手持静电纺丝可降解纳米纤维原位修复全层皮肤缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1513

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (2): 257-264.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1513

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手持静电纺丝可降解纳米纤维原位修复全层皮肤缺损

陈洪让^1，2，张海涛³，邓坤学³，李永生²，沈云²，徐弢⁴，章新琼¹

¹安徽医科大学护理学院，安徽省合肥市 230032；²安徽医科大学第一附属医院普外科，安徽省合肥市 230032；³广州迈普再生医学科技股份有限公司，广东省广州市 510663；⁴清华大学机械工程系，生物制造中心，北京市 100084

收稿日期:2018-08-13 出版日期:2019-01-18 发布日期:2019-01-18
通讯作者: 章新琼，副教授，安徽医科大学护理学院，安徽省合肥市 230032
作者简介:陈洪让，女，1987年生，安徽省合肥市人，汉族，安徽医科大学在读硕士，主要从事血管外科专科工作，以及血管性溃疡修复的相关研究。
基金资助:
国家高新技术研究与发展规划863项目(2015AA020303，项目负责人：徐弢)

In situ repair of full-thickness skin defects by handheld electrospun biodegradable nanofibers

Chen Hongrang^{1, 2}, Zhang Haitao³, Deng Kunxue³, Li Yongsheng², Shen Yun², Xu Tao⁴, Zhang Xinqiong¹

¹Nursing College, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China; ²Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China; ³Guangzhou Medprin Regenerative Medicine Technology Co., Ltd., Guangzhou 510663, Guangdong Province, China; ⁴Department of Mechanical Engineering, Biomanufacturing Center, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Received:2018-08-13 Online:2019-01-18 Published:2019-01-18
Contact: Zhang Xinqiong, Associate professor, Nursing College, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China
About author:Chen Hongrang, Master candidate, Nursing College, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China; Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China
Supported by:
the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program), No. 2015AA020303 (to XT)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
手持静电纺丝：通过CAD制图设计，3D打印制造外形符合人机工程学的静电纺丝设备，由12 V可充电锂电池串联电源供电，最高可提供10 kV直流高电压；安装电纺喷头、料筒、高压逆变器、电源和线路及开关后，单手握持即可静电纺丝，直至形成静电纺丝膜。
原位组织修复：在人体或动物组织创伤或病变位置，使用生物材料、自体或异体组织对组织损伤进行直接保护和修复。

背景：传统静电纺丝纳米纤维制造过程相对复杂，制造条件要求高，无法适应创伤、烧/烫伤等组织缺损的应急事件中快速组织修复的需求。
目的：观察手持式静电纺丝聚乳酸/明胶可降解纳米纤维膜对小鼠皮肤缺损原位修复的效果。
方法：①采用自制3D打印的手持式静电纺丝设备制备聚乳酸/明胶可降解纳米纤维膜，检测其接触角、水蒸气透过率；②以浓度100%，50%，20%的聚乳酸/明胶可降解纳米纤维膜浸提液培养胎鼠成纤维细胞，采用CCK-8细胞毒实验评估材料残留溶剂毒性；将胎鼠成纤维细胞与聚乳酸/明胶可降解纳米纤维膜共培养(实验组)，设置单独细胞培养为对照，Alamar blue法检测细胞增殖，活/死染色观察细胞存活率，扫描电镜观察细胞形态；③在18只Balb/c小鼠背部制作直径2 cm皮肤全层缺损，实验组进行手持静电纺丝原位聚乳酸/明胶可降解纳米纤维膜修复后纱布包扎，对照组进行纱布包扎，术后8周进行缺损部位苏木精-伊红和Masson染色，观察缺损皮肤修复效果。
结果与结论：①聚乳酸/明胶可降解纳米纤维膜的接触角为(32.68±5.68)°，属亲水材料，适宜细胞黏附；24 h水蒸气透过率为(4.21±0.11)×103 g/m²，可满足皮肤外敷料的要求；不同浓度的聚乳酸/明胶可降解纳米纤维膜浸提液无明显的细胞毒性；②实验组胎鼠成纤维细胞具有与对照组细胞等同的细胞活性，但具有更快的增殖速度与更长的增殖时间；③苏木精-伊红和Masson染色显示，实验组小鼠皮肤伤口全层愈合，材料降解完全，毛囊再生；对照组小鼠皮肤未全层愈合；④结果表明，手持式静电纺丝聚乳酸/明胶可降解纳米纤维实现小鼠皮肤全层缺损的原位修复。

ORCID: 0000-0001-6980-358X(陈洪让)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 可降解纳米纤维, 原位修复, 手持静电纺丝, 聚乳酸/明胶, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: The traditional electrospinning nanofiber manufacturing process is relatively complicated, which requires high manufacturing conditions and cannot meet the needs of rapid tissue repair in emergency events such as trauma and burn/scald.

