多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥的构建及理化特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0640

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

骨基质明胶：是在脱钙骨的基础上经理化处理制备而成的，其制备过程中彻底除去了骨形成蛋白之外的非胶原性蛋白和脂类，抗原性极低，骨形成蛋白的纯度很高，己被公认具有恒定极强的诱导成骨活性，其成骨能力与自体骨相似，但单独应用力学强度差，不能任意塑形，无法满足临床的需要。

磷酸钙骨水泥：由固相与液相组成，可任意塑形，并能在低温时自固化形成与人体骨组织相似的产物，具有良好的生物相容性、可降解性、生物骨传导性，已成为临床骨组织修复的重要替代材料，多用于非负重区的骨缺损修复。

背景：磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性和骨传导性及可降解性，可用于修复骨缺损，但单一的磷酸钙骨水泥脆性大，不具有骨诱导活性，生物活性差。

目的：构建多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥，分析其理化特性。

方法：提取兔骨基质明胶，制作聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic) acid，PLGA]空白微球，将PLGA微球(质量分数分别为0，5%，10%，对应制作的骨水泥分别设为空白组、5%组、10%组)、骨基质明胶与磷酸钙骨水泥复合，构建多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥，考察3种复合骨水泥的微观结构、凝固时间、可注射性、抗溃散性、孔隙率及降解特性。将骨髓间充质干细胞分别与3种复合骨水泥浸提液共培养，14 d内检测细胞增殖率。将3种复合骨水泥材料分别植入新西兰兔腰椎椎体骨缺损内，12周后采用Micro-CT分析材料对骨缺损的修复作用。

结果与结论：①与空白组比较，5%组、10%组复合骨水泥凝固时间减少(P < 0.05)，孔隙率增大(P < 0.05)，抗压强度、弹性模量降低(P < 0.05)，可注射性变差，抗扩散性弱，体外降解加速；与5%组比较，10%组复合骨水泥凝固时间减少(P < 0.05)，孔隙率增大(P < 0.05)，抗压强度、弹性模量降低(P < 0.05)，抗扩散性弱，体外降解加速；②与空白组复合骨水泥比较，5%组、10%组复合骨水泥可促进骨髓间充质干细胞的增殖(P < 0.05)；③3种骨水泥材料植入12周后的Micro-CT显示，骨缺损处均有新骨生成，5%组、10%组兔骨缺损部位骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量均明显高于空白组(P < 0.05)，骨小梁分离度均低于空白组(P < 0.05)；④结果表明质量分数为5%PLGA微球与骨基质明胶、磷酸钙骨水泥复合构建的骨水泥，具有良好的力学强度、降解性能、可操作性、细胞相容性及骨诱导活性。

ORCID: 0000-0001-7594-6122(王松)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 磷酸钙骨水泥, 骨基质明胶, PLGA微球, 复合骨水泥, 理化特性, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Calcium phosphate cement has good biocompatibility, osteoinductive activity and biodegradability, which meets some of the needs for repairing bone defects. However, single calcium phosphate cement is brittle and has poor biological activity without osteoinductive activity.

OBJECTIVE: To develop porous calcium phosphate/bone matrix gelatin composite cements and to explore the physicochemical characterization.

METHODS: Bone matrix gelatin was extracted from rabbits and poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) microspheres were prepared. The new porous cement was developed using calcium phosphate cement composited with bone matrix gelatin and PLGA microspheres. The composited cement was then divided into three groups including blank group, 5% microsphere group and 10% microsphere group. Then, the physicochemical characterizations of the new porous composite bone cement in different groups were assessed by microstructure, setting time, injectability, resistance to collapsibility, in vitro degradation and porosity. Bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with the extracts of these three kinds of composite cements, and cell proliferation rate was detected within 14 days of co-culture. The three kinds of composite cements were implanted into the lumbar vertebral bone defects in the rabbit model, and bone defect repair was analyzed by Micro-CT at 12 weeks after implantation.

