脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.015

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
联合治疗的理论基础：自身骨髓干细胞的分化、增殖能力显著降低，其黏附和参与血管形成的能力也均显著降低，机体不能为移植后的细胞提供理想的增殖分化环境等造成移植后分化形成血管的能力较弱，因此改善血供的作用也较差。脐带间充质干细胞分化能力强，移植后能够快速分化、增殖形成血管内皮细胞，进而形成血管，恢复下肢血供，改善临床症状。
踝肱指数：是血管外科最常用、最简单的一种检查方法，通过测量踝部胫后动脉或胫前动脉以及肱动脉的收缩压，得到踝部动脉压与肱动脉压之间的比值。

摘要
背景：骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病近年来在临床取得较大进步，但在实践过程中也发现由于老年患者骨髓干细胞数量较少，采集困难，分化能力降低，对临床疗效产生影响。
目的：探讨脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血的效果。
方法：选择2012年3月至2015年11月在石家庄市第一医院进行干细胞移植治疗的下肢缺血性病变患者47例，根据治疗方法不同分为观察组23例和对照组24例，对照组采用骨髓干细胞移植治疗，观察组采用脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞移植治疗。
结果与结论：①观察组总有效率显著高于对照组(P=0.039)；②观察组患者皮温、经皮氧分压和踝肱指数均显著高于对照组(P < 0.05)；③观察组患者肢体疼痛、患肢冷感和间歇性跛行评分均显著低于对照组(P < 0.05)；④由此可见脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血较单独采用骨髓干细胞能够更加有效提高患肢皮温、经皮氧分压和踝肱指数，改善患者疼痛及冷感等临床症状，疗效更佳。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8784-8132(杜俊文)

关键词: 干细胞, 移植, 脐带间充质干细胞, 骨髓干细胞, 联合治疗, 下肢缺血, 效果

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow stem cell transplantation has made great progress in the treatment of ischemic disease of the lower limbs. But for the senile patients, the therapeutic outcomes are greatly influenced by few bone marrow stem cells, difficulty in cell collection, and low differentiation ability.
OBJECTIVE: To study the clinical efficacy of umbilical cord mesenchymal stem cells combined with bone marrow stem cells in the treatment of lower limb ischemia.
METHODS: Forty-seven patients with lower limb ischemia treated with stem cell transplantation in the First Hospital of Shijiazhuang from March 2012 to November 2015 were assigned into either observation group (n=23; transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells combined with bone marrow stem cells) or control group (n=24; bone marrow stem cell transplantation).
RESULTS AND CONCLUSION: The total effective rate in the observation group was significantly higher than that of the control group (P=0.039). The skin temperature, percutaneous oxygen branch pressure and ankle brachial index in the observation group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). Scores on limb pain, limb coldness and intermittent claudication in the observation group were significantly lower than those in the control group (P< 0.05). It can be seen that the transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells combined with bone marrow stem cells have better clinical effects on lower limb ischemia stem than single use of bone marrow stem cells, as the combined transplantation can be more effective to relieve clinical symptoms, such as pain and sense of coldness, by improving limb skin temperature, transcutaneous oxygen partial pressure and ankle brachial index.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Lower Extremity, Ischemia, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Umbilical Cord, Bone Marrow, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

杜俊文，吴韬，张坤，苏白玉，卢彩萍，王伟超，雷琳，郭静霞. 脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 82-86.

Du Jun-wen, Wu Tao, Zhang Kun, Su Bai-yu, Lu Cai-ping, Wang Wei-chao, Lei Lin, Guo Jing-xia. Umbilical cord mesenchymal stem cells combined with bone marrow stem cells for treatment of lower limb ischemia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 82-86.

图/表（结果） 4

2.1 参与者数量分析 入组47例患者均进入最后的结果分析，无脱落病例。

2.2 两组基线资料比较 两组患者在性别比例、年龄、病因及合并疾病等基础资料方面的差异均无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性，见表2。

2.3 试验流程图 见图3。

2.4 两组患者临床疗效比较 秩和检验结果表明观察组临床疗效优于对照组(u=2.140，P=0.032)；卡方检验结果表明观察组总有效率显著高于对照组(χ²=4.261，P=0.039)，见表3。

