miRNA-520a-3p调控MAP3K2表达对肺癌干细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0504

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 2051-2056.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0504

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miRNA-520a-3p调控MAP3K2表达对肺癌干细胞凋亡的影响

鄢俊¹，钟志宏²，施华球¹

¹赣南医学院第一附属医院肿瘤科，江西省赣州市 341000；²赣南医学院农村(社区)医学教育研究中心，江西省赣州市 341000

修回日期:2018-03-29 出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 施华球，硕士，副主任医师，副教授，赣南医学院第一附属医院肿瘤科，江西省赣州市 341000
作者简介:鄢俊，男，1979年生，江西省德兴市人，2009年南昌大学医学院毕业，硕士，主治医师，讲师，主要从事肿瘤学方面的研究。
基金资助:
江西省卫生厅科技计划课题(20143129)

MicroRNA-520a-3p induces apoptosis in lung cancer stem cells via modulation of MAP3K2

Yan Jun¹, Zhong Zhi-hong², Shi Hua-qiu¹

¹Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China; ²Rural (Community) Medical Education Research Center, Gannan Medical University, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China

Revised:2018-03-29 Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Shi Hua-qiu, Master, Associate chief physician, Associate professor, Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China
About author:Yan Jun, Master, Attending physician, Lecturer, Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China
Supported by:
the Scientific Plan of Jiangxi Health Department, No. 20143129

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
微小RNA (microRNAs，miRNAs)：是一类长度18-22个核苷酸的非编码小RNA分子，miRNAs异常表达与疾病发生密切相关，miRNAs参与多种细胞生理过程，如增殖、分化、侵袭、迁移和凋亡等。随着对肿瘤干细胞相关miRNAs的深入研究，其在维持肿瘤干细胞的干细胞特性中发挥重要的调控作用。
肺癌干细胞：又称肿瘤起始细胞，是一类能不断自我更新的未分化的肿瘤细胞，具有极强的致瘤性，参与肿瘤的癌变及恶性进展等各个过程。近年来的研究认为，肿瘤干细胞与肿瘤发生、复发等密切相关，靶向抑制肿瘤干细胞是根治肿瘤的很有潜力的研究方向。

摘要
背景：有研究证实，miRNA-520a-3p在肺癌干细胞中有一定调节作用，但具体功能和作用机制尚不明确。
目的：探索miRNA-520a-3p对肺癌干细胞凋亡的影响，并对其作用机制进行初步研究。
方法：采用免疫磁珠法从肺腺癌细胞株A549中分离出CD133⁺肺癌干细胞。实时荧光定量PCR检测miRNA- 520a-3p在CD133⁺肺癌干细胞中的表达。采用脂质体转染法增加CD133⁺肺癌干细胞中miRNA-520a-3p表达水平，流式细胞术检测过表达miRNA-520a-3p对CD133⁺肺癌干细胞凋亡的影响。双荧光素酶报告基因实验检测miRNA-520a-3p对MAP3K2基因的调控作用。Western Blotting检测过表达miRNA-520a-3p对CD133⁺肺癌干细胞中MAP3K2，Bcl-2和Caspase-3 蛋白表达的影响。
结果与结论：①在CD133⁺肺癌干细胞中，miRNA-520a-3p表达水平显著低于CD133^-肺癌细胞(P < 0.05)；②过表达miRNA-520a-3p后，显著增加了CD133⁺肺癌干细胞凋亡百分比(P < 0.05)；③抑制miRNA-520a-3p表达能够显著增强含有MAP3K2基因3’-非翻译区(3’-UTR)报告质粒的荧光素酶活性(P < 0.05)，增加miRNA-520a-3p表达能够显著降低含有MAP3K2基因3’-UTR报告质粒的荧光素酶活性(P < 0.05)；④过表达miRNA-520a-3p后，CD133⁺肺癌干细胞中MAP3K2，Bcl-2蛋白表达降低(P均 < 0.05)，而Caspase-3蛋白表达增加(P < 0.05)；⑤结果表明，在CD133⁺肺癌干细胞中，miRNA-520a-3p呈低表达状态。miRNA- 520a-3p可能通过调控MAP3K2基因表达，诱导CD133⁺肺癌干细胞凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5797-1594(鄢俊)