OBJECTIVE: To observe the effect of handheld electrospun polylactic acid/gelatin degradable nanofiber membrane on the in situ repair of mouse skin defects.

METHODS: Handheld electrospun polylactic acid/gelatin degradable nanofiber membranes were prepared by self-made 3D printing handheld electrospinning device, and the contact angle and water vapor transmission rate were then measured. Fetal rat fibroblasts were cultured with 100%, 50%, 20% polylactic acid/gelatin degradable nanofiber membrane extracts, and the residual solvent toxicity of the materials was evaluated by cell counting kit-8 cytotoxicity assay. Fetal rat fibroblasts were co-cultured with polylactic acid/gelatin degradable nanofiber membrane (experimental group), and cells cultured alone were set as control. Cell proliferation was detected by Alamar blue method, cell viability was observed by live/dead staining, and cell morphology was observed by scanning electron microscope. A full-thickness skin defect of 2 cm in diameter was made on the back of 18 Balb/c mice. The experimental group was inlaid with handheld electrospun polylactic acid/gelatin degradable nanofiber membrane for in situ repair followed by gauze dressing. The control group was treated with gauze dressing at the defect site. Eight weeks after operation, hematoxylin-eosin and Masson staining were used to observe the repair of skin defects.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The contact angle of polylactic acid/gelatin degradable nanofiber membrane was (32.68±5.68)°, indicating a hydrophilic material suitable for cell adhesion. The 24-hour water vapor transmission rate was (4.21±0.11)×10³ g/m², which met the requirements of external skin dressing. Different concentrations of polylactic acid/gelatin degradable nanofiber membrane extract had no obvious cytotoxicity. (2) In the experimental group, fetal rat fibroblasts had the cell viability equivalent to control cells, but exhibited faster proliferation rate and longer proliferation time. (3) Results from the hematoxylin-eosin and Masson staining showed that the full-thickness skin defect healed in the experimental group, with the material being completely degraded and the hair follicles being regenerated. In the control group, the defect healed incompletely. To conclude, handheld electrospun polylactic acid/gelatin degradable nanofibers can implement the in situ repair of mouse full-thickness skin defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Nanofibers, Gelatin, Tissue Engineering

中图分类号:

R459.9

R318

陈洪让，张海涛，邓坤学，李永生，沈云，徐弢，章新琼. 手持静电纺丝可降解纳米纤维原位修复全层皮肤缺损[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(2): 257-264.

Chen Hongrang, Zhang Haitao, Deng Kunxue, Li Yongsheng, Shen Yun, Xu Tao, Zhang Xinqiong. In situ repair of full-thickness skin defects by handheld electrospun biodegradable nanofibers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(2): 257-264.

图/表（结果） 3

2.1 手持静电纺丝纳米纤维膜材料的特性

2.1.1 电镜观察手持式静电纺丝装置原位电纺样品的电镜图，见图2A，可见经原位电纺后，聚乳酸/明胶纺丝液被拉伸、固化为相对均匀的纳米纤维，纤维平均直径为(584.44±188.43) nm。直径分布统计发现，其直径分布符合高斯正态分布，见图2B所示。

2.1.2 傅里叶变换红外光谱聚乳酸/明胶纳米纤维膜、聚乳酸纳米纤维膜及明胶纳米纤维膜的傅里叶变换红外光谱图，见图2C所示，可见聚乳酸纳米纤维在1 758，1 452，1 183，1 130，1 087 cm^-1出现的吸收峰分，别对应C=O的伸缩振动吸收峰、-CH³的伸缩振动吸收峰、C-O反对称伸缩振动吸收峰、C-O-C伸缩振动吸收峰、C-O对称伸缩振动吸收峰；明胶纳米纤维在1 593，1 462，1 246 cm^-1出现的吸收峰，对应酰胺Ⅰ带的N-H变形振动吸收峰、酰胺Ⅱ带的N-H伸缩振动吸收峰、酰胺Ⅲ 带的N-H伸缩振动吸收峰。当二者复合后，聚乳酸/明胶纳米纤维基本遵从聚乳酸纳米纤维的红外特征，归属于明胶的特征吸收峰基本消失，证明少量明胶的加入，对聚乳酸的特征基团不产生大的影响；同时，还发现聚乳酸/明胶纳米纤维在1 650 cm^-1出现了吸收峰，对应酰胺Ⅰ带C=O伸缩振动吸收峰，说明明胶和聚乳酸之间产生了微弱的化学作用，这有助于明胶在聚乳酸中的均匀分布。

