依维莫司增强阿霉素抑制骨肉瘤干细胞的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0891

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
干细胞表面标志物CD133：是一种独特的干细胞标志，分子质量为120 ku。随着研究的不断深入，越来越多的肿瘤干细胞表面标志物被确立，并应用于肿瘤干细胞的鉴别与分选，主要包括CD133、CD24、CD44、CD90、上皮细胞黏附分子(EpCAM)等。利用CD133肿瘤干细胞标志物为筛选标记，从骨肉瘤细胞系MG63细胞中分离出CD133⁺骨肉瘤干细胞。
依维莫司：是mTOR信号通路的有效抑制剂，属于雷帕霉素衍生物的一种。依维莫司能够抑制细胞中mTOR信号通路的磷酸化水平，并随药物浓度的增加抑制作用越明显。依维莫司抑制骨肉瘤干细胞mTOR信号通路，可能会增强阿霉素对骨肉瘤干细胞增殖和侵袭的抑制能力。

摘要
背景：阿霉素能够抑制骨肉瘤细胞的增殖，但是阿霉素对骨肉瘤干细胞的作用以及依维莫司联合阿霉素对骨肉瘤干细胞的作用未见报道。
目的：研究mTOR通路抑制剂依维莫司联合骨肉瘤化疗一线药物阿霉素对骨肉瘤干细胞增殖及侵袭的影响。
方法：用免疫磁珠分选法分离人骨肉瘤细胞株MG63中的CD133⁺骨肉瘤干细胞。MTT检测0，0.1，0.2，0.4 mg/L阿霉素以及0.2 mg/L阿霉素+20 μmol/L 依维莫司对骨肉瘤干细胞增殖的影响。Transwell小室检测0.2 mg/L阿霉素和0.2 mg/L阿霉素+20 μmol/L 依维莫司对骨肉瘤干细胞侵袭的影响。Western Blot检测0.2 mg/L阿霉素和0.2 mg/L阿霉素+20 μmol/L 依维莫司对骨肉瘤干细胞增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶蛋白表达的影响。
结果与结论：①阿霉素能在一定质量浓度下抑制骨肉瘤干细胞的增殖，且依维莫司联合阿霉素较单独使用阿霉素时明显抑制骨肉瘤干细胞的增殖，说明依维莫司能够增强阿霉素对骨肉瘤干细胞增殖的抑制作用；②与单独使用阿霉素比较，依维莫司联合阿霉素作用于骨肉瘤干细胞后侵袭细胞数明显减少；③依维莫司联合阿霉素显著抑制骨肉瘤干细胞增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶蛋白的表达，提示依维莫司能够增强阿霉素抑制骨肉瘤干细胞增殖与侵袭的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-8750-699X(张斌)

关键词: 依维莫司, 阿霉素, MG63, 骨肉瘤干细胞, 增殖, 侵袭, 增殖细胞核抗原, 基质金属蛋白酶9, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Adriamycin can inhibit the proliferation of osteosarcoma cells, but the effects of adriamycin alone or combined with everolimus on osteosarcoma stem cells are not well documented.
OBJECTIVE: To explore the effects of adriamycin combined with everolimus, a mTOR inhibitor, on the proliferation and invasion of osteosarcoma stem cells.
METHODS: CD133⁺ osteosarcoma stem cells were separated from MG63 cells by flow cytometer. We first used MTT method to detect the proliferation of osteosarcoma stem cells treated with adriamycin at the concentrations of 0, 0.1, 0.2, 0.4 mg/L. Next, we chose an appropriate concentration of adriamycin (0.2 mg/L) combined with 20 μmol/L everolimus to act on CD133⁺ osteosarcoma stem cells. MTT and Transwell method were then used to detect the cell proliferation and invasion after intervention with 0.2 mg/L adriamycin alone or combined use of adriamycin (0.2 mg/L) and everolimus (20 μmol/L), respectively. Meanwhile, the expression levels of proliferating cell nuclear antigen and matrix metalloproteinase 9 in the osteosarcoma stem cells were detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: MTT results showed that adriamycin and especially adriamycin combined with everolimus could inhibit the proliferation of CD133⁺ osteosarcoma stem cells. Transwell assay results showed that adriamycin combined with everolimus could inhibit the invasion of osteosarcoma stem cells. Western blot results showed that adriamycin combined with everolimus significantly decreased the levels of proliferating cell nuclear antigen and matrix metalloproteinase 9 compared with the control group. These findings suggest that everolimus can enhance the ability of adriamycin against the proliferation and invasion of osteosarcoma stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Osteosarcoma, TOR Serine-Threonine Kinases, Epirubicin, Tissue Engineering

