牛磺酸联合脐带间充质干细胞移植修复酒精性肝损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.016

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
牛磺酸：又称β-氨基乙磺酸，最早从牛黄中分离出来，纯品为无色或白色斜状晶体，无臭，牛磺酸化学性质稳定，不溶于乙醚等有机溶剂，是一种含硫的非蛋白氨基酸，在体内以游离状态存在，不参与体内蛋白的生物合成。牛磺酸虽然不参与蛋白质合成，但它却与胱氨酸、半胱氨酸的代谢密切相关。人体合成牛磺酸的半胱氨酸亚硫酸羧酶活性较低，主要依靠摄取食物中的牛磺酸来满足机体需要。
细胞色素氧化酶P450(cytochrome P450, CYP450)超家族：是重要的生物转化酶系，根据1993年Nelson等科学家制定的，根据P450分子的氨基酸序列的统一命名法，CYP450可以被进一步分为几个族。涉及大多数药物代谢的CYP450酶系主要有CYP1，CYP2，CYP3 3个族，CYP1A2酶亚家族主要在肝脏表达，占体内CYP450酶总量的13%，仅次于CYP3A酶和CYP2C酶，居第3位。代谢临床5%-10%的常规应用药物，故CYP1A2酶的活性与许多药物的疗效或毒性相关，其还参与多种与癌症发生密切相关的化学性毒物(如亚硝胺)和内源性激素的代谢，具有重要的药理学和毒理学意义。CYP1A2酶基因多态性和表型差异的研究，可用于评价临床药物治疗效果。

摘要
背景：研究表明，脐带间充质干细胞可以诱导分化成肝样细胞，从而对肝损伤有一定的修复作用。
目的：探讨牛磺酸与人脐带间充质干细胞移植联合治疗对肝损伤的修复作用。
方法：48只健康SD大鼠给予56度白酒灌胃30 d建立慢性酒精性肝损伤模型，建模后将其随机分为模型组，脐带间充质干细胞组及牛磺酸+脐带间充质干细胞组。模型组门静脉注射生理盐水1 mL，脐带间充质干细胞组门静脉移植1 mL脐带间充质干细胞悬液，牛磺酸+脐带间充质干细胞组门静脉注射牛磺酸0.28 g/L+1 mL脐带间充质干细胞悬液。移植后2周，检测各组大鼠血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、丙氨酸氨基转移酶以及丙二醛、内毒素、白细胞介素4水平；采用RT-PCR方法检测肝细胞特征性功能蛋白CYP2B1的mRNA表达。
结果与结论：①与模型组相比较，脐带间充质干细胞组、牛磺酸+脐带间充质干细胞组超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、谷丙转氨酶水平均显著增高(P < 0.05)，丙二醛、内毒素、白细胞介素4水平均显著下降(P < 0.05)。与脐带间充质干细胞组比较，牛磺酸+脐带间充质干细胞组超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、谷丙转氨酶水平进一步增高(P < 0.05)，丙二醛、内毒素、白细胞介素4水平进一步下降(P < 0.05)；②与模型组、脐带间充质干细胞组比较，肝细胞特征性功能蛋白CYP2B1的mRNA表达在牛磺酸+脐带间充质干细胞组显著增高，差异有显著性意义(P < 0.05)；③以上实验结果表明，脐带间充质干细胞移植可以修复大鼠肝损伤，与牛磺酸联合使用后效果更佳，其可能与减少自由基对机体的损害有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9599-1323(李海涛)