关键词: miRNA-520a-3p, 肺癌, 肿瘤干细胞, CD133, MAP3K2, 细胞凋亡, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Studies have confirmed that microRNA (miR)-520a-3p has a regulatory role in lung cancer stem cells, but the specific function and mechanism of action are still unknown.
OBJECTIVE: To investigate the influence of miR-520a-3p on the apoptosis of lung cancer stem cells, and to explore the underlying mechanism.
METHODS: The magnetic activated cell sorting method was utilized to separate the CD133⁺ lung cancer stem cells from the lung cancer A549 cell line. The expression of miR-520a-3p in the lung cancer stem cells was determined by the real-time PCR assay. Liposome transfection assay was used to up-regulate the miR-520a-3p expression level in the lung cancer stem cells, and flow cytometry assay was applied to detect the influence of miR-520a-3p expression on the apoptosis of the lung cancer stem cells. Moreover, the modulation of MAP3K2 gene by the miR-520a-3p was analyzed by the dual-luciferase reporter gene assay, and the influence of miR-520a-3p expression on the protein expression of MAP3K2, Bcl-2 and Caspase-3 was analyzed by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The real-time PCR showed that the expression level of miR-520a-3p in CD133⁺ lung cancer stem cells was significantly lower than that in the CD133^- lung cancer cells (P < 0.05). Overexpression of miR-520a-3p significantly increased the apoptotic rate of CD133⁺ lung cancer stem cells (P < 0.05). The dual-luciferase reporter gene assay results suggested that inhibition of miRNA-520a-3p could increase the luciferase activity of the reporter plasmids containing the 3’-untranslated region (3’-UTR) of MAP3K2 gene (P < 0.05), and overexpression of miR-520a-3p could decrease the luciferase activity of the reporter plasmids containing the 3’-UTR of MAP3K2 gene (P < 0.05). Moreover, miR-520a-3p overexpression also decreased the protein levels of MAP3K2 and Bcl-2 in the CD133⁺ lung cancer stem cells, P < 0.05), and increased the Caspase-3 protein level (P < 0.05). To conclude, in the lung cancer stem cells, miR-520a-3p was in a low-expressed status. miR-520a-3p could inhibit the expression of MAP3K2 gene, thereby inducing the cell apoptosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Lung Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, MAP Kinase Kinase Kinase 2, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

鄢俊，钟志宏，施华球. miRNA-520a-3p调控MAP3K2表达对肺癌干细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2051-2056.

Yan Jun, Zhong Zhi-hong, Shi Hua-qiu. MicroRNA-520a-3p induces apoptosis in lung cancer stem cells via modulation of MAP3K2[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2051-2056.

图/表（结果） 1

2.1 免疫磁珠细胞分选肺癌干细胞 采用免疫磁珠法在肺腺癌A549细胞系中分离CD133⁺肺癌干细胞，流式细胞仪检测分选前后CD133⁺细胞比例。分选后CD133⁺细胞比例显著高于分选前，差异有显著性意义(t=-45.706，P=0.000)，见图1。

2.2 miRNA-520a-3p在CD133⁺肺癌干细胞中的表达 采用real-time PCR技术检测CD133⁺细胞中miRNA-520a-3p表达，以CD133^-细胞为对照。结果显示，CD133⁺细胞中miRNA-520a-3p相对表达量显著低于CD133^-细胞，差异有显著性意义(t=-9.636，P=0.000)，见图2。

2.3 miRNA-520a-3p促进CD133⁺肺癌干细胞凋亡 转染miRNA-520a-3p mimics至CD133⁺细胞中48 h后，流式细胞术检测结果显示，实验组细胞的凋亡比例(52.32±4.83)%显著高于空白对照组(18.32±2.84)%和阴性对照组(19.12± 2.99)%，差异均有显著性意义(t=10.510，P=0.000；t=10.123，P=0.000)，而空白对照组和阴性对照组之间差异无显著性意义(t=-0.336，P=0.377)，见图3。

2.4 MiRNA-520a-3p靶向调节MAP3K2基因表达 HEK-293T细胞中，miRNA-520a-3p mimics+pmirGLO- MAP3K2-3’-UTR wt组的相对荧光强度(0.42±0.08)显著低于miRNA-520a-3p mimics+pmirGLO空载体对照组(1.04±0.13)和miRNA-520a-3p mimics+pmirGLO- MAP3K2-3’-UTR mut组(0.99±0.15)，差异均有显著性意义(t=-7.035，P=0.001；t=-5.807，P=0.002)，而miRNA-520a- 3p mimics+pmirGLO空载体对照组和miRNA-520a-3p mimics+pmirGLO-MAP3K2-3’-UTR mut组之间差异无显著性意义(t=0.436，P=0.343)，见图4。

