慢病毒介导睫状神经营养因子基因修饰嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1723

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (17): 2709-2715.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1723

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慢病毒介导睫状神经营养因子基因修饰嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤

马洁华¹，张丹²，霍艳丽¹，魏亚伟¹，孙琳¹，赵宇¹

¹河北北方学院人体解剖学教研室，河北省张家口市 075000；²河北张家口市第一医院口腔科，河北省张家口市 075000

修回日期:2019-01-22 出版日期:2019-06-18 发布日期:2019-06-18
通讯作者: 赵宇，博士，副教授，河北北方学院人体解剖学教研室，河北省张家口市 075000
作者简介:马洁华，女，1980年生，河北省石家庄市人，2013年河北医科大学毕业，硕士，讲师，主要从事脑损伤修复方面的研究。
基金资助:
河北省卫生计生委医学科学研究项目(20180809)，项目负责人：马洁华；河北省教育厅重点项目(ZD2016094)，项目负责人：赵宇

Lentiviral-mediated transplantation of olfactory ensheathing cells modified by ciliary neurotrophic factor for treatment of spinal cord injury

Ma Jiehua¹, Zhang Dan², Huo Yanli¹, Wei Yawei¹, Sun Lin¹, Zhao Yu¹

¹Department of Anatomy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China; ²Department of Stomatology, the First Hospital of Zhangjiakou, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China

Revised:2019-01-22 Online:2019-06-18 Published:2019-06-18
Contact: Zhao Yu, MD, Associate professor, Department of Anatomy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China
About author:Ma Jiehua, Master, Lecturer, Department of Anatomy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China
Supported by:
the Medical Research Project of Hebei Provincial Health and Family Planning Commission, No. 20180809 (to MJH); and the Key Project of Hebei Provincial Department of Education, No. ZD2016094 (to ZY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
睫状神经营养因子：作为一种神经营养因子，对颅内损伤后视神经纤维的再生具有关键作用，可通过释放有丝分裂因子，促进有丝分裂后神经元的存活以及未成熟背根神经节神经元的发生与分化；此外，过表达睫状神经营养因子对于脊髓损伤也具有一定的保护作用。
嗅鞘细胞：是一种特殊的胶质细胞，具有神经营养、抑制胶质增生等作用，为轴突生长提供了适宜的环境，能够促进中枢神经元再生。嗅鞘细胞移植用于治疗脊髓损伤已经多有报道，但其效果有限以及作用机制尚不清晰，同时也存在一些不足之处，如目前无论是动物实验或是临床试验主要都是嗅球源性嗅鞘细胞，需要加大嗅黏膜源性嗅鞘细胞的研究应用力度，解决来源问题或者建立嗅鞘细胞系为后续的研究提供便捷。

摘要
背景：以往研究证实，睫状神经营养因子与嗅鞘细胞单独应用均对脊髓损伤具有一定的治疗作用，但两者联合应用是否有更好的治疗效果尚未见报道。
目的：慢病毒介导睫状神经营养因子基因修饰嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓损伤的作用及其相关机制。
方法：①体外实验：实验分为4组，对照组进行脊髓神经元细胞单独培养，模型组进行脊髓神经元细胞单独培养，正常嗅鞘细胞共培养组采用Transwell小室进行脊髓神经元细胞与正常嗅鞘细胞共培养，过表达嗅鞘细胞共培养组采用Transwell小室进行脊髓神经元细胞与睫状神经营养因子过表达嗅鞘细胞共培养，后3组给予海仁藻酸建立神经元细胞损伤模型。共培养12 h后，采用CCK8法检测细胞活力，qRT-PCR与Western blot检测脊髓神经元细胞中BAX、BCL-2、Caspase3、CNTF的表达；②体内实验：实验分为4组，假手术组、模型组、治疗组、联合治疗组，后3组采用改良Allen’s重物打击法制作脊髓损伤大鼠模型，造模1周后，治疗组、联合治疗组分别在损伤区上、下1 mm处各注射5 µL嗅鞘细胞悬液或睫状神经营养因子过表达嗅鞘细胞悬液，假手术组与模型组大鼠依照同样的方法注射等量培养基；③治疗后4周，采用BBB评分与爬网格实验评估大鼠运动能力、苏木精-伊红染色检测脊髓损伤的病理进展、qRT-PCR与Western blot检测脊髓组织中BAX、BCL-2、Caspase3、CNTF的表达。
结果与结论：①睫状神经营养因子基因修饰的嗅鞘细胞能显著抑制细胞损伤以及脊髓损伤(P < 0.001)；显著提高睫状神经营养因子的表达水平(P < 0.01)以及显著降低凋亡相关分子BAX、BCL-2、Caspase3的表达水平(P < 0.01)；②睫状神经营养因子基因修饰的嗅鞘细胞移植能够改善脊髓损伤引起的运动功能下降，其机制可能与下调BAX、BCL-2、Caspase3表达，降低脊髓神经元细胞凋亡相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4848-6893(赵宇)