2.1.3 X射线衍射聚乳酸/明胶纳米纤维膜、聚乳酸纳米纤维膜及明胶纳米纤维膜的X射线衍射结果，见图2D所示，可见聚乳酸纳米纤维在16.6°位置出现结晶峰，对应聚乳酸的(200)晶面。明胶纳米纤维在20°左右出现馒头峰。当二者复合后，聚乳酸/明胶纳米纤维也仅在16.6°位置出现结晶峰，并且X射线衍射曲线与聚乳酸纳米纤维没有明显差别，说明明胶的加入对复合材料结晶性能无影响。

2.1.4 水接触角聚乳酸/明胶纳米纤维膜、聚乳酸纳米纤维膜及明胶纳米纤维膜的水接触角，见图2E所示。聚乳酸纳米纤维的水接触角为(134.48±3.43)°，属于疏水材料范围。研究采用的明胶纳米纤维未经过交联处理，因此当水滴接触明胶纳米纤维膜后，会迅速弥散开来，且明胶纳米纤维易溶于水，所以无法得到正常的水接触角，增大明胶纳米纤维膜的厚度并缩短拍照时间，可得到明胶纳米纤维的水接触角为(11.02±10.34)°，属于亲水材料范围。当二者复合后，测得聚乳酸/明胶纳米纤维膜的水接触角为(32.68± 5.68)°，属于亲水材料范围，而且这个水接触角在最适宜细胞黏附的30°-50°的范围内^[24]。因此，聚乳酸/明胶纳米纤维膜的水接触角满足细胞黏附需求。

2.1.5 水蒸气透过率聚乳酸/明胶纳米纤维膜、聚乳酸纳米纤维膜及明胶纳米纤维膜的水蒸气透过率，见图2F所示。作为皮肤上的外敷料，除需保护创面不受外界环境影响，原位电纺的纳米纤维膜还需要有一定的透气透湿性能。经测试发现，因聚乳酸纳米纤维为疏水性，24 h透湿率仅为(0.272±0.09)×10³ g/m²。因明胶纳米纤维溶于水，当进行透湿测试时，膜片很快被水浸湿后破裂，无法得到透湿率，因此不具备原位电纺的实际应用价值。当二者复合后，聚乳酸/明胶纳米纤维膜的24 h透湿率可达到(4.21±0.11)× 10³ g/m²，可满足皮肤外敷料的要求^[25]。综上所述，聚乳酸/明胶纳米纤维膜材料特性可满足皮肤修复材料以及原位电纺电纺的要求，因此选取聚乳酸/明胶纳米纤维膜进行后续生物学测试。

2.2 手持静电纺丝纳米纤维膜的体外生物学特性

2.2.1 细胞毒性手持静电纺丝膜浸提液的CCK-8细胞毒性实验结果，见图3A，100%，50%，25%浓度浸提液组与阴性对照组的细胞相对增殖率分别为(97.42±1.40)%，(96.73±1.60)%和(99.09±0.94)%，均无细胞明显细胞毒性；阳性对照组细胞相对增殖率为(47.79±4.30)%，有细胞毒性。

2.2.2 细胞存活 L929细胞种植到电纺膜第3天进行活/死染色，见图3B，C，实验组、对照组细胞存活率分别为(96.78±1.41)%，(97.59±1.32)%，两组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.2.3 细胞形态 L929细胞种植电纺膜后在电镜下观察，见图3D，可见细胞部分黏附在电纺膜纳米纤维表面，部分深入膜材料内部，细胞伪足沿着纳米纤维伸展良好，形态饱满；对照组可见细胞伸出伪足黏附培养玻片表面，形态良好。

2.2.4 细胞增殖曲线与对照组对比，实验组细胞增殖启动速度相对慢，但倍增时间并无明显差异，见图3E；实验组增殖到达平台期所用时间长于对照组，对照组在第9天时增殖活性下降，出现明显凋亡，实验组直到13 d仍保持增殖活性，此实验说明实验组细胞保持相当于对照组的细胞活性，而且获得了相对多的增殖空间，保持了更久的细胞增殖活性。