2.5 miRNA-520a-3p对MAP3K2蛋白及凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase-3表达的影响 Western Blotting检测结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，实验组细胞中的MAP3K2蛋白水平显著降低，差异有显著性意义(t=11.209，P=0.000；t=11.529，P=0.000)，空白对照组和阴性对照组之间差异无显著性意义(t=-0.231，P=0.414)，见图5；与空白对照组和阴性对照组相比，实验组细胞中的Bcl-2蛋白水平均显著降低，差异有显著性意义(t=4.038，P=0.008；t=3.798，P=0.010)，空白对照组和阴性对照组之间差异无显著性意义(t=0.201，P=0.425)，见图5；实验组细胞中的Caspase-3蛋白水平(1.08±0.12)显著高于空白对照组(0.09±0.02)和阴性对照组(0.10±0.03)，差异有显著性意义(t=14.095，P=0.000；t=13.723，P=0.000)，空白对照组和阴性对照组之间差异无显著性意义(t=-0.480，P=0.328)，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年3至9月在赣南医学院临床医学重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验相关细胞 人肺腺癌细胞株A549和HEK-293T细胞均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.3.2 实验相关试剂 DMEM/F12培养基、DMEM培养基、胎牛血清、双抗(青霉素和链霉素)、0.25%胰酶(含EDTA)、B27细胞培养添加剂、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子(美国Invitrogen生命技术有限公司)；CD133抗体(ab19898)、兔抗人MAP3K2单克隆抗体(ab33918)、兔抗人Caspase-3单克隆抗体(ab32150)、兔抗人Bcl-2单克隆抗体(ab32124)和兔抗人GAPDH多克隆抗体(ab9485)(美国Abcam公司)；CD133免疫磁珠(德国Miltenyi公司)；CD133-PE抗体(KTB0587)(上海博耀生物科技有限公司)；Trizol试剂和Lipofectamine^®3000(美国Invitrogen公司)；RNA提取试剂盒和反转录试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；real-time PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；SYBR荧光定量试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；miRNA-520a-3p mimics、miRNA无关序列和miRNA-520a-3p inhibitor(上海吉玛制药技术有限公司)；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(KGA106)(江苏凯基生物技术股份有限公司)；pmirGLO双荧光素酶报告基因载体(上海诺辰生物技术有限公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027)、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、HRP标记二抗和ECL发光液(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3.3 实验相关仪器 二氧化碳培养箱(MCO-15AC，日本Sanyo公司)；流式细胞仪(CytoFLEX，美国Beckman公司)；Nanodrop分光光度计(ND-2000，美国Thermo公司)；定量PCR扩增仪(LightCycler^®480，瑞士罗氏公司)；凝胶成像仪(4100，上海天能科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 人肺腺癌细胞株A549培养于DMEM/ F12培养基(含体积分数为10%胎牛血清和双抗)，HEK-293T细胞培养于DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清和双抗)，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度的培养箱中。

取对数生长期的A549细胞，加入胰酶消化后，按1︰2的比例进行传代，接种于含有2% B27、20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的无血清DMEM/F12培养基中，置于培养箱中继续培养，取第3-10代细胞进行实验。

1.4.2 免疫磁珠法分选CD133⁺肺癌干细胞 将第3代A549细胞培养于无血清DMEM/F12培养基中，调整细胞浓度至2×10¹⁰ L^-¹，加入10 μg CD133抗体，4 ℃孵育20 min，清洗后，重悬细胞，再加入40 μL CD133免疫磁珠，充分结合后，再次清洗，重悬细胞，进入分选柱分选，吸附在分选柱中的细胞为CD133⁺细胞(即肺癌干细胞)，流出的细胞为CD133^-细胞。

1.4.3 流式细胞仪检测CD133⁺细胞比例 将分选前及分选后的细胞用PBS溶液调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，分别加入20 μL CD133-PE抗体混匀，室温避光孵育20 min，PBS清洗，40 g/L多聚甲醛对细胞进行重悬，上流式细胞仪检测。