关键词: 脊髓损伤, 嗅鞘细胞, 脊髓神经元细胞, 睫状神经营养因子, 神经元细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have confirmed that both ciliary neurotrophic factor and olfactory ensheathing cells have a certain therapeutic effect on spinal cord injury, but there is no report on whether their combination treatment has a better therapeutic effect.
OBJECTIVE: To explore the effect of lentiviral-mediated transplantation of olfactory ensheathing cells modified with ciliary neurotrophic factor gene in rats with spinal cord injury and its related mechanisms.
METHODS: (1) In vitro experiment: There were four groups in the in vitro experiment: spinal cord neurons in control group and model group were cultured alone, while in overexpression co-culture group and normal co-culture group, Transwell chamber was used to establish the co-culture model of spinal cord neurons and olfactory ensheathing cells modified by ciliary neurotrophic factor gene or not. Alginate was given to damage the cells in the latter three groups. After 12 hours of co-culture, cell counting kit-8 assay was used to detect cell viability; qRT-PCR and western blot were used to detect the expression of BAX, BCL-2, Caspase 3 and ciliary neurotrophic factor in spinal neurons. (2) In vivo experiment: There were four groups in the in vivo experiment: sham operation group, model group, treatment group, and combination treatment group. Modified Allen’s method was used to make the rat model of spinal cord injury in the latter three groups. At 1 week after modeling, 5 µL of olfactory ensheathing cell suspension or ciliary neurotrophic factor overexpressing olfactory ensheathing cell suspension was injected 1 mm above and below the injured site in the treatment and combination treatment groups, respectively; similarly, the same volume of culture medium was given in the sham operation and model groups. At 4 weeks after treatment, Basso, Beattie and Bresnahan score and grid-climbing test were conducted to evaluate the motor ability of rats; hematoxylin-eosin staining was used to detect the pathological progression of spinal cord injury; and qRT-PCR and western blot were used to detect the expression of BAX, BCL-2, Caspase 3 and ciliary neurotrophic factor in spinal cord tissues.
RESULTS AND CONCLUSION: Olfactory ensheathing cells modified with ciliary neurotrophic factor gene could significantly alleviate cell injury and spinal cord injury (P < 0.001), increase the expression of ciliary neurotrophic factor (P < 0.01) and decrease the expression of apoptosis-related molecules BAX, BCL-2 and Caspase 3 (P < 0.01). To conclude, transplantation of olfactory ensheathing cells modified by ciliary ganglion neurotrophic factor gene can improve the motor function after spinal cord injury, which may be related to the down-regulation of BAX, BCL-2 and Caspase-3 expression and reduction in the apoptosis of spinal cord neurons.

Key words: spinal cord injury, olfactory ensheathing cells, spinal cord neurons, ciliary neurotrophic factor, neuronal apoptosis

中图分类号:

马洁华，张丹，霍艳丽，魏亚伟，孙琳，赵宇. 慢病毒介导睫状神经营养因子基因修饰嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2709-2715.

Ma Jiehua, Zhang Dan, Huo Yanli, Wei Yawei, Sun Lin, Zhao Yu. Lentiviral-mediated transplantation of olfactory ensheathing cells modified by ciliary neurotrophic factor for treatment of spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2709-2715.

图/表（结果） 2

2.1 荧光定量PCR与蛋白免疫印迹法验证睫状神经营养因子过表达稳定细胞株 稳定过表达组嗅鞘细胞中睫状神经营养因子mRNA显著升高(P < 0.001)，睫状神经营养因子蛋白表达量显著增加(P < 0.001)，见图1。