关键词: 干细胞, 移植, 牛磺酸, 脐带间充质干细胞, 酒精性肝损伤, CYP2B1

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) can be induced to differentiate into liver cells, playing a role in liver repair.
OBJECTIVE: To explore the effect of taurine combined with UC-MSCs transplantation on liver injury repair.
METHODS: Forty healthy Sprague-Dawley rats were used to make chronic alcoholic liver injury models through intragastric administration of 56 degrees liquor, and then randomized into model group, UC-MSCs group and combined treatment group (taurine combined with UC-MSCs transplantation). Model rats were given portal vein injection of 1 mL normal saline in the model group, 1 mL UC-MSCs suspension in the UC-MSCs group, and 0.28 g/L taurine plus 1 mL UC-MSCs in the combined treatment group. Two weeks after transplantation, levels of serum superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, alanine aminotransferase, malondialdehyde, endotoxin and interleukin-4 were detected. RT-PCR was used to detect CYP2B1 mRNA expression.
RESULTS AND CONCLUSION: Levels of serum superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase and alanine aminotransferase were highest in the combined treatment group, higher in the UC-MSCs group and lowest in the model group (P < 0.05). The levels of malondialdehyde, endotoxin and interleukin-4 were ranked as follows: combined treatment group < UC-MSCs group < model group (P < 0.05). RT-PCR findings showed that the CYP2B1 mRNA expression was increased significantly in the combined treatment group as compared with the UC-MSCs and model groups (P < 0.05). Taken together, our experimental findings suggest that UC-MSCs transplantation, especially in combination with taurine, can promote recovery from liver injury in rats, which is probably related to a reduction in free radicals that trigger a damage to the body.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Taurine, Liver Diseases, Alcoholic, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李海涛，陈超. 牛磺酸联合脐带间充质干细胞移植修复酒精性肝损伤[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.016.

Li Hai-tao, Chen Chao. Taurine combined with umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation for liver injury repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.016.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] Weiss ML, Medicetty S, Bledsoe AR, et al. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells. 2006;24(3):781-792.

[2] Can A, Karahuseyinoglu S. Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stem cells. Stem Cells. 2007;25(11):2886-2895.

[3] Rachakatla RS, Marini F, Weiss ML, et al. Development of human umbilical cord matrix stem cell-based gene therapy for experimental lung tumors.Cancer Gene Ther. 2007;14(10): 828-835.

[4] Rachakatla RS, Pyle MM, Ayuzawa R, et al. Combination treatment of human umbilical cord matrix stem cell-based interferon-beta gene therapy and 5-fluorouracil significantly reduces growth of metastatic human breast cancer in SCID mouse lungs. Cancer Invest. 2008;26(7):662-670.

[5] 马桂霞,何红燕,罗敏杰,等. 人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的实验研究[J].实用儿科临床杂志,2008,23(8):618-620.

[6] 杨晓蕾,陈智聪,廖继东,等.尼克酰胺对人脐带间充质干细胞的保护效应[J].中国病理生理杂志,2015,31(10):1756-1761.

[7] 孙国栋,李志忠,王晶,等.人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究[J].西安交通大学学报:医学版,2010, 31(2):143-147。

[8] 刘若囡,徐立,时乐,等.常用皂苷类中药致肝损伤的毒理学研究进展[J].中南药学,2010,8 (12):916-919.

[9] 何绍清,罗振宇,刘秋英,等. 人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(14):2492-2496.

[10] 毛德义,邱华,刘洁.中草药对肝损伤中肝细胞线粒体的保护机制[J].中国药房,2005,16(22) :1745-1747.

[11] Campard D, Lysy PA, Najimi M, et al. Native umbilical cord matrix stem cells express hepatic markers and differentiate into hepatocyte-like cells. Gastroenterology. 2008;134(3): 833-848.

[12] 王加志,刘树民,汤青,等. 黄药子毒性组分对肝细胞内Ca2+浓度的影响[J].中医药信息,2012,29(6):15-16.

[13] 任红英,赵钦军,刘拥军,等. 脐带间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的研究[J].山东医药,2008,48(30):24-26.

[14] 唐宋琪,杨雪,丁若兰,等. 雷公藤多苷致大鼠肝损伤的“时-毒”关系及免疫毒性机制研究[J].中药药理与临床,2012,28(5): 78-82.

[15] Schmidt D, Mol A, Odermatt B, et al. Engineering of biologically active living heart valve leaflets using human umbilical cord-derived progenitor cells. Tissue Eng. 2006; 12(11):3223-3232.

[16] Pari L, Prasath A. Efficacy of caffeic acid in preventing nickel induced oxidative damage in liver of rats. Chem Biol Interact. 2008;173(2):77-83.