1.4.4 实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测miRNA- 520a-3p表达 Trizol法提取CD133⁺细胞和CD133^-细胞总RNA，操作步骤参照RNA提取试剂盒的说明书。Nanodrop分光光度计检测总RNA浓度及纯度(A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.8-2.0之间)，cDNA反转录试剂盒进行反转录，cDNA产物置于-20 ℃保存备用。Real-time PCR引物序列如下，miRNA-520a-3p正向引物：5'-ACA CTC CAG CTG GGA AAG TGC TTC CC-3'，miRNA-520a-3p反向引物：5'-CTC AAC TGG TGT CGT GGA-3'；内参U6正向引物：5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'，U6反向引物：5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'。Real-time PCR扩增体系为10 μL，反应条件如下，预变性：95 ℃，30 s；PCR循环：95 ℃，变性15 s；60 ℃，退火20 s；70 ℃，延伸20 s，进行40个循环；熔解曲线分析：95 ℃，5 s→60 ℃，30 s。采用2^-^??Ct方法表示miRNA-520a-3p相对表达量。每个样品进行3次独立重复实验后，进行统计分析。

1.4.5 细胞转染实验 取对数生长期的CD133⁺细胞约4×10⁵个，接种于6 cm培养皿中，24 h后采用脂质体Lipofectamine^®3000将miRNA-520a-3p mimics(实验组)和miRNAs无关序列(阴性对照组)转染至细胞中，以不转染的细胞为空白对照组。转染4-6 h后，更换培养液，转染后48 h进行相关实验。

1.4.6 流式细胞术(FACS)检测细胞凋亡 转染后48 h，采用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡百分比，具体操作如下：收集各组细胞，PBS洗涤2次，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，随后加入5 μL Annexin V-FITC混匀，再加入5 μL PI混匀，室温避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡百分比。取3个不同批次的细胞进行重复实验后，进行统计分析。

1.4.7 双荧光素酶报告实验 PCR扩增克隆人MAP3K2基因3’-非编码区(3’-UTR)，经限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ酶切后，插入双荧光素酶报告基因载体pmirGLO，重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定，构建含有MAP3K2基因3’-UTR的报告基因质粒pmirGLO-MAP3K2-3’-UTR wt，同时构建含有突变MAP3K2基因3’-UTR的报告基因质粒pmirGLO-MAP3K2-3’-UTR mut。

取对数生长期的HEK-293T细胞接种于24孔板中，汇合度在70%-80%时，脂质体Lipofectamine^®3000共转染miRNA-520a-3p inhibitor/miRNA-520a-3p mimics与报告基质粒pmirGLO-MAP3K2-3’-UTR wt(或者pmirGLO- MAP3K2-3’-UTR mut或者pmirGLO空载体)；每组设3个复孔，重复3次。转染4-6 h后，更换培养液，转染后48 h参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作步骤，上单管型荧光检测仪进行检测，计算荧火虫荧光素酶荧光值相对海肾荧光素酶荧光值的比值，即相对荧光强度。重复3次独立实验后，进行统计分析。

1.4.8 Western Blotting实验 收集各组细胞约5×10⁵个，加入RIPA蛋白裂解液，提取细胞全蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。10% SDS-PAGE胶电泳分离蛋白后，湿转法将蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温振荡封闭1 h，TBS-T洗膜，分别加入MAP3K2、Bcl-2、Caspase-3和GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜，TBS-T洗膜后，加入HRP标记二抗，室温孵育1 h，加入ECL发光液进行化学发光显影，凝胶成像仪对蛋白条带进行观察，获取图像，并采用Image J软件对图像进行灰度分析，计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值。实验重复3次后，进行统计分析。

1.5 主要观察指标 ①流式细胞仪检测CD133⁺细胞比例；②real-time PCR检测miRNA-520a-3p相对表达量；③流式细胞术检测细胞凋亡百分比；④Western Blotting检测MAP3K2、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用统计软件SPSS 19.0进行统计学分析。计量资料以x(_)±s的形式表示，两独立样本间的比较采用双尾t 检验，多组独立样本的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近年来的研究认为，肿瘤干细胞与肿瘤发生、复发等密切相关，靶向抑制肿瘤干细胞是根治肿瘤的很有潜力的研究方向^[18-19]。目前，很多研究者利用流式细胞术、免疫磁珠法等技术进行分选^[20-21]，并通过分析干细胞标志物的表达证实肺癌组织中确实存在肿瘤干细胞，且肺癌干细胞被认为是导致肿瘤无法完全根除、复发的主要原因^[22]。