2.2 CCK8检测睫状神经营养因子过表达嗅鞘细胞对脊髓神经元细胞的保护作用 采用Transwell小室建立嗅鞘细胞与脊髓神经元细胞共培养体系，并于脊髓神经元细胞中加海仁藻酸制作细胞损伤模型，24 h后加入CCK8溶液，测定细胞活力。与对照组相比，海仁藻酸可以显著抑制脊髓神经元细胞的活性(P < 0.001)；嗅鞘细胞与脊髓神经元细胞共培养可以抑制海仁藻酸对脊髓神经元细胞的损伤(P < 0.01)；嗅鞘细胞过表达睫状神经营养因子以后对脊髓神经元细胞损伤的抑制效果更显著(P < 0.01)，见图2。

2.3 睫状神经营养因子过表达嗅鞘细胞对脊髓损伤的影响 采用改良Allen’s重物打击法制作脊髓损伤模型，随后按照不同的实验分组进行嗅鞘细胞移植。BBB评分结果显示，脊髓损伤模型建立之后，大鼠的运动功能几乎丧失(P < 0.001)；嗅鞘细胞移植4周后，动物后肢运动能力得到了一定程度的恢复(P < 0.01)；与正常嗅鞘细胞组相比，睫状神经营养因子过表达嗅鞘细胞移植后动物运动能力显著改善(P < 0.05)。爬网格实验结果也证明，嗅鞘细胞移植能够显著改善因脊髓损伤丧失的运动能力(P < 0.01)；睫状神经营养因子过表达嗅鞘细胞组大鼠于网格上攀爬的时间更久(P < 0.05)，BBB评分与爬网格实验结果证实睫状神经营养因子过表达嗅鞘细胞更能有效改善因脊髓损伤引起的运动功能下降，具有较好的治疗效果，见图3。

2.4 苏木精-伊红染色检测脊髓损伤的病理进展 与假手术组相比，脊髓损伤组大鼠脊髓出现明显的损伤，表现出大量的空洞；在嗅鞘细胞移植后，脊髓形态得到了一定程度的恢复；在移植过表达睫状神经营养因子的嗅鞘细胞后，脊髓损伤得到了显著性的修复，见图4。

2.5 荧光定量PCR检测脊髓神经元细胞与脊髓组织中BAX、BCL-2、Caspase3、CNTF的mRNA表达 在海仁藻酸致脊髓神经元细胞损伤以及动物脊髓损伤模型中，CNTF mRNA的表达明显下降(P < 0.001)，而细胞凋亡因子BAX、BCL-2、Caspase3的mRNA表达显著升高(P < 0.001)；嗅鞘细胞共培养或移植后，CNTF mRNA的表达得到了一定程度的恢复(P < 0.01)，细胞凋亡因子BAX、BCL-2、Caspase3的mRNA表达明显被抑制(P < 0.01)；在嗅鞘细胞中稳定过表达睫状神经营养因子后，CNTF mRNA表达显著升高(P < 0.01)，细胞凋亡因子BAX、BCL-2、Caspase3的mRNA表达显著下降(P < 0.01)。因此，嗅鞘细胞可能是通过释放CNTF抑制细胞凋亡因子的表达，减轻因脊髓损伤引起的运动功能障碍，见图5。

2.6 蛋白免疫印迹法检测脊髓神经元细胞与脊髓组织中BAX、BCL-2、Caspase3、CNTF的蛋白表达 在海仁藻酸致脊髓神经元细胞损伤以及动物脊髓损伤模型中，CNTF的蛋白表达明显降低(P < 0.001)，细胞凋亡相关分子BAX、BCL-2、Caspase3的蛋白表达显著升高(P < 0.001)；嗅鞘细胞共培养或移植后，CNTF的蛋白表达得到了一定程度的恢复(P < 0.01)，细胞凋亡因子BAX、BCL-2、Caspase3蛋白的表达明显被抑制(P < 0.01)；在嗅鞘细胞中稳定过表达睫状神经营养因子后，CNTF的蛋白表达显著升高(P < 0.01)，细胞凋亡因子BAX、BCL-2、Caspase3的蛋白表达显著下降(P < 0.01)。因此，嗅鞘细胞可能是通过CNTF抑制脊髓神经元的凋亡而对脊髓损伤起到了一定程度的保护作用，见图6。

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引言

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统疾病，在世界范围内都是一种难以治愈的疾病，脊髓损伤的不同位置和程度可导致不同程度的残疾，从感觉或运动功能的部分丧失到受伤部位以下的完全瘫痪，以及急性和慢性并发症，威胁到患者的生命健康^[1]。脊髓损伤患者在生理以及心理上都承受着巨大的压力，随着脊髓损伤发病率的逐年升高，给社会的经济也带来了沉重的负担^[2-3]。根据脊髓损伤的流行病学调查，引发脊髓损伤最常见的原因是高空坠落以及交通事故^[4]。目前临床上用于治疗脊髓损伤的方式有传统药物治疗、手术治疗、基因治疗以及细胞治疗，然而单一因素疗法并不能完全修复脊髓损伤，只能部分缓解症状并减少并发症^[5]。

睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)属于白细胞介素6细胞因子家族成员，是中枢神经系统和外周神经系统具有广泛作用的神经细胞因子^[6]。睫状神经营养因子作为一种神经营养因子，促进颅内损伤后视神经纤维的再生^[7-8]；在周围神经再生中也具有关键作用^[9]；可通过释放有丝分裂因子，促进有丝分裂后神经元的存活以及未成熟背根神经节神经元的发生与分化^[10-11]。此外，睫状神经营养因子水平上调对于脊髓损伤也具有保护作用^[12]。因此，睫状神经营养因子在缓解神经系统损伤中具有重要作用，但具体的机制尚不明确。

嗅鞘细胞是一种特殊的胶质细胞，具有神经营养、抑制胶质增生等作用，为轴突生长提供了适宜的环境，能够促进中枢神经元再生^[13]。嗅鞘细胞移植用于治疗脊髓损伤已经多有报道，但其效果有限以及作用机制尚不清晰^[14-16]，同时也存在一些不足之处，如目前无论是动物实验或是临床试验主要都是嗅球源性嗅鞘细胞，需要加大嗅黏膜源性嗅鞘细胞的研究应用力度，解决来源问题或者建立嗅鞘细胞系为后续的研究提供便捷。此外，异体移植可能存在免疫排斥而给患者带来不必要的痛苦，因此该研究采用嗅鞘细胞与脊髓神经元细胞共培养以及睫状神经营养因子基因修饰嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤，以期能更好的发挥神经元再生能力并阐述具体的分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学与动物学实验分析。

1.2 时间及地点 实验于2016年8月至2018年8月在河北北方学院形态学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 6周龄健康雄性Wistar大鼠40只，体质量200-220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠在SPF级环境下饲养，采用12 h交替的光暗周期，自由饮食。实验中对动物的处置严格遵循动物伦理学标准进行。

1.3.2 实验细胞 大鼠原代嗅鞘细胞购自武汉普诺赛公司，货号CP-R113；大鼠脊髓神经元细胞购自Sciencell公司，货号R1590。

1.3.3 实验试剂 大鼠嗅鞘细胞专用完全培养基(武汉普诺赛公司)；大鼠脊髓神经元细胞专用培养基(Sciencell公司)；睫状神经营养因子过表达慢病毒(汉恒生物)；BAX、BCL-2、Caspase3、CNTF抗体(Abcam公司)；BAX、BCL-2、Caspase3、CNTF引物于NCBI进行在线设计，由上海生工合成；Transwell小室(Corning公司)；CCK8试剂盒(东仁化学)；TUNEL染色试剂盒(碧云天公司)；海仁藻酸(派克生物)。

1.3.4 实验仪器 酶标仪、超净工作台、细胞培养箱、涡旋振荡器、低温高速离心机、PCR仪、电泳仪、转膜仪、全自动脱水机。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠嗅鞘细胞和大鼠脊髓神经元细胞的培养及鉴定

1.4.2 睫状神经营养因子稳定过表达嗅鞘细胞株的建立 于嗅鞘细胞中加入过表达对照慢病毒或睫状神经营养因子过表达慢病毒，并设立空白对照组。病毒感染6 h后，加入嘌呤霉素，2 d换液1次，待空白对照组细胞全部死亡，即初步获得稳定细胞株。继续使用低浓度嘌呤霉素培养基培养2周，剩余的细胞即为稳定细胞株，进行扩大培养，培养液仍包含嘌呤霉素。

1.4.3 嗅鞘细胞与脊髓神经元细胞共培养 实验分组为4组：①对照组：脊髓神经元细胞单独培养；②模型组：脊髓神经元细胞单独培养+海仁藻酸干预；③正常嗅鞘细胞共培养组：脊髓神经元细胞与正常嗅鞘细胞共培养+海仁藻酸干预；④过表达嗅鞘细胞共培养组：脊髓神经元细胞与睫状神经营养因子过表达嗅鞘细胞共培养+海仁藻酸干预。