中图分类号:

张斌，杨微，贺宝霞，杜娟，于卫江，林晓贞，田锋奇. 依维莫司增强阿霉素抑制骨肉瘤干细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 663-667.

Zhang Bin, Yang Wei, He Baoxia, Du Juan, Yu Weijiang, Lin Xiaozhen, Tian Fengqi. Everolimus enhances the ability of adriamycin against the proliferation and invasion of osteosarcoma stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 663-667.

图/表（结果） 4

参考文献

[1] 姚阳.骨肉瘤的临床与研究现状[J]. 肿瘤,2005,25(3):201-204.

[2] 燕太强,梁伟民,郭卫.骨肉瘤的诊疗和研究进展[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2012,6(17):4988-4990.

[3] 管忠震,喻俪华,刘明镜,等.以阿霉素为主的联合化疗方案治疗恶性肿瘤227例临床观察[J].癌症,1988,7(5):349-352.

[4] Kaya M. Prognostic Factors for Osteosarcoma Patients//Osteosarcoma. Tokyo: Springer. 2016:73-79.

[5] Toguchida J. Genetics of Osteosarcoma//Osteosarcoma. Tokyo: Springer. 2016:3-17.

[6] Mohseny AB, Szuhai K, Romeo S, et al. Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2. J Pathol. 2009; 219(3):294-305.

[7] 邱俊骏,施鑫,赵建宁,等.骨肉瘤化疗耐药相关基因的研究进展[J]. 医学研究生学报,2005,8(2):164-166.

[8] Basu-Roy U, Basilico C, Mansukhani A. Perspectives on cancer stem cells in osteosarcoma. Cancer Lett. 2013;338(1): 158-167.

[9] Mutsaers AJ, Walkley CR. Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells. Bone. 2014;62:56-63.

[10] Laplante M, Sabatini DM. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 2012;149(2):274-293.

[11] Grabiner B, Wagle N, Allen EV,et al. Abstract PR04: mTOR mutations in cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 2015; 14(7 Supplement):PR04-PR04.

[12] Johnson SC, Rabinovitch PS, Kaeberlein M. mTOR is a key modulator of ageing and age-related disease. Nature. 2013; 493(7432):338-345.

[13] 周荣平,廖小明,矢庆明,等.齐墩果酸通过 mTOR 信号通路促进骨肉瘤细胞凋亡[J].中华中医药杂志, 2016, 31(1): 222-225.

[14] 马建辉.肾癌细胞mTOR信号通路异常与依维莫司作用机制[J].中华泌尿外科杂志, 2013, 34(3): 229-231.

[15] 张旭.转移性肾细胞癌依维莫司中外研究安全性比较及不良反应管理经验[J].中华泌尿外科杂志, 2013, 34(6): 470-473.

[16] 陈洪菊,屈艺,母得志. mTOR信号通路的生物学功能[J].生命的化学, 2010, 30(4): 555-561.

[17] 陈豫,褚倩,郭娟,等.依维莫司对人非小细胞肺癌细胞系A549放射增敏作用[J].医药导报, 2014,33(12):1541-1544.