RESULTS AND CONCLUSION: With the increasing ratio of the microsphere, the setting time was shortened (P < 0.05), the porosity was increased (P < 0.05), the compressive strength and elastic modulus were reduced (P < 0.05), the injectability and anti-diffusivity were weakened, and the in vitro degradation was fastened. Compared with the blank group, the cell proliferation was significantly increased in the 5% and 10% microsphere groups (P < 0.05). At 12 weeks after implantation, Micro-CT findings revealed new bone tissues formed at the bone defect site. Compared with the blank group, significantly increased bone mineral density, bone volume fraction, trabecular thickness, and trabecular number were observed in the 5% and 10% microsphere groups (P < 0.05), but the trabecular spacing was significantly lower than that in the blank group (P < 0.05). To conclude, the calcium phosphate/bone matrix gelatin composite cement with 5% PLGA microsphere has proper maneuverability, mechanical strength and cytocompatibility, degradability and osteoinductive activity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Calcium Phosphates, Porosity, Bone Matrix, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王松，杨函，杨剑，张开权，康建平，王清. 多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥的构建及理化特性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(34): 5419-5425.

Wang Song, Yang Han, Yang Jian, Zhang Kaiquan, Kang Jianping, Wang Qing. Development and physicochemical characterization of a porous calcium phosphate/bone matrix gelatin composite cement[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(34): 5419-5425.

图/表（结果） 8

2.1 复合骨水泥的扫描电镜观察电镜显示各组结晶产物为整齐排列的晶体，随着PLGA微球质量的增加，晶体间孔隙增大，见图1。

2.2 复合骨水泥的凝固时间随着PLGA微球质量分数的增加，复合骨水泥的凝固时间、可操作时间(终凝时间与初凝时间之差)逐步缩短，见表1。

2.3 复合骨水泥的可注射性随着固液混合后时间的延长，各组注射推力逐步增加，在早期缓慢增加，在晚期快速增加，空白组在16 min、5%组在14 min、10%组在8 min时，注射时推力超过60 N后迅速上升，逐步丧失可注射性(图2)。

2.4 复合骨水泥的抗溃散性 3组凝固时样本在PBS中均有较好的抗溃散性，大体形状完整，其中空白组无溃散，5%组可凝有溃散，10%组有少许溃散。

2.5 复合骨水泥的孔隙率测定随着PLGA微球质量分数的增加，复合骨水泥孔隙率增加，其中5%组为55.06%，10%组增加到58.40%，均高于空白组(P < 0.05)，10%组较5%组孔隙率明显增加(P < 0.05)，见表2。

2.6 复合骨水泥的体外降解结果在PBS中第4周时，可观察到各组样本表面被降解的印迹，随着降解时间的延长，样本表面的降解印迹越明显，样本的失重率也随着降解时间延长逐步增加，随着PLGA质量分数的增加，失重率明显增加(图3)。在降解第12周，失重率空白组为7.94%，5%组为21.21%，10%组为23.23%。

2.7 复合骨水泥的X射线衍射分析粉末衍射结果显示各组结晶产物均以羟基磷灰石为主的结晶衍射峰，随着PLGA微球质量分数的增大，复合骨水泥的羟基磷灰石衍射峰高度降低，但各组反应物中无新的结晶产物出现(图4)。

2.8 复合骨水泥的生物力学测试结果随着PLGA微球质量分数的增加，复合骨水泥的抗压强度、强性模量逐步降低(P < 0.05)，见表2。

2.9 复合骨水泥的细胞毒性实验结果培养的第1-14天，通过测量的吸光度计算得到的细胞存活率显示，空白组各时间点的细胞增殖率在100%上下波动，细胞毒性分级为0至1级；5%组和10%组在各个时间点的细胞增殖率均大于100%，细胞毒性分级为0级，两组间比较差异无显著性意义，5%组、10%组各时间点的细胞增殖率均大于空白组 (P < 0.05)，见表3。说明5%组和10%组复合材料基本无细胞毒性，在一定程度上能够促进细胞的增殖。

2.10 复合骨水泥动物体内植入实验的Micro-CT检测结果 3组材料植入后均有新生骨形成，在12周，5%组、10%组骨密度、骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量显著高于空白组(P < 0.05)，见表4。

参考文献

[1] O'Neill R,McCarthy HO,Montufar EB,et al.Critical review: Injectability of calcium phosphate pastes and cements.Acta Biomater.2016;9(16):30606-30607.