[17] Chao KC, Chao KF, Fu YS, et al. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton's Jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS One. 2008;3(1):e1451.

[18] 禄保平,苗明三,杨晓娜,等. 应用雷公藤多苷灌胃建立小鼠急性肝损伤模型的研究[J].中药药理与临床,2007,23(2):75.

[19] 吕丽莉,黄伟,于晓,等.不同柴胡组分对大鼠肝毒性与氧化损伤机制影响的研究[J].中国中药杂志,2009,34(18):2364-2368.

[20] 薛翔,戚新明,任进,等.肝脏细胞色素P450酶对雷公藤甲素所致毒性的影响[C].贵阳:中国毒理学会第五次全国学术大会论义集, 2009:108.

[21] 姚金成,刘颖,胡领,等. 雷公藤甲素对人肝细胞L-02肝药酶活性的影响[J].中国医院药学杂志,2012, 32(20): 1597 -1600

[22] 丁虹,吴建元,童静,等.雷公藤公藤甲素急性毒性及其机制研究[J].中药材,2004,27(2):117.

[23] 闫俊卿,韩涛,朱争艳.人脐带间充质干细胞生物学特性及向类肝细胞的分化[J].世界华人消化杂志.2008,16(15):1639-1644.

[24] 周璐,姚广涛,曹智丽,等.吴茱萸水煎液致小鼠肝毒性机制研究[J].中国实验方剂学杂志,2013, 19(22) :269-272.

[25] Seshareddy K, Troyer D, Weiss ML. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 2008;86:101-119.

[26] 徐英,陈崇崇,杨莉,等. 基于胆汁酸代谢网络分析中药黄药子的肝毒性[J].药学学报,2011,46(1):39-44.

[27] Kuo TK, Hung SP, Chuang CH, et al. Stem cell therapy for liver disease: parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells. Gastroenterology. 2008;134(7):2111-2121.

[28] Takami T, Terai S, Sakaida I. Novel findings for the development of drug therapy for various liver diseases: Current state and future prospects for our liver regeneration therapy using autologous bone marrow cells for decompensated liver cirrhosis patients. J Pharmacol Sci. 2011;115(3):274-278.

[29] 刘迎娣,杨云生,王韫芳,等.经脾脏hMSCs移植对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝损伤的治疗作用[J].世界华人消化杂志,2008, 16(18):1969-1973.

[30] Terai S, Sakaida I, Nishina H, et al. Lesson from the GFP/CCl4 model--translational research project: the development of cell therapy using autologous bone marrow cells in patients with liver cirrhosis.J Hepatobiliary Pancreat Surg. 2005; 12(3):203-207.

[31] Iwamoto T, Terai S, Hisanaga T, et al. Bone-marrow-derived cells cultured in serum-free medium reduce liver fibrosis and improve liver function in carbon-tetrachloride-treated cirrhotic mice.Cell Tissue Res. 2013 351(3):487-495.

引言

人脐带间充质干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能。研究表明间充质干细胞具有肿瘤组织趋向性，其可能原因是肿瘤细胞能够分泌多种趋化因子和生长因子，它们能够促使人脐带间充质干细胞向肿瘤组织移动^[1-2]，因此，Rachakatla等^[3-4]认为人脐带间充质干细胞可作为抗肿瘤药物靶向治疗的载体。马桂霞等^[5-6]实验证实用尼克酞胺联合疏基乙醇可诱导人脐带间充质干细胞分化成为胰岛素分泌细胞，从而为脐带间充质干细胞治疗糖尿病提供了一定的研究方向。孙国栋等^[7-10]也证明人脐带间充质干细胞经过体外诱导具有多向分化潜能。

Li Hai-tao, Attending physician, Department of Surgery, Zunhua People's Hospital, Zunhua 064200, Hebei Province, China