2.3 手持静电纺丝纳米纤维原位修复皮肤缺损

2.3.1 大体观察修复8周后，实验组小鼠皮肤缺损完全愈合，毛发再生并完全覆盖缺损；对照组小鼠皮肤缺损大体可见，翻开皮肤后可见明显缺损，没有愈合，见图4A-C。

2.3.2 病理染色病理苏木精-伊红切片显微镜下观察，正常皮肤，如图4D-F所见，皮肤及各附属器官完整；实验组小鼠皮肤修复完整，皮肤全层修复，各层分界良好，部分可见毛囊、毛发再生，见图4G-I；对照组可见皮肤缺损边缘，缺损边界未见皮肤覆盖，以脂肪空泡为主。Masson三色染色结果可见，正常皮肤层级完整，胶原纤维结构完整，见图4F；实验组小鼠皮肤相对完整，皮肤完全覆盖，胶原纤维增生较正常皮肤厚；对照组也可见胶原纤维，但是无皮层覆盖，修复效果显著差于实验组。由此可见手持静电纺丝纳米纤维膜有助于实现小鼠皮肤的全层完整修复。

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引言

皮肤是人体最大的器官，保护着人体组织免受外界伤害的侵袭^[1-3]。当发生重大创伤、烧/烫伤、慢性血管性/代谢性疾病等致使皮肤缺损后，因组织直接暴露或经久不愈而面临感染、截肢、全身并发症，甚至患者生命危险^[4-7]。及时、高效地原位保护和处理创面，将为伤口愈合提供必要的环境和再生条件。敷料在伤口愈合过程中发挥着重要作用，不仅可通气、可吸收渗出、保护伤口不受污染，还能维持创面湿润，具有良好的组织生物相容性和可降解特性，可促进皮肤再生^[8-10]。近年随着生物材料技术的快速发展，大量性能优异的生物材料展现出了巨大的临床应用潜力，主要包括合成高分子材料(如聚乳酸、聚己内酯、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚醚醚酮等)和天然高分子材料(如明胶、壳聚糖、海藻酸钠、胶原、透明质酸、丝素蛋白等)^[11-13]。结合各种材料的优势特性，多种高分子材料共混复合的生物制造既能保留材料各自特殊的优势性能又能避免单一材料的内在缺陷，因而在组织工程中广泛使用。

聚乳酸具有良好的生物相容性、可生物降解性(降解产物为无毒的乳酸)和机械力学特性，是美国食品药品管理局认定的可用于体内移植的生物材料，因而成为软组织修复最常用的静电纺丝合成高分子材料之一^[14]。但是，单纯聚乳酸分子表面高度疏水，缺乏细胞附着的锚点，而不利于组织细胞快速的黏附、迁移和再生修复。明胶是胶原经部分变性而来的衍生物，具有低免疫原性、高度保水性和体内可完全降解的特性，是理想的体内基质材料替代物^[15]。但是，单纯的明胶材料机械力学性能差、水解速度快，不适于体内移植组织修复。鉴于此，聚乳酸和明胶共混复合材料优势互补，既能保持材料的机械力学性能又能延缓材料降解速度，匹配组织修复再生速度。高分子材料的静电纺丝纳米纤维具有良好的多孔性、保水性、组织相容性、机械力学等特性，因而在组织修复领域备受青睐，在皮肤、硬脑脊膜、肌肉、骨、软骨等修复中均有报道^[16-19]。聚乳酸/明胶共混材料的静电纺丝纳米纤维是软组织修复应用最理想的材料组合之一，已有文献报道将其应用于脑硬脊膜修补，发现其能够促进细胞快速迁移和定植，实现组织再生修复^[16]。

传统的静电纺丝纳米纤维制造过程相对复杂，制造条件要求高，无法适应创伤、烧/烫伤等组织缺损应急事件中快速组织修复的需求。便携式静电纺丝设备的出现为解决这一难题提供了新的方案，不仅可安全地实现组织缺损快速、原位修复，还能保护创面、止血、促进组织再生，而且毒性低^[19-23]，但仍存在设备稳定性差、可电纺材料单一等缺点。进一步改善手持静电纺丝设备的稳定性，扩展多种生物材料的适用性，有望显著增强手持静电纺丝设备在包括皮肤在内的软组织快速修复和促进再生领域的应用。