[2] Liao H,Félix Lanao RP,van den Beucken JJ,et al.Size matters: effects of PLGA-microsphere size in injectable CPC/PLGA on bone formation.J Tissue Eng Regen Med. 2016;10(8): 669-678.

[3] Urist MR,Lange RJ,Finerman GABone cell differentiation and growth factorsScience.1983; 220(4598):680-686.

[4] Vrancken NM,Claeys AD.Method for encapsulating water and compoundsin aqueous phase by extraction: US, 3526906[P].1970-08-11．

[5] 王松,杨函,杨剑,等.多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥修复兔椎体骨缺损的研究[J].中国修复重建外科杂志, 2017,31(12): 1462-1467.

[6] 丁裕明.新型磷酸钙复合骨水泥的制备及性能研究[D].泸州:西南医科大学,2016:1-9.

[7] ISO.Cement-Test methods-Determination of setting time and soundness ISO 9597,2008.

[8] ASTM.Standard test method for time of setting of hydraulic-cement paste by Gillmore needles. ASTM C266–08, 2008.

[9] Habraken WJ,Wolke JG,Mikos AG,et al.PLGA microsphere/ calcium phosphate cement composites for tissue engineering: in vitro release and degradation characteristics.J Biomater Sci Polym Ed.2008;19(9):1171-1188.

[10] 马思遥,杨帅兵,岳晓华.Wistar大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J].临床医药文献杂志,2018,85(3):24-26.

[11] Khairoun I,Boltong MG,Driessens FC,et al.Effect of calcium carbonate on clinical compliance of apatitic calcium phosphate bone cement.J Biomed Mater Res. 1997;38(4): 356-360.

[12] Medri V,Mazzocchi M,Bellosi A.Doped calcium-aluminium- phosphate cements for biomedical applications.J Mater Sci Mater Med.2011;22(2):229-236.

[13] Shi M,Chen L,Wang Y,et al.Low-intensity pulsed ultrasound enhances antibiotic release of gentamicin-loaded, self-setting calcium phosphate cement.J Int Med Res. 2018;1: 300060518773023.

[14] Bohner M.Design of ceramic-based cements and putties for bone graft substitution.Eur Cell Mater.2010;20:1-12.

[15] Jang JH,Shin S,Kim HJ,et al.Improvement of physical properties of calcium phosphate cement by elastin-like polypeptide supplementation.Sci Rep.2018;8(1):5216.

[16] Sarkar SK,Lee BY,Padalhin AR,et al.Brushite-based calcium phosphate cement with multichannel hydroxyapatite granule loading for improved bone regeneration.J Biomater Appl.2016; 30(6):823-837.

[17] 张岩,郑欣,朱彦丞,等.微球在骨组织工程中的应用现状[J].中国矫形外科杂志,2016,24(16):1478-1481.

[18] Gunnella F,Kunisch E,Maenz S,et al.The GDF5 mutant BB-1 enhances the bone formation induced by an injectable, poly(l-lactide-co-glycolide) acid (PLGA) fiber-reinforced, brushite-forming cement in a sheep defect model of lumbar osteopenia.Spine J.2018;18(2):357-369.

[19] Gunnella F,Kunisch E,Bungartz M,et al.Low-dose BMP-2 is sufficient to enhance the bone formation induced by an injectable, PLGA fiber-reinforced, brushite-forming cement in a sheep defect model of lumbar osteopenia.Spine J. 2017; 17(11):1699-1711.