近年来，越来越多的科学家集中于人脐带间充质干细胞在肝脏疾病中的应用，Campard等^[11-12]在体外诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化，诱导后细胞具有肝细胞特征。任红英等^[13-14]采用酶学法从脐带全层组织中分离人脐带间充质干细胞，采用改良的肝分化培养体系体外诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化，分化后的细胞表达肝细胞标志性蛋白，且仍具有低免疫原性。以上实验均证实人脐带间充质干细胞具有向肝细胞分化的潜能并具有肝细胞的生物学特性。近年来研究证明牛磺酸有广泛的生物学效应，能够增强人免疫能力和抗炎症作用，是维持生命和调节机体正常生理功能的重要物质。为此，实验探讨牛磺酸联合脐带间充质干细胞移植对肝损伤修复作用，为肝病的临床治疗提供了新的研究方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2015年12月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 脐带标本 经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，采集后4 ℃保存，6 h内处理。

1.3.2 实验动物 健康SD大鼠48只，体质量90-140 g，雌雄各半，由遵化市人民医院提供，室温25 ℃，湿度50%-80%，SPF环境下自由饮水和采食。

1.3.3 主要试剂、仪器 Ⅱ型胶原酶、D-Hank’s液、DMEM/F12、0.25%胰蛋白酶、MesenPRO RS^TM Medium (华大基因)；牛磺酸(广州市乐试生物科技有限公司)；TransScript 第1链cDNA合成试剂盒、Taq PCR Mix (康为世纪生物科技公司)；CYP2B1引物设计及合成(北京擎科生物有限公司)；超氧化物歧化酶试剂盒(上海基免实业有限公司)；谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒、过氧化氢酶试剂盒(上海博升生物科技有限公司)；丙二醛试剂盒(BioVision)；内毒素、白细胞介素4试剂盒(上海嵘崴达实业有限公司)。恒温振荡仪(其林贝尔仪器设备有限公司)；100目筛网(武汉科瑞生物有限公司)；离心机(ABI公司)；37 ℃恒温箱(上海精宏实验仪器设备有限公司)；荧光显微镜(Olympus公司)；RT-PCR仪(ABI公司)；6孔板(Corning公司)；酶标仪(雷拓生物仪器设备有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脐带间充质干细胞的培养 从手术室取下脐带后，直接放入含有抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在超净台内取出脐带，用PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用手术刀剔除脐带内血管，将脐带均匀剪成1 mm³大小的组织块放入培养瓶中，加入Ⅱ型胶原酶消化，100目筛网过滤收集细胞，接种在6孔板内，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱内，显微镜下观察细胞融合度为80%时，按照标准的体外扩增流程以1︰2或1︰3比例传代。

1.4.2 慢性酒精性肝损伤动物模型的建立及其干预 48只SD大鼠正常适应性饲养3 d，随机分成3组：模型组、脐带间充质干细胞组、牛磺酸+脐带间充质干细胞组，每组16只。按10 mL/kg给予56度白酒灌胃，早晚各1次，连续30 d。造模成功后模型组门静脉注射生理盐水1 mL，脐带间充质干细胞组门静脉移植1 mL脐带间充质干细胞悬液(细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹)，牛磺酸+脐带间充质干细胞组门静脉注射牛磺酸0.28 g/L和1 mL脐带间充质干细胞悬液。

1.4.3 血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、谷丙转氨酶、丙二醛、内毒素、白细胞介素4水平 移植后2周，用剪刀或刀片剪去尾尖1.0-2.0 mm，采血0.30-0.54 mL，取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。按照试剂盒说明书方法测定，样品孔和空白孔2中加入20 μL样品溶液，在空白孔1，3中分别加入20 μL双蒸水，每孔加入200 μL的工作液，混匀；空白孔2，3分别加入20 μL Dilution buffer；样品孔和空白孔1中分别加入20 μL酶工作液，充分混合，培养箱中培养20 min，用酶标仪在450 nm处读取数值。