研究基于自制3D打印的手持静电纺丝仪，体外对手持静电纺丝纳米纤维膜进行电镜、傅里叶红外光谱、X射线衍射、水接触角和水蒸气透过率等材料特性、细胞毒性和生物相容性等生物学特性评估，体内通过小鼠皮肤极限缺损原位修复实验评估手持电纺纳米纤维膜促进皮肤修复的效果，旨在探讨便携式手持静电纺丝纳米纤维膜在快速原位组织修复中的应用潜能，为临床应用奠定体内外实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年3月至2018年3月在安徽医科大学、广州迈普再生医学科技有限公司、清华大学完成。

1.3 材料

实验材料和试剂：聚乳酸(相对分子质量30万，Cat No.1604000258)购买于荷兰Corbion公司；明胶[来源于猪皮，黏度(6.67%，60 ℃)3.8 mPa•s，Cat No.1010583]购买于美国GELITA公司；六氟异丙醇(分析纯)购买于美国Halocarbon公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰酶、磷酸盐缓冲液购自美国Gibco公司；Alamar Blue购买于上海麦约尔生物技术有限公司；CCK-8试剂盒购买于日本株式会社同仁化学研究所；细胞活力/毒性染色试剂盒购买于凯基生物公司。

实验使用细胞和动物：胎鼠成纤维细胞L929购买于北京北纳创联生物技术有限公司，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养，每天更换培养基，每3 d传代1次。Balb/c小鼠购买于南京模式动物中心，许可证号：SCXK(苏)2015-0001，体质量25-30 g，饲养于IVC系统中。所有动物实验均在安徽医科大学第一附属医院伦理委员会监督下施行，所有动物管理和操作流程均严格按照安徽医科大学第一附属医院伦理委员会的要求执行。

手持静电纺丝仪：研究自主设计手持静电纺丝装置，主要外形和外壳装置的STL图形，见图1A所示，设计为持枪式，符合人机工程学。使用光敏树脂材料经3D打印后，见图1B所示，安装电源、高压逆变器、控制开关、排布电源线路，安装注射器，并固定注射器针头与高压逆变器高压输出端连接，即可使用。上述电源、控制开关、高压逆变器及电路的连接示意图，见图1C所示。同时以实际使用为出发点，将手持静电纺丝的挤出部分设计为掌心挤出，加大了挤出力度，可适用于高黏度的纺丝液，同时将控制开关和挤出部位分开，可以先挤出，待针头前端出现纺丝液后再打开高压逆变器开关，防止针头堵塞。使用时的持握方式，见图1D所示。

1.4 实验方法

1.4.1 聚乳酸/明胶纳米纤维膜的制作将质量比为7∶3的聚乳酸和明胶加入六氟异丙醇中，常温搅拌12 h至完全溶解，配置成总质量浓度为80 g/L的纺丝液。使用3D绘图软件Solidworks设计草图，输出STL格式文件，使用Stratasys公司的object 350光敏树脂打印机进行手持静电纺丝仪整体架构的3D打印，安装电纺喷头、料筒、高压逆变器、电源和线路及开关。该手持静电纺丝仪由12 V可充电锂电池串联供电，最高可提供10 kV直流高电压，利用接地的旋转杆收集纳米纤维，直至形成静电纺丝膜。

1.4.2 体外实验

组成成分与微观结构：电镜观察聚乳酸/明胶纳米纤维膜的微观结构；傅里叶变换红外光谱分析聚乳酸/明胶纳米纤维膜、聚乳酸纳米纤维膜及明胶纳米纤维膜的分子吸收光谱；X射线衍射检测聚乳酸/明胶纳米纤维膜、聚乳酸纳米纤维膜及明胶纳米纤维膜的组成成分。

水蒸气透过率：根据欧盟EN13726-2(2002)标准，即主要伤口敷料试验方法的第2部分：可渗透薄膜敷料湿气蒸发透过率，对聚乳酸纳米纤维膜、聚乳酸/明胶纳米纤维膜及明胶纳米纤维膜进行水蒸气透过率测试。

接触角：利用德国OCA-20型视频光学接触角测定仪测试静电纺丝膜的水接触角。将0.2 mL去离子水滴加到静电纺丝膜上，待液滴稳定后，拍照并测量接触角。每组测试5个点，取平均值。