[20] Liu W,Zhang J,Weiss P,et al.The influence of different cellulose ethers on both the handling and mechanical properties of calcium phosphate cements for bone substitution. Acta Biomater.2013;3:5740-5750.

[21] Filipowska J,Pawlik J,Cholewa-Kowalska K,et al. Incorporation of sol-gel bioactive glass into PLGA improves mechanical properties and bioactivity of composite scaffolds and results in their osteoinductive properties.Biomed Mater. 2014;9(6):065001.

[22] Santos PS,Cestari TM,Paulin JB,et al.Osteoinductive porous biphasic calcium phosphate ceramic as an alternative to autogenous bone grafting in the treatment of mandibular bone critical-size defects.J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2018;106(4):1546-1557.

[23] 赵轶男,刘建,刘昌盛,等.不同孔径多孔CPC 材料修复兔大段骨缺损的实验研究[J].中国矫形外科杂志,2012,20(10):924-927.

[24] 江捍平,王大平,阮建明,等.纳米羟基磷灰石人工骨的生物相容性研究[J].中国现代医学杂志,2005, 15(10):1477-1480.

[25] 张红烨,张瑞生,夏永祥,等.磷酸钙骨水泥的生物相容性[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(19):3713-3716.

[26] Song Y,Zhang C,Wang P,et al.Engineering bone regeneration with novel cell-laden hydrogel microfiber-injectable calcium phosphate scaffold.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2017;75: 895-905.

[27] Liu T,Li J,Shao Z,et al.Encapsulation of mesenchymal stem cells in chitosan/β-glycerophosphate hydrogel for seeding on a novel calcium phosphate cement scaffold.Med Eng Phys. 2018;56:9-15.

[28] Lamghari M,Berland S,Laurent A,et al.Bone reactions to nacre injected percutaneously into the vertebrae of sheep. Biomaterials.2001;22(6):555-562.

[29] Lamghari M,Antonietti P,Berland S,et al.Arthrodesis of lumbar spine transverse processes using nacre in rabbit.J Bone Miner Res.2001;16(6):2232-2237.

[30] Parker RM,Malham GM.Comparison of a calcium phosphate bone substitute with recombinant human bone morphogenetic protein-2: a prospective study of fusion rates, clinical outcomes and complications with 24-month follow-up.Eur Spine J.2017;26(3):754-763.

[31] Zheng YX,Wang J,Lin HT,et al.Reconstruction of orbital defect in rabbits with composite of calcium phosphate cement and recombinant human bone morphogenetic protein-2.Chin Med J (Engl). 2010;123(24):3658-3662.

[32] Perrier M,Lu Y,Nemke B,et al.Acceleration of second and fourth metatarsal fracture healing with recombinant human bone morphogenetic protein-2/calcium phosphate cement in horses.Vet Surg.2008;37(7):648-655.

[33] Palmer I,Nelson J,Schatton W,et al.Biocompatibility of calcium phosphate bone cement with optimised mechanical properties: an in vivo study.J Mater Sci Mater Med. 2016; 27(12):191.

[34] Lovasik BP,Holland CM,Howard BM,et al.Anterior Cervical Discectomy and Fusion: Comparison of Fusion, Dysphagia, and Complication Rates Between Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 and Beta-Tricalcium Phosphate. World Neurosurg.2017;97:674-683.

[35] Villavicencio AT,Burneikiene S.RhBMP-2-induced radiculitis in patients undergoing transforaminal lumbar interbody fusion: relationship to dose.Spine J.2016; 16(10):1208-1213.

[36] Toth JM,Wang M,Lawson J,et al.Radiographic, biomechanical, and histological evaluation of rhBMP-2 in a 3-level intertransverse process spine fusion: an ovine study.J Neurosurg Spine. 2016;25(6):733-739.