[18] Mailand N, Gibbs-Seymour I, Bekker-Jensen S. Regulation of PCNA-protein interactions for genome stability. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013;14(5):269-282.

[19] Kubota T, Nishimura K, Kanemaki MT, et al. The Elg1 replication factor C-like complex functions in PCNA unloading during DNA replication. Mol Cell. 2013;50(2):273-280.

[20] 陆平,李云鹏,高岩,等.原癌基因Pim-3在胰腺癌组织中的表达及其与胰腺癌细胞增殖的相关性[J].癌变•畸变•突变,2014, 26(1): 45-48.

[21] 张凤梅,李胜水,李双标,等. ILK, MMP-9在胰腺癌及其侵袭转移中的表达[J].诊断病理学杂志, 2013, 20(4): 236-238.

[22] 李颖智,金海鸿,秦悦洋,等. VEGF, MMP-9 表达水平与骨巨细胞瘤侵袭性相关性[J].中国实验诊断学, 2013, 17(11): 1989-1991.

[23] 孔飞飞,袁海花,王炯轶,等. Foxm1对非小细胞肺癌中MMP-2, MMP-9和迁移侵袭的影响[J].现代肿瘤医学, 2014, 22(8): 1775-1778.

[24] Luetke A, Meyers PA, Lewis I, et al. Osteosarcoma treatment - where do we stand? A state of the art review. Cancer Treat Rev. 2014;40(4):523-532.

[25] 陈楷,吕书军,付东,等.骨肉瘤凋亡与耐药相关机制的研究进展[J]. 中国骨与关节杂志,2015,4(1):45-49.

[26] 朱忠胜,张春林.骨肉瘤干细胞研究现状[J].国际骨科学杂志, 2011,32(5): 296-299.

[27] 郭卫,杨荣利,汤小东,等.成骨肉瘤新辅助化学药物治疗的疗效分析[J].中华医学杂志, 2004, 84(14): 1186-1190.

[28] 司萌.骨肉瘤干细胞及其多药耐药性的体内外相关研究[D]. 济南:山东大学, 2013.

[29] 杨联军,朱立新,包和婧,等.载阿霉素PLGA纳米微球的制备及其对人骨肉瘤MG63细胞的抑制作用[J].实用医学杂志, 2014, 30(4):528-531.

[30] Guo Y, Wu M, Zhao J, et al. Advances in hypoxia microenvironment and chemotherapy-resistant of lung cancer. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2014;17(3):265-268.

[31] 胡蓓蓓,林峰.多药耐药相关蛋白与骨肉瘤化疗耐药相关性[J]. 国际骨科学杂志, 2013, 34(1): 61-63.

[32] 贺昭忠,吴承远.脑胶质瘤多药耐药基因表达及其对化疗药物敏感性[J].齐鲁医学杂志, 2002,17(2): 98-100.

[33] 曹仕琼,李萍,尹太勇,等.姜黄素对人肝癌耐药细胞株Bel7402/ 5-FU多药耐药性的逆转作用[J].世界华人消化杂志,2012, 20(2): 135-139.

[34] 王进,沈靖南.粉防己碱逆转骨肉瘤细胞系多药耐药性的研究[J]. 实用临床医学,2005, 6(7): 7-10.

[35] 郭乔楠,陈意生.骨肉瘤多药耐药的研究进展[J].医学综述,2002, 8(8): 450-452.

[36] 李杨玲,应美丹,杨波,等. Klf-4调控骨肉瘤肿瘤干细胞特性及转移能力的作用研究[C].第八届中国肿瘤学术大会暨第十三届海峡两岸肿瘤学术会议论文汇编, 2014.

[37] 郑联合,张伟,韩涛,等.阿霉素可通过MAPK信号转导通路促进成骨肉瘤细胞凋亡[J].第四军医大学学报,2005,26(12): 1119-1121.

[38] 许庆文,李岩松,朱荷根.大肠癌P53蛋白PCNA和CEA的表达与淋巴结转移的关系[J].华人消化杂志, 1998, 6(3): 244-246.