采用Transwell小室建立嗅鞘细胞与脊髓神经元细胞共培养模型。脊髓神经元细胞接种于上室，细胞浓度为1×10⁹ L^-1，接种量为200 μL，不同表达的嗅鞘细胞接种于下室，细胞浓度为1×10⁹ L^-1，接种量为50 μL。采用海仁藻酸建立神经元细胞损伤模型。将海仁藻酸加入上室的脊髓神经元细胞中，并与嗅鞘细胞进行共培养，海仁藻酸的终质量浓度为100 mg/L，共培养12 h后消化细胞接种于96孔板，24 h后加入10 μL CCK8于培养箱孵育1 h，检测脊髓神经元细胞的活力。根据测得的活力值，判断嗅鞘细胞在体外对脊髓神经元细胞损伤是否具有保护作用。

1.4.4 脊髓损伤模型的建立 采用改良Allen’s重物打击法制作脊髓损伤大鼠模型。实验前用水合氯醛麻醉大鼠，大鼠以俯卧位固定，对背部切口处进行剪毛，消毒，通过摸肋骨的方法，定位T₁₀为中心，做长约4 cm的切口，依次切开各皮质组织，暴露出T₁₀棘突，用微型咬骨钳咬除T₁₀棘突及椎板，将T₁₀段脊髓暴露。采用改良的Allen’s装置，先将一打击面直径约3.5 mm圆形薄塑料垫片置于T₁₀脊髓表面，再用重10 g铁锤从30 mm高处自由落下，撞击硬膜囊，造成T₁₀段脊髓冲击伤，撞击后进行消毒，缝合，术后注射青霉素防止感染。

1.4.5 细胞移植 40只Wistar大鼠随机分为4组，每组10只。假手术组：单纯暴露T₁₀棘突不进行击打；模型组：暴露T₁₀棘突并进行击打；治疗组：脊髓损伤+正常嗅鞘细胞移植；联合治疗组：脊髓损伤+睫状神经营养因子过表达嗅鞘细胞移植。收集细胞前，弃去培养基，PBS清洗，加入不含嘌呤霉素的培养基进行重悬，细胞浓度为5×10¹⁰ L^-1，改良Allen’s重物打击法制作脊髓损伤模型1周后，分别在损伤区上、下1 mm处各注射5 µL与实验分组相对应细胞悬液。假手术组与模型组实验动物依照同样的方法注射等量培养基。

1.4.6 BBB评分与行为学检测 细胞移植前1 d、注射后第4周，将大鼠放入开口箱子，轻敲箱壁，使其爬行，观察动物运动距离，臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况，每只大鼠观察15 min，对各组大鼠的运动能力进行BBB21分测试^[17]，评价各组大鼠脊髓损伤程度；并于细胞注射前1 d以及注射后第4周对大鼠进行负重，置于网格上，网格间距为2.5 cm，每只大鼠观察5 min，观察各组大鼠爬网格协调性及负重能力。

1.4.7 苏木精-伊红染色检测脊髓损伤程度 各组动物均于细胞移植4周后处死，经40 g/L多聚甲醛心脏灌注固定取脊髓组织样本，PBS清洗后置于40 g/L多聚甲醛中固定，再行脱水、包埋、切片等步骤，行苏木精-伊红染色，镜下观察各组脊髓瘢痕和空洞的面积，评价脊髓损伤程度。

1.4.8 荧光定量PCR检测脊髓神经元细胞与脊髓组织中BAX、BCL-2、Caspase3、CNTF mRNA表达 Trizol法提取脊髓神经元细胞与脊髓组织RNA，检测RNA浓度、质量与RNA的完整性。根据反转录试剂盒操作说明书将RNA反转录成cDNA，进行荧光定量PCR检测相关基因mRNA的表达，检测的Ct值采用2^-^??Ct法计算，引物序列见表1。

1.4.9 蛋白免疫印迹法检测脊髓神经元细胞与脊髓组织中BAX、BCL-2、Caspase3、CNTF的蛋白表达 取脊髓神经元细胞以及脊髓组织，提取蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，计算最终的上样量。蛋白样品高温变性后用SDS-PAGE凝胶进行分离，然后将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上；在室温下用5%BSA封闭2 h，然后分别与BAX、BCL-2、Caspase3、CNTF抗体于4 ℃孵育过夜；去除一抗，PBST洗涤，二抗孵育1 h，PBST洗涤，用ECL发光液进行孵育，X射线胶片于暗室中进行曝光显影。