引言

材料方法

1.1 设计分组对照观察实验。

1.2 时间及地点实验于2017年1月至2018年3月在西南医科大学附属医院传染与免疫实验室完成。

1.3 材料

实验动物：新西兰健康成年兔，雌雄不拘，购自西南医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2013-17。两三周龄SD大鼠5只，雌雄不拘，体质量80-100 g，购自西南医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2013-17。新西兰健康幼兔30只，雌雄各半，体质量1.8-2.2 kg，购自西南医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2013-17。

实验主要材料、试剂、仪器：PLGA (PL∶GA=75∶25，黏度0.65-0.75 dL/g，M_w=87 000-106 000，济南岱罡生物工程有限公司)；异丙醇(天津市科密欧科技有限公司)；聚乙烯醇、二氯甲烷为分析纯(成都市科龙化工试剂厂)； α-磷酸三钙(北京基尼亚生物技术有限公司)；无水磷酸钙(上海瑞邦生物材料有限公司)；羟基磷灰石(四川国纳科技股份有限公司)；高速乳化机(型号GE700，巩义市予华仪器有限责任公司)；冷冻干燥机(型号LGJ-18C，北京四环科学仪器厂有限公司)；生物力学测试机(型号INSTRON 8874，美国INSTRON公司)；扫描电子显微镜(型号VEGA 3 SBU，捷克TESCAN公司)；X射线粉末衍射仪(型号D2 PHASER，德国布鲁克光谱仪器公司)；二氧化碳细胞培养箱(Heracell150i，Thermo scientific，美国)；全自动酶标仪(InfinteM200，TECAN，瑞士)；Micro-CT(INVEON，西门子，德国)；聚四氟乙烯塑料管(上海革方机电设备有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 复合材料的制备

磷酸钙骨水泥固相的配制：根据Liao等^[2]的方法，磷酸钙骨水泥粉由质量比为85%的α-磷酸三钙、10%无水磷酸钙和5%羟基磷灰石在室温下混合而成。

骨基质明胶的制备：参考Urist等^[3]方法，取新西兰健康成年兔四肢长管状骨干，剔除软组织、骨膜、干骺端，制成直径2.0-3.0 mm的骨颗粒，流水冲洗2 h；液氮冷冻，粉碎机中粉碎，经60-80目标准分样筛筛取，得到直径约200 µm的骨粉。室温下(24 ℃)分别加入1∶1氯仿甲醇溶液脱脂，0.6 mol/L HCl溶液脱钙，再次脱脂后，依次经 2 mol/L CaCl₂溶液，0.5 mol/L EDTA溶液，8 mol/L LiCl溶液处理；置于55 ℃水浴24 h后，冻干，环氧已烷灭菌备用。根据前期研究结果，将磷酸钙骨水泥粉与骨基质明胶骨粉按质量比5∶1混合，制成磷酸钙/骨基质明胶固相粉末。

PLGA微球制备^[4]：将1.0 g PLGA溶于4 mL二氯甲烷中；注入500 μL ddH₂O，9 000 r/min高速剪切1 min，形成初乳；将初乳液快速加入到20 mL 4%聚乙烯醇中，高速剪切2 min；转移至盛装有400 mL 2%异丙醇及400 mL 0.3%聚乙烯醇的1 000 mL烧杯中，在24 ℃下低速搅拌 5 h，使有机溶剂挥发；静置20 min，弃上清，以2 000 r/min离心5 min；加5 mL ddH₂O漂洗，弃上清，离心，反复漂洗，收集微球，冷冻干燥。

多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥的制备：固相为PLGA微球与磷酸钙/骨基质明胶粉末，根据课题组前期研究结果^[5-6]，设置PLGA微球加入的质量分数分别为0，5%，10%，所制备的复合骨水泥分别设为空白组、5%组、10%组。液相为1 mol/L PBS，固液比为1 g∶0.6 mL。将各组复合骨水泥固相和液相在室温混合，搅拌均匀，分别注入d=6 mm、h=12 mm的标准模具中，制成6 mm×12 mm样本，室温下干燥10 min后，37 ℃水浴24 h，再置于37 ℃烤箱中干燥至恒质量，脱模、取样，以备下一步实验。