[39] Stoimenov I, Helleday T. PCNA on the crossroad of cancer. Biochem Soc Trans. 2009;37(Pt 3):605-613.

[40] Paradiso A, Rabinovich M, Vallejo C, et al. p53 and PCNA expression in advanced colorectal cancer: response to chemotherapy and long-term prognosis. Int J Cancer. 1996; 69(6):437-441.

[41] Yu YL, Chou RH, Liang JH, et al. Targeting the EGFR/PCNA signaling suppresses tumor growth of triple-negative breast cancer cells with cell-penetrating PCNA peptides. PLoS One. 2013;8(4):e61362.

[42] Liu Y, Bi T, Wang G, et al. Lupeol inhibits proliferation and induces apoptosis of human pancreatic cancer PCNA-1 cells through AKT/ERK pathways. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2015;388(3):295-304.

[43] 张峻霄,王世阆,姚先莹.增殖细胞核抗原及肿瘤转移抑制基因nm23在外阴鳞状细胞癌的表达及其临床意义[J].海南医学, 2012, 23(10): 1-5.

[44] 孙仁光,刘泽淼.多药耐药基因1和谷胱苷肽-S-转移酶-π在骨软组织肉瘤患者表达及其与化疗耐药关系[J].中国老年学杂志, 2015,35(20):5823-5825.

[45] 孙玉满,杨俊泉,曹渤海,等.早期喉癌手术阴性切缘组织中 PCNA, COX-2表达与肿瘤局部复发的关系[J].临床与实验病理学杂志, 2014, 30(4): 408-410.

[46] 高庆. MMP-2、MMP-9、TIMP-2在人脑胶质瘤中的表达及意义[D].郑州:郑州大学,2010.

引言

骨肉瘤是临床相对常见的恶性肿瘤，多发于少儿或青少年^[1]。随着新型辅助化疗的开展，骨肉瘤患者的5年存活率得到极大的改善^[2]。阿霉素是最早的、也是疗效最为肯定的骨肉瘤一线化疗药物^[3]。骨肉瘤易复发、转移，患者对化疗药物的原发或继发耐药是导致临床治疗失败的主要原因^[4-5]。目前肿瘤化疗的焦点集中在如何逆转肿瘤细胞的耐药性，提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤能力。研究发现，骨肉瘤干细胞的存在是导致骨肉瘤难以治愈、易复发的关键原因^[6]，尤其对常规化疗药物顺铂和阿霉素具有抵抗作用^[7]。骨肉瘤干细胞具有自我更新、强致瘤性、多向分化潜能、产生异质性肿瘤细胞及多重耐药性的能力^[8-9]。如何特异性的针对骨肉瘤干细胞，并以此为基础寻找和发现靶向骨肉瘤干细胞的药物，逆转骨肉瘤干细胞对化疗药物的耐药，对于骨肉瘤的最终治愈具有不可估量的前景和价值。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(phosphati-dylinositol 3-kinase- related kinase，PIKK)蛋白家族，在调节细胞生长、增殖和调控细胞周期等多个方面起到重要作用^[10-12]，特异性靶向抑制mTOR通路可以有效抑制细胞的增殖，促进其凋亡^[13]。依维莫司(everolimus，RAD001)是mTOR信号通路的有效抑制剂，属于雷帕霉素衍生物的一种，目前已被批准上市用于晚期肾癌的治疗^[14-15]。依维莫司能够抑制细胞中mTOR信号通路的磷酸化水平，并随药物浓度的增加抑制作用越明显^[16]。有研究表明抑制mTOR信号通路可能使人肺癌细胞株重新对化疗药物顺铂敏感，能降低肺癌细胞的耐药性，增强顺铂杀伤肿瘤细胞的能力^[17]。因此作者推测，依维莫司抑制骨肉瘤干细胞mTOR信号通路，可能会增强阿霉素对骨肉瘤干细胞增殖和侵袭的抑制能力。