CD133是多种实体肿瘤干细胞共同的表面标志物，CD133⁺表型细胞具有较高自我更新和体内成瘤的能力^[23-24]。Eramo等^[25]从人肺癌组织中分离出CD133⁺表型细胞，这些细胞具有明显的自我更新、多向分化以及较强的成瘤能力，由此认为，分选出的CD133⁺肺癌细胞即是肺癌干细胞。实验采用免疫磁珠技术，从肺腺癌A549细胞株中分选出CD133⁺肺癌干细胞，经流式细胞术检测结果显示，分选后CD133⁺细胞比例显著高于分选前，差异有显著性意义(t=-45.706，P=0.000)，Ho等^[26]利用流式细胞技术对肺癌细胞系进行干细胞分选，发现肺癌细胞系中干细胞含量为1.5%-6.1%，作者研究结果与Ho等的结果一致。

成熟的miRNAs可以与靶基因的mRNA的3’-UTR特异性结合，导致mRNA降解或抑制mRNA翻译成蛋白质，最终调控靶基因表达。研究证实，miRNA-520在食管鳞状细胞癌^[27]、乳腺癌等肿瘤中具有抑癌基因的功能^[28]。miRNA-520a-3p在非小细胞肺癌和小细胞肺癌组织中表达下降，提示miRNA-520a-3p可能在肺癌肿瘤形成过程中发挥抑癌基因的功能^[29]。实验结果发现，与CD133^-细胞相比，CD133⁺细胞中miRNA-520a-3p表达下降，提示在肺癌干细胞中miRNA-520a-3p表达降低，可能与维持肺癌干细胞的干性特征相关。

目前关于miRNAs的研究中，大多通过加入miRNAs模拟物或者抑制物，改变细胞中目标miRNAs的含量，检测目标miRNAs的功能^[30-31]。实验成功将miRNA-520a-3p mimics转染至CD133⁺肺癌干细胞，并且发现miRNA- 520a-3p能够诱导CD133⁺肺癌干细胞发生凋亡。

在结肠癌细胞中，miRNA-520a-3p可调控表皮生长因子受体基因表达^[32]，在乳腺癌细胞中，miRNA-520a-3p可调控CCND1和CD44基因表达^[33]，本实验通过生物信息学分析，提示MAP3K2可能是miRNA-520a-3p的调控靶基因，双荧光素酶报告基因实验结果证实了上述的分析结果。研究表明，MAP3K2也是miRNA-186^[34]、miRNA-34c-3p^[35]、miRNA- BART18-5p^[36]、miRNA-17-5p和miRNA-20a的调控靶基因^[37]，MAP3K2是一个能够促进细胞增殖、分化和侵袭的重要蛋白，MAP3K2高表达与肿瘤细胞不良病理特征密切相关^[38]。实验结果显示，增加CD133⁺肺癌干细胞中miRNA-520a-3p表达后，MAP3K2蛋白表达下降，同时具有促进凋亡功能的Caspase-3蛋白表达增加，具有抑制凋亡功能的Bcl-2蛋白表达降低，提示miRNA-520a-3p可能通过下调MAP3K2基因表达，进而促进细胞凋亡。

综上所述，实验采用免疫磁珠技术，成功分选出CD133⁺肺癌干细胞，并且发现miRNA-520a-3p在CD133⁺肺癌干细胞中表达降低，增加miRNA-520a-3p表达后，可能通过抑制MAP3K2基因表达，诱导细胞凋亡。由此推测，CD133⁺肺癌干细胞中miRNA-520a-3p低表达可能参与了抑制细胞凋亡过程，在维持肺癌干细胞增殖中发挥促进作用。MiRNA-520a-3p具有作为肺癌干细胞治疗的生物靶标的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

miRNA-520a-3p调控MAP3K2表达对肺癌干细胞凋亡的影响

MicroRNA-520a-3p induces apoptosis in lung cancer stem cells via modulation of MAP3K2

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