1.4.2 理化特性检测

扫描电镜观察：将上述样本干燥后，手工折断成自然断裂样本，断面经真空镀膜仪喷金处理，扫描电子显微镜观察形貌特征。

凝固时间检测：采用Gillmore双针法测定复合骨水泥的初凝时间和终凝时间^[7-8]。采用质量较轻、横截面积较大(质量为110 g，直径为2 mm)的Gillmore针测试，小心地把压头垂直降落到固相和液相混合物表面，在复合骨水泥调和均匀注入模具后即开始，直至表面不能观察到明显圆形压痕所需时间即为初凝时间。用质量较重、横截面积较小(质量为300 g，直径为1 mm)的Gillmore针测试，小心地把压头垂直降落到固相和液相混合物表面，在复合骨水泥调和均匀注入模具后即开始，从开始到表面不能观察到明显圆形压痕所需时间即为终凝时间。

可注射性观察：采用Habraken等^[9]的方法，用推力与时间的关系来测定骨水泥的可注射性。将复合骨水泥浆体转移至5 mL一次性注射器中，待到骨水泥抽丝期早期推入容器中。推注时，助手将一次性注射器固定于垂直位，用推力计垂直向下推注，每10 s计录样品不同时间点的推力大小。

抗溃散性观察：将复合骨水泥浆体注入盛装37 ℃ PBS的培养皿中，静置后再震荡液体，观察样本溃散情况。

孔隙率测定：采用阿基米德排水法测量样本孔隙率。将制备的6 mm×12 mm样本烘干至恒质量后，称质量为m₀。用细丝线固定并放入超纯水中浸泡，加热至水沸腾2 h，使样本中的空气完全排除，冷却后取出样本，悬浮于纯水中，称质量记为m₁。再用滤纸吸干样本表面的水分，称质量记为m₂。记录各样本称量值，计算孔隙率(ρ)，每组测量5个样本，求平均值，计算公式：

Ρ=[(m₂-m₀)/m₁]×100%。

体外降解实验：将样本放入盛装有10 mL灭菌PBS的离心管中，密封后置于37 ℃恒温箱中，每周更换液体，分别于第2，4，6，8，12周取出样本，干燥、称量，计算失重率。

X射线衍射分析：样本干燥后，在玛瑙砵中研磨成粉末，压片后置于X射线粉末衍射仪上分析物相。

生物力学测试：将各组样本置于生物力学试验机上行抗压测试，加载速度为1 mm/min，计算抗压强度(P)和弹性模量(E)。

1.4.3 细胞毒性实验取SD大鼠5只，采用全骨髓贴壁培养法提取大鼠骨髓间充质干细胞^[10]，通过倒置显微镜观察干细胞形态和生长情况，取第3代对数生长期的骨髓间充质干细胞备用。

将3组复合骨水泥材料各1 g经紫外线消毒，置于培养瓶中，按材料质量/液体体积比1 g/10 mL加入含体积分数10%胎牛血清及青-链霉素的低糖DMEM培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂条件下孵育48 h，离心取上清液，经 0.22 μm过滤器过滤得到材料浸提液^[11]。

将3种材料浸提液分别与6×10⁷ L^-1的骨髓间充质干细胞共培养，于培养的第1，3，5，7，14天，按CCK-8试剂盒操作说明，用酶标仪测量各孔溶液在450 nm处的吸光度，计算出各组细胞增殖数据。

1.4.4 动物实验将30只新西兰健康幼兔随机分为3组，经耳缘静脉用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉，麻醉成功后固定，备皮，消毒铺巾，取后正中切口，在L₃椎体右前方用薄椎板咬骨钳(刃宽4 mm、刃长3 mm)作长×宽×深为 4 mm×3 mm×3 mm均一性较好的标准骨缺损模型，根据分组在缺损中分别植入空白组、5%组和10%组骨水泥材料。缝合切口皮肤，肌肉注射青霉素20×10⁴ U预防感染。术后12周取材，将标本置于Micro-CT样本架上扫描，所得图像经三维可视化重建及骨骼分析软件INVEON(西门子，德国)后处理，对椎体内复合材料植入的感兴趣选取，分析骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和骨小梁分离度。