CCK-8法检测细胞毒性：①电纺膜浸提液制作：按照ISO10993-5标准，将聚乳酸/明胶纳米纤维膜按照6 cm²/mL 加入新鲜细胞培养基，37 ℃浸没24 h制得浸提液。将浸提液按照100%，50%，25%的体积比用新鲜细胞培养基稀释制成工作液，以细胞培养基作为阴性对照，5%二甲基亚砜作为阳性对照；②将对数生长期的胎鼠成纤维细胞L929，消化，制成细胞浓度为4×10⁷ L^-1的细胞悬液，按照每孔 100 μL接种到96孔板，37 ℃、体积分数5%CO₂培养过夜；吸出每孔培养基，加入100 μL浸提液，阳性对照使用5%二甲基亚砜，继续培养24 h；向每孔加入100 μL CCK-8反应液(90 μL培养基+10 μL CCK-8)，在空白孔里加入反应液作为空白对照，37 ℃孵育2 h；用酶标仪检测每孔在450 nm波长吸光度A值。细胞相对存活率=(实验组A值-空白组A值)/(阴性对照组A值-空白组A值)×100%。

Alamar blue法检测细胞增殖：实验组将电纺膜用打孔机裁剪成24孔板内径大小后γ射线辐照灭菌，放入24孔板，每孔加入细胞浓度为2×10⁸ L^-1的L929细胞悬液1 mL，培养过夜，用PBS稀释Alamar blue原液(Alamar blue与PBS体积比为1∶9)为工作液，每孔加入1 mL工作液， 37 ℃孵育1 h；把反应液加入96孔板，每孔100 μL，用酶标仪读取570 nm和630 nm处的吸光度值(A值)；实验完成后，含细胞的膜用PBS洗2遍，加入新鲜培养基继续培养。以贴壁培养的细胞作对照。

活/死染色：实验组将聚乳酸/明胶纳米纤维膜与L929细胞共培养于24孔板，于培养的第3天行活/死染色。取 10 mL PBS，制备2 μmol/L钙黄绿素AM和8 μmol/L PI工作液，每孔加入1 mL，室温孵育15 min，PBS洗涤后荧光显微镜下观察，在荧光显微镜×200视野下，随机选择5个视野拍照，重复3遍，记录钙黄绿素AM和PI染色阳性的细胞数，计算活性细胞占总细胞数的比例。以贴壁培养的细胞作对照。

扫描电镜观察：实验组将聚乳酸/明胶纳米纤维膜与L929细胞共培养，细培养的第1，5 天，用4 ℃预冷的3%戊二醛溶液固定过夜，PBS洗涤3遍，然后脱水，具体步骤为：丙酮/醋酸异戊酯按照1∶1比例配比浸没电纺膜10 min，然后用100%醋酸异戊酯浸没30 min；电纺膜浸入体积分数50%的乙腈水溶液，然后依次替换70%，80%，90%，95%和100%的乙腈溶液，每次浸没20 min，最后真空干燥。干燥样品通过导电胶固定在样品托上，使用真空喷镀法在电纺膜表面喷镀一层铂金，5 kV电压下进行电镜观察、拍照。以贴壁培养的细胞作对照。

1.4.3 动物体内实验取18只Balb/c小鼠，在其背部皮肤制造直径2.0 cm的全层缺损，9只行原位静电纺丝修复，9只为空白对照。使用10%水合氯醛按照50 μL/g进行腹腔麻醉，剃除背部皮肤毛发，手术制造直径2.0 cm的全层皮肤缺损，随机分2组干预，实验组进行原位静电纺丝后纱布包扎，手动调节喷射范围，使得纳米纤维均匀喷涂覆盖创面；对照组仅常规用纱布包扎作为对照。定期观察切口愈合情况。

病理切片：修复8周后处死小鼠，取手术区域全层皮肤，用40 g/L多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋，制作5 μm厚度石蜡切片，按照脱蜡步骤脱蜡后分别进行苏木精-伊红染色和Masson三色染色，中性树胶封固后显微镜观察。所有动物实验过程均是根据国家卫生研究院关于使用实验室动物的指导方针进行，并经安徽医科大学第一附属医院动物研究伦理委员会批准和监督下实施的。

1.5 主要观察指标手持式静电纺丝聚乳酸/明胶可降解纳米纤维膜的材料特性与生物学特性，以及其原位修复小鼠皮肤缺损的效果。

1.6 统计学分析应用Photograph prism 5统计软件分析和作图，数据以均x(_)±s表示，组间比较采用独立样本t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