1.4.4 RT-PCR检测肝组织中CYP2B1 mRNA表达 移植后2周，按RNA提取试剂盒说明书提取肝脏总RNA，采用紫外分光光度计测定A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.8-2.0。整个反转录的过程应在冰上完成，将提取好的1 μg RNA溶解于在事先准备好的无RNA酶的DEPC水中，加入5倍的Buffer 2 μL，RT enayne mix 0.5 μL，随机引物0.5 μL，加水至12 μL混匀。PCR仪预热30 min，用手均匀振荡PCR管，调节反应程序为25 ℃10 min→42 ℃ 30 min→85 ℃ 5 min，冰上收集反转录反应产物用于cDNA扩增。整个体外扩增的过程应在冰上完成，在EP管中各加入上下游引物0.5 μL，cDNA 0.5 μL，mix 6 μL，加水至12 μL混匀，计算CYP2B1基因与GAPDH基因扩增条带表达量的比值作为CYP2B1 mRNA的相对水平。

引物序列：CYP2B1：上游引物为 5’- GAG TTC TTC TCT GGG TTC CTG- 3’，下游引物为 5’-ACT GTG GGT CAT GGA GAG CTG-3’，引物长度为415 bp；GAPDH：上游引物为 5’- GAG TCA TCG GAT TCG TCG T-3’，下游引物为5’-GAG AAT GTA CGA GCT CTC AG-3’，引物长度为185 bp。

1.5 主要观察指标 ①血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、谷丙转氨酶、丙二醛、内毒素、白细胞介素4水平；②肝组织CYP2B1 mRNA表达。

1.6 统计学分析 将所有实验数据输入Excel 2010表格中，去除异值，用生物统计学软件SPSS 16.0进行统计分析；组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

大量的临床试验证实，酒精中的乙醇能使肝细胞发生变性和坏死，一次大量饮酒，会杀伤大量的肝细胞，引起转氨酶急剧升高；如果长期饮酒，还容易导致酒精性脂肪肝、酒精性肝炎，甚至酒精性肝硬化。有科学家认为酒精性肝病与体内的白细胞介素增高存在着一定的联系^[15-16]，与酒精性肝病发病密切相关的白细胞介素主要有白细胞介素1α、白细胞介素6和白细胞介素8。炎症递质和(或)细胞因子对酒精性肝病的形成具有重要的作用。酒精的摄入可致炎症细胞对炎症刺激过度的反应产生大量的炎症递质和(或)细胞因子，即所谓的激发和致敏^[17-18]。一方面，肝细胞损伤后，可发生肝实质细胞的凋亡和坏死。另一方面，酒精性肝病时，因肠细菌过度生长、肠黏膜通透性增加、肠细菌移位以及正常的免疫功能受抑制等，导致肠源性内毒素血症^[19-20]。

近年来研究证明牛磺酸有广泛的生物学效应^[21-22]，能够增强人免疫能力和抗炎症作用，是维持生命和调节机体正常生理功能的重要物质。闫俊卿等^[23-24]利用肝细胞生长因子、成纤维生长因子4和抑瘤素等细胞因子诱导脐带间充质干细胞向肝细胞分化，分化的细胞表达肝细胞表面标志物ALB、AFP、CK18和CK19，糖原染色呈现阳性^[25-31]。以上研究表明，脐带间充质干细胞为肝病的临床治疗提供了新的研究方向。

实验结果表明，与模型组相比较，脐带间充质干细胞组、牛磺酸+脐带间充质干细胞组血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、谷丙转氨酶水平均显著增高(P < 0.05)，丙二醛、内毒素、白细胞介素4水平均显著下降(P < 0.05)。与脐带间充质干细胞组比较，牛磺酸+脐带间充质干细胞组超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、谷丙转氨酶水平进一步增高(P < 0.05)，丙二醛、内毒素、白细胞介素4水平进一步下降(P < 0.05)。通过RT-PCR技术检测特征性功能蛋白CYP2B1mRNA表达量，结果显示与模型组、脐带间充质干细胞组比较，肝细胞特征性功能蛋白CYP2B1的mRNA表达在牛磺酸+脐带间充质干细胞组显著增高，差异有显著性意义(P < 0.05)。以上实验结果表明脐带间充质干细胞移植可以修复大鼠肝损伤，与牛磺酸联合使用后效果更佳，其可能与减少自由基对机体的损害有关。