1.5 主要观察指标 ①睫状神经营养因子在体外对脊髓神经元细胞增殖的影响；②各组大鼠行为学变化；③各组大鼠脊髓组织的病理变化；④各组大鼠BAX、BCL-2、Caspase3、CNTF的表达变化。

1.6 统计学分析 实验数据均用x(_)±s表示，采用SPSS 12.0进行数据分析，进行student’s t 检验或ANOVA分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

脊髓损伤属于神经损伤的一种，往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，伴有极为严重的致残率，对患者的生命造成威胁^[18]。脊髓损伤分为原发性和继发性损伤两种，原发性损伤主要是由暴力损伤而引起，可能会直接造成神经元、胶原的即刻性死亡。细胞凋亡是一种常见的生命现象，脊髓发生损伤后，多种因素引发脊髓神经元凋亡，近年来脊髓损伤后的神经修复问题一直是医学界研究的热点和难点，而其凋亡的机制研究受到广泛关注^[19-21]。睫状神经营养因子能维持副交感神经节的存活，分布于脊髓灰质、脊髓白质前索以及星形胶质细胞和神经元^[22]。有证据表明睫状神经营养因子表达于正常大鼠的脊髓中，而通过全反式维甲酸降低睫状神经营养因子的表达导致大鼠神经管发育不全，更有研究发现大鼠在发生脊髓损伤后，损伤局部的脊髓神经元以及星形胶质细胞释放睫状神经营养因子至损伤部位，以促进脊髓运动神经元的存活，以及减少神经元的凋亡与坏死进而参与脊髓的修复过程^[23-26]。近期的研究表明，睫状神经营养因子的表达增加可激活信号通路CNTF-JAK-STAT3，调节细胞核转录因子，下调靶蛋白Caspase-9表达，来抑制细胞凋亡和神经元坏死，从而促进神经元存活，最终实现脊髓损伤大鼠后肢功能改善^[27-28]。嗅鞘细胞是目前能够诱导周围神经长入中枢神经的唯一一种胶质细胞，移植入脊髓后能诱导神经再生以及促进损伤脊髓的功能恢复^[29]。嗅鞘细胞主要位于嗅神经纤维和嗅球外层，是嗅觉系统中主要的非神经元细胞，但与大多数神经元细胞不同的是，嗅鞘细胞具有不断再生的能力，很多研究表明嗅鞘细胞移植可促进脊髓损伤的修复^[30]，其主要抑制脊髓神经元的凋亡而达到治疗的目的^[31]。

该研究通过二维培养的方式建立嗅鞘细胞与脊髓神经元细胞共培养模型，并通过海仁藻酸对脊髓神经元细胞造成损伤，CCK8实验结果证实嗅鞘细胞可以减轻海仁藻酸对脊髓神经元细胞的损伤；过表达睫状神经营养因子后，嗅鞘细胞对脊髓神经元细胞的保护作用更为明显。荧光定量PCR与蛋白免疫印迹实验表明，嗅鞘细胞能够抑制海仁藻酸引起的脊髓神经元细胞凋亡；过表达睫状神经营养因子后，嗅鞘细胞更为显著地抑制凋亡分子的表达。

该研究还通过改良Allen’s重物打击法制作大鼠脊髓损伤模型，并于脊髓损伤1周后在损伤部位注射过表达睫状神经营养因子的嗅鞘细胞，以观察其对大鼠脊髓损伤的治疗作用。BBB评分以及爬网格实验证实脊髓损伤模型建立是成功的，注射嗅鞘细胞4周后，大鼠行动能力得到一定程度的恢复，睫状神经营养因子过表达嗅鞘细胞移植组的改善效果更显著；苏木精-伊红染色结果表明睫状神经营养因子过表达嗅鞘细胞移植能够更好地减少脊髓瘢痕和缩小空洞面积；荧光定量与蛋白免疫印迹实验结果说明睫状神经营养因子过表达显著抑制凋亡相关分子的表达，即嗅鞘细胞过表达睫状神经营养因子后，可通过抑制脊髓神经元凋亡，从而减轻脊髓损伤的症状。

综上而言，体内、体外实验结果表明，睫状神经营养因子过表达的嗅鞘细胞可通过抑制脊髓神经元凋亡从而减轻脊髓损伤程度。然而，其中具体的分子作用机制还需进一步的研究去阐述。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

慢病毒介导睫状神经营养因子基因修饰嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤

Lentiviral-mediated transplantation of olfactory ensheathing cells modified by ciliary neurotrophic factor for treatment of spinal cord injury

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