皮肤缺损再生困难的一个主要原因是真皮层细胞缺少迁移附着的介质，细胞无法通过爬行和组织新生覆盖伤口，导致其难以闭合^[26-27]。高分子材料的纳米纤维膜被广泛应用于皮肤组织再生^[28]。为增强皮肤再生效果，多种多样的方法被应用于刺激皮肤再生和功能化，包括生长因子、趋化因子、微小RNA等化学诱导方法和纳米纤维材料自身物理结构特性^[29]。明胶材料具有良好的物理特性，不仅富含细胞附着位点，还能模拟组织微环境细胞外基质特征，促进细胞-细胞、细胞-基质相互作用作用关系，进而为皮肤细胞生长提供理想的基质微环境^[30]。使用聚乳酸/明胶共混材料进行静电纺丝，聚乳酸可提供纤维膜强度和弹性，明胶可提供更好的组织相容性，促进细胞爬行和覆盖^[31]。

通过手持静电纺丝装置制造的聚乳酸/明胶纳米纤维膜，模拟了天然细胞外基质的微观结构，对细胞的黏附、增殖和迁移具有良好的促进作用，在皮肤缺损处原位沉积，不仅及时保护创面不受外界污染、保持了创面湿润为皮肤再生提供有利环境，还为真皮层细胞迁移、爬行提供附着点，为血管发生、皮肤再生提供膜支架结构支撑^[32-34]。聚乳酸/明胶纳米纤维膜材料在软组织修复应用上甚至已经有商品化的产品，用于脑膜修补^[23^，^35]，足以证明聚乳酸/明胶在人体和动物的组织修复应用中的安全性。

手持静电纺丝装置具有集成、便携、快捷的应用特点^[36-37]。Xu等^[19-22]报道自制手持静电纺丝装置，并用于脑膜、肝脏和皮肤等组织原位修复，显著促进组织愈合，但仍存在不足：该装置的外形设计需要单手握持，单指挤压，而手掌稍小、手指力量不足的研究者使用相对困难；使用的材料基本都只是高度疏水的合成材料聚己内酯，对于组织保水维持湿润和为组织再生提供微环境基质条件不够理想。研究用的设备根据CAD制图，利用3D打印制造的外形和外壳装置符合人机工程学设计，便于单手手持操作^[38-40]。材料的可选择范围更加广泛，不仅可以喷射聚己内酯，还可实现聚乳酸、明胶、聚乳酸/明胶、丝素等的电纺。

研究中，为了进一步证明手持静电纺丝聚乳酸/明胶纳米纤维膜在皮肤等软组织修复应用中的优越性，从电镜下纳米纤维形态、傅里叶红外光谱、X射线衍射、亲水性能和透气性能等方面进行评估，证实了聚乳酸/明胶纳米纤维优越的材料特性，可满足原位电纺要求，是理想的皮肤修复材料。同时，考虑到电纺纳米纤维原位修复可能会有溶剂残留影响细胞活性，使用CCK-8实验评估细胞毒性，结果证实和对照组之间差异无显著性意义。胎鼠成纤维细胞体外种植纳米纤维膜实验可见，细胞在该膜上能够维持等同于2D培养细胞的活性，而且具有更快的增殖速度和维持较长的增殖时间。大体形态、病理结果可见，电纺纳米纤维膜修复皮肤伤口全层愈合，毛囊再生，对照组皮肤未愈合，未达全层愈合，充分证实了手持静电纺丝纳米纤维膜在皮肤缺损组织再生修复具有明显优势。

结论：通过自行设计和3D打印制造的手持静电纺丝装置，可以实现聚乳酸/明胶纳米纤维膜在皮肤缺损的快速、原位修复；体内外实验证明，聚乳酸/明胶纳米纤维膜具有优越的材料特性和生物相容性，在皮肤缺损修复上展示了潜在的应用空间。手持静电纺丝因其小巧、轻便、操作简单、快速工作等独特的优势，将有望应用于烫伤、战伤、创伤等领域开展伤口紧急救治应用；隔离病房、特殊环境和特定空间等情况下实现组织修复应用；在社区、偏远地区和家庭中自行便捷操作使用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

手持静电纺丝可降解纳米纤维原位修复全层皮肤缺损

In situ repair of full-thickness skin defects by handheld electrospun biodegradable nanofibers

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