增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内，与细胞DNA合成关系密切^[18-19]，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖活性的常用指标^[20]。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)在肿瘤侵袭过程中起重要调节作用^[21-22]。MMP-9在高浸润能力的肿瘤组织及细胞中高表达，是反映肿瘤侵袭转移能力的一个重要标志^[23]。因此，通过检测PCNA蛋白和MMP-9蛋白的表达水平可间接反映肿瘤增殖和侵袭能力的强弱。

课题旨在研究mTOR信号通路特异性抑制剂依维莫司联合阿霉素共同作用对骨肉瘤干细胞增殖和侵袭的影响及其可能的机制，为临床治疗骨肉瘤提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 材料 阿霉素、二甲基亚砜、噻唑蓝(美国Sigma公司)；人CD133细胞分选试剂盒(德国Miltenyi Biotec公司)；BCA蛋白定量试剂盒、PCNA单克隆抗体、MMP-9单克隆抗体、小鼠抗兔二抗(美国Cell Signaling Tec公司)；GAPDH(上海康成生物工程有限公司)；恒温培养箱(美国Thermo公司)；流式细胞分选仪BD FACSAria Ⅱ，流式细胞仪ACSCalibur(美国Becton Dickinson公司)；多功能酶标仪(德国Miltenyi BioTec公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 CD133⁺骨肉瘤干细胞分选 将培养中的MG63骨肉瘤细胞进行消化、离心、重悬后，按CD133⁺免疫磁珠分选试剂盒说明书操作分离出CD133⁺细胞，继续培养传代，取第4-6代细胞用于实验。应用流式细胞仪测定CD133⁺骨肉瘤干细胞的纯度。

1.3.2 MTT法检测阿霉素及依维莫司联合阿霉素对骨肉瘤干细胞增殖的影响 将CD133⁺骨肉瘤干细胞接种于96孔培养板，每个浓度设3个复孔。细胞贴壁后每孔加入阿霉素，使终质量浓度依次为0，0.1，0.2，0.4 mg/L。培养24 h后，每孔加入5 g/L MTT，继续培养4.5 h，小心吸去培养基，加入150 μL二甲基亚砜，充分溶解后在490 nm波长处检测各孔吸光度值。

取0.2 mg/L阿霉素联合20 μmol/L 依维莫司重复上述实验。

1.3.3 Transwell检测依维莫司联合阿霉素对骨肉瘤干细胞侵袭的影响 骨肉瘤干细胞消化后，用移液器吹打成单细胞悬液，离心收集细胞，加入适量新鲜培养液重悬，调整细胞浓度为2.5×10⁸ L^-1。将Transwell细胞小室放置于24孔板内，上室每孔接种骨肉瘤干细胞2.5×10⁴个(200 μL)，下室加入500 μL含体积分数为10%血清的培养液，同时给予空白对照二甲基亚砜和相应浓度的阿霉素和依维莫司于上下室内，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中孵育，24 h后取出小室，用棉签轻轻拭去上室中的细胞，体积分数为95%的乙醇固定30 min，PBS洗涤3次，再加入0.1%的结晶紫水溶液染色15 min，PBS洗2遍，镜下观察并计数侵袭细胞个数。
1.3.4 Western Blot 检测依维莫司联合阿霉素对骨肉瘤干细胞PCNA、MMP-9蛋白的影响 将骨肉瘤干细胞用冷的PBS洗2次，使用RIPA裂解液裂解细胞，4 ℃、12 000×g离心5 min，取上清。BCA法定量细胞总蛋白浓度，然后进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后将蛋白从胶转移至PVDF膜上，100 V转膜1 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗PCNA、MMP-9及GAPDH抗体(以GAPDH作为内参)，37 ℃孵育2 h，加入HRP标记的二抗，37 ℃孵孵育1 h，然后用镊子轻轻地将PVDF膜放置于曝光盒里，于暗室内压片并冲印成像。胶片用凝胶成像系统进行扫描与数据采集。