1.5 主要观察指标多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥的理化特性、细胞毒性及体内成骨性能。

1.6 统计学分析所得数据以x(_)±s表示，用SPSS 16.0软件包(version 22.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)进行统计分析，计量资料采用分组t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨水泥可操作性是临床使用的重要参数，常用的指标有凝固时间、可注射性、抗溃散性。骨水泥要具有可操作性，其初凝时间应不低于4-8 min，终凝时间不超过30 min，

可操作时间不少于10 min^[8]。课题研究表明随着PLGA微球质量分数的增加，复合骨水泥的凝固时间、可操作时间逐步缩短，加入10%PLGA微球时凝固时间不能满足临床需要，加入5%PLGA微球时可满足临床需要。

可注射性是骨水泥可操作性的又一重要指标，它与注射时的推力、桨体的均一性和注射系统管壁的凝结程度密切相关。文献报道可通过注射能力系数、推力、或注射压力的测量来定量观察^[11]。此次研究表明：空白组、5%组、10%组均有可注射性，但随着PLGA微球的比例增加，可注射性维持时间变短，各组在终凝时间附近推力迅速增高到不具有可注射性。此次研究与文献报道一致，在磷酸钙骨水泥中加入PLGA微球，骨水泥的可注射时间缩短，随着微球加入比例增加缩短更明显。

抗溃散性是骨水泥在动态液体环境内不碎裂成小块的能力，抗溃散性大小与骨水泥间和周围液体的渗透压相关，渗透压差越大，骨水泥颗粒间的相互作用力越大，抗溃散性越好^[12-13]。此次研究发现：PLGA微球的加入，骨水泥抗溃散性减弱，其中10%组不具有抗溃散性。综合分析各组可操作性表明：10%组凝固时间太短，不具有抗溃散性，不能用于临床；而5%组的凝固时间、可注射性、抗溃散性能满足临床操作要求，可作为填充材料应用于临床。

磷酸钙骨水泥硬化凝固过程中自身会形成一些微孔，微孔直径在亚微米到微米之间，骨组织长入需要的孔隙大小为100 μm左右。孔隙大，骨组织容易长入，但相应力学强度越差^[14-15]。早期用造孔法(如CO₂发泡法、粒子沥虑法)增加的孔隙大小及分布难以控制，而PLGA由乳酸和羟基乙酸两种单体聚合而成，具有良好的生物相容性，可被人体代谢，降解终产物是水和二氧化碳，已被广泛用于药物载体^[16]。用PLGA制作的微球在复合材料内快速降解，材料降解后内部留下的孔隙有利于组织长入；并且PLGA微球降解后形成的酸性环境会加速磷酸钙骨水泥降解^[17-18]。

研究将PLGA空白微球与骨基质明胶和磷酸钙骨水泥复合，孔隙率由不加PLGA微球时的49%增大到加入5% PLGA微球时的55%，加入10%微球时增大为58%。随着微球的加入，复合材料的抗压强度与弹性模量明显降低^[19]。研究结果显示，加入PLGA微球的多孔PLGA/磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥抗压强度超过松质骨强度，可达到皮质骨1/2-1/4的强度，有望用于承重部位的骨缺损修复。此次研究与文献报道一致，孔隙率越大抗压强度越小。Liu等^[20]研究发现材料孔隙率增加1%，力学强度从31 MPa下降到24 MPa。X射线粉末衍射分析发现，PLGA微球的加入不改变多孔PLGA/磷酸钙/骨基质明胶的结晶时间，但对峰值有影响，这表明PLGA微球对其结晶的程度有影响，但不影响结晶产物。

