，建立体外诱导羊水干细胞向神经元样细胞稳定分化的培养方法，说明羊水干细胞可以作为神经元再生修复的稳定细胞库。

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文题释义：

羊水干细胞：羊水是由多种细胞组成的异质细胞群，其中包括胎儿脱落的表皮细胞、呼吸道上皮细胞、消化道和泌尿道等体腔管道的脱落细胞、羊膜脱落细胞等。羊水中包含有向内、中、外3个胚层分化潜能的干细胞，约占1%，近年来研究发现羊水干细胞在体外通过特殊的诱导微环境能够分化成多种不同类型的细胞，使羊水来源干细胞成为干细胞研究的一个新热点。

悬滴培养：与传统的二维培养模式不同，悬滴培养提供的三维环境有利于促进各种干细胞的增殖与分化，可以使细胞聚集，相互紧密接触，从而促进细胞之间的相互作用，进而提高或增强干细胞的生物学功能。羊水干细胞悬滴培养可形成拟胚体结构，具有较强的分化潜能，有助于提高定向诱导分化效率。

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羊水干细胞在许多方面与间充质干细胞相似，表达表面标记CD105、CD29、CD44和表面免疫抗原MHCⅠ类，而非MHCⅡ类。新近研究发现，人来源羊水干细胞具有免疫调节功能。人来源羊水干细胞不表达HLA-DR、DP或DQ(MHCⅡ类)，提示羊水干细胞具有低或可忽略的免疫原性。另一项研究表明，羊水干细胞可以抑制由植物血凝素和抗CD3单抗诱导的外周血单核细胞的增殖。经c-Kit筛选的羊水干细胞，可通过一些未知的可溶性因子抑制淋巴细胞活化。此外，其他课题组的研究证实，羊水干细胞对缺血性疾病和主动脉移植物血管病有治疗作用(免疫调节)。因此，在免疫调节方面，羊水干细胞的免疫功能和治疗潜力的相关机制，仍有待深入研究。

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