1.4 主要观察指标 ①分选后人骨肉瘤细胞MG63中CD133⁺细胞的纯度；②阿霉素溶液及依维莫司联合阿霉素对骨肉瘤干细胞增殖、侵袭及PCNA、MMP-9蛋白表达的影响。

1.5 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。实验结果用x(_)±s表示。两组组间差异比较采用t 检验，多组组间差异采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

临床研究发现，骨肉瘤主要来源于间叶细胞，是由具有极强恶性增殖能力的肉瘤细胞产生的不成熟骨组织或者骨肿瘤性组织，是最常见的原发骨肿瘤，好发于青少年^[4^，^24]。骨肉瘤干细胞的存在是导致骨肉瘤进展、转移、耐药的主要原因^[25]，对常规化疗药物顺铂和阿霉素具有抵抗作用^[26]。目前肿瘤治疗失败的原因，很可能就是没有针对肿瘤干细胞的有效药物。因此对骨肉瘤干细胞进行分离，并且研究新的针对肿瘤干细胞的药物有很重要的现实意义^[27-28]。

阿霉素作为临床上常用的化疗药物之一，是一种针对骨肉瘤治疗的化疗药物^[3^，^29]。化疗过程中，肿瘤细胞对化疗药物的耐受程度增强，细胞耐药性增加是导致化疗失败的一个重要原因^[30]，也是骨肉瘤治疗中采用阿霉素进行长期化疗所带来的重要风险^[31]。因此，研究如何有针对性的靶向肿瘤细胞，降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药性十分重要^[32]。目前，针对骨肉瘤干细胞的有效干预方法及耐药相关机制的研究，对于最终有针对性地靶向骨肉瘤干细胞治疗骨肉瘤有着很重要的前景^[33-35]。李杨玲等^[36]发现阿霉素可以影响骨肉瘤干细胞特性和转移能力，抑制骨肉瘤细胞的增殖，且与阿霉素呈良好的剂量关系和时间关系，其机制可能与阿霉素通过上调骨肉瘤干细胞Klf-4蛋白的表达有关。郑联合等^[37]研究发现阿霉素可促进成骨肉瘤细胞凋亡，其机制可能与抑制MAPK信号转导通路有关。

实验采用免疫磁珠分选法从MG63骨肉瘤细胞中分离出纯度较高CD133⁺骨肉瘤干细胞。经阿霉素处理后，骨肉瘤干细胞的增殖受到抑制，将mTOR信号通路抑制剂依维莫司与阿霉素共同作用于骨肉瘤干细胞，结果显示mTOR信号通路抑制剂依维莫司能增强阿霉素抑制骨肉瘤干细胞的生长增殖及侵袭的能力。为进一步探明可能的机制，从分子水平上分析了依维莫司联合阿霉素对骨肉瘤干细胞增殖标志蛋白PCNA和侵袭相关蛋白MMP-9的影响。PCNA蛋白是一种与细胞增殖关系密切的蛋白^[38]，而且目前已经证实其表达水平与肿瘤的发生和发展存在密切的联系^[39-41]，并与多种恶性肿瘤患者愈后差呈正相关^[42-44]。有研究表明，MMP-9在高度恶性肿瘤标本中阳性率高达91.3%，在肿瘤侵袭中发挥着更重要的作用^[45-46]。

总之，使用mTOR抑制剂依维莫司联合阿霉素处理后骨肉瘤干细胞增殖、侵袭能力显著降低，并且细胞增殖密切相关PCNA蛋白和侵袭相关MMP-9蛋白的表达均受到抑制，与单独使用相同质量浓度阿霉素的抑制能力相比明显增强。结果表明，mTOR通路抑制剂依维莫司能够增强阿霉素抑制骨肉瘤干细胞增殖及侵袭的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程