磷酸钙骨水泥在生理条件下降解，并参与新陈代谢，促进骨组织生长，但降解缓慢。引入大孔可以明显提高磷酸钙骨水泥被吸收速率^[21-22]。研究发现随着PLGA微球迅速降解，复合PLGA微球的磷酸钙/骨基质明胶材料内形成相互连接的孔隙，随着微球含量增多，孔隙越明显。复合有PLGA微球的材料降解更明显，这与PLGA降解后产生的酸性产物进一步溶解复合材料有关；同时PLGA迅速降解后的孔隙也有利于组织液渗入，有助于材料降解与吸收^[23]。

材料植入人机体可能会产生各种反应，甚至出现排斥及溶血反应，这就要求材料具有较好的生物相容性。生物相容性包括细胞相容性和组织相容性^[24-25]，细胞毒性是细胞相容性的重要指标。CCK-8细胞增殖毒性检测实验，可通过细胞内的脱氢酶与CCK-8溶液中相关物质相互反应来测定溶液中的活细胞数量，反映细胞毒性^[26-27]。研究将各组材料浸提液与大鼠骨髓间充质干细胞共培养，结果表明磷酸钙/骨基质明胶复合材料无明显细胞毒性，但对细胞增殖无明显促进作用，加入PLGA微球后复合材料对细胞增殖有明显促进作用。

复合材料的生物相容性可通过对动物体内骨缺损修复重建来评估。对骨缺损修复的主要机制有骨传导和骨诱导两种，骨传导是以材料为支架，新生血管、新生骨沿着孔隙长入材料内部，破骨细胞导致材料的逐步降解吸收，成骨细胞形成新骨不断修复骨缺损，最终完成材料的降解和骨缺损的重建^[28-29]；骨诱导是通过人工复合材料携带的生长因子对间充质细胞的趋化、诱导，使其分化为成软骨细胞和成骨细胞，完成骨组织的再生与修复^[30-32]。加入PLGA微球的磷酸钙/骨基质明胶复合材料显示了优越的生物活性，植入兔骨缺损处的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量及骨小梁分离度与磷酸钙/骨基质明胶材料相比有明显优势。结果表明，多孔PLGA/磷酸钙/骨基质明胶组同时具有骨传导和骨诱导活性。早期以磷酸钙骨水泥材料为支架，周围新生血管、新生骨长入^[33]；随着PLGA微球的迅速降解，微球降解后留下的大孔有助于组织液的渗入、血管与新生骨长入，这时材料内部的骨基质明胶与之充分接触，骨基质明胶内的骨形态发生蛋白发挥作用，诱导间充质干细胞分化为成软骨细胞和成骨细胞^[34-36]。实验结果证实，多孔PLGA/磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥材料构兼具骨诱导活性和骨传导作用，可有效修复兔椎体骨缺损。

综上，PLGA微球与磷酸钙/骨基质明胶复合，可增大材料孔隙，形成多孔复合材料，随着PLGA微球比例增多，孔隙率增大。加入PLGA微球的复合材料生物力学强度下降，但不影响材料结晶的终产物。PLGA/磷酸钙/骨基质明胶复合材料在体外可降解，PLGA微球可促进磷酸钙/骨基质明胶降解。10%组虽然有较好的孔隙率，但力学强度差、凝固时间短、抗溃散性差，不具有临床可操作性，而5%组可操作性较好，孔隙率为55%，抗压强度为51 MPa，体外降解较好，有良好的组织相容性，可有效促进兔椎体骨缺损修复，有望成为的一种新的骨修复材料，但其性能及应用还有待进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

310

HTML			PDF

最新录用	在线预览	正式出版	最新录用	在线预览	正式出版
0	0	0	0	0	310

来源	本网站	其他网站

次数	237	73
比例	76%	24%

摘要

382

最新录用	在线预览	正式出版

0	0	382

	来源	本网站

	次数	382
	比例	100%