2.5 两组患者治疗前后皮温、经皮氧分压和踝肱指数比较 组内比较，治疗后两组患者皮温、经皮氧分压和踝肱指数均较治疗前显著升高(P < 0.05)。组间比较，治疗前两组患者皮温、经皮氧分压和踝肱指数差异无显著性意义(P > 0.05)；治疗后观察组患者皮温、经皮氧分压和踝肱指数均显著高于对照组(P < 0.05)，见表4。

2.6 两组患者治疗前后肢体疼痛、患肢冷感和间歇性跛行评分比较 组内比较，治疗后两组患者肢体疼痛、患肢冷感和间歇性跛行评分均较治疗前显著降低(P < 0.05)。组间比较，治疗前两组患者肢体疼痛、患肢冷感和间歇性跛行评分差异均无显著性意义(P > 0.05)；治疗后观察组患者肢体疼痛，患肢冷感和间歇性跛行评分均显著低于对照组(P < 0.05)，见表5。

2.7 两组患者治疗后不良事件发生情况比较 移植后1周内部分患者自觉移植下肢有发热感，持续2周左右，随访的3个月内两组均未出现死亡病例，无心脑血管急性并发症，肝肾功能，出、凝血时间无特殊改变，未见其他不良反应出现。

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引言

材料方法

1.1 设计 回顾性病例分析。

1.2 时间及地点 于2012年3月至2015年11月在石家庄市第一医院完成。

1.3 对象 选择2012年3月至2015年11月在石家庄市第一医院进行干细胞移植治疗的下肢缺血性病变患者47例，根据干细胞移植治疗方式的不同分为观察组和对照组，对照组采用骨髓干细胞移植治疗，观察组采用脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞移植治疗。观察组23例，其中男18例，女5例；年龄59-81岁，平均(68.7±4.1)岁；下肢动脉硬化闭塞症20例，糖尿病足3例；合并高血压14例，冠心病8例，糖尿病11例，血脂异常14例。对照组患者24例，其中男18例，女6例；年龄60-81岁，平均(69.3±3.9)岁；下肢动脉硬化闭塞症19例，糖尿病足5例；合并高血压12例，冠心病7例，糖尿病13例，血脂异常15例。两组患者在性别比例、年龄、病因及合并疾病等基础资料方面的差异均无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性。

诊断标准：下肢缺血性疾病诊断参考杨牟主编的《下肢缺血疾病诊断与治疗》^[15]。

纳入标准：①入选病例临床表现与体征符合诊断标准；②入选患者符合干细胞移植适应证，且均能耐受干细胞移植；③入组患者及家属均签署知情同意书并经医院伦理委员会批准。

排除标准：①伴有严重心、肝、肾、肺功能不全患者；②5年内有明确的恶性疾病及肿瘤病史者。

1.4 方法

1.4.1 脐带间充质干细胞移植方法 首先制备人脐带间充质干细胞悬液，收集足月顺产或剖腹产健康产妇脐带经前处理后将细胞接种在含有UltraCULTURE培养液的75 cm²塑料培养瓶中，37 ℃，体积分数为5%CO₂，饱和湿度条件下培养三四天，更换培养基，去除不贴壁的细胞，待细胞生长至80%-90%融合时进行传代培养。取第3代脐带间充质干细胞在显微镜下观察，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达CD105，CD90，CD73，CD44，不表达CD34，CD45，证实为脐带间充质干细胞，见图1。最后将所获取的脐带间充质干细胞制备成1×10⁷ L^-¹细胞悬液待用。观察组患者在硬膜外麻醉下根据缺血范围选取肢体大腿中下段及小腿部前、后、外肌群肌肉注射，每次每个穿刺点注入约0.5 mL细胞悬液，间隔1 cm，多点穿刺注射。

1.4.2 骨髓干细胞移植方法 在移植前进行骨髓象评估，术前抽取1 mL进行骨髓涂片排除血液病，之后患者俯卧，接心电血压监护仪，常规消毒，铺创巾后以1%利多卡因进行局部麻醉，采用多侧孔骨髓穿刺针，多点方向以便抽取更多骨髓细胞。骨穿针刺入髂骨骨髓腔后抽取骨髓约300 mL贴壁注入无菌骨髓保养袋中混匀，在体外以人间充质干细胞分离液(天津市灏洋生物制品公司)处理，离心后提取单个核细胞层，根据所需体积稀释成单个核细胞悬液(细胞浓度1×10⁸ L^-¹)。在DMEM培养基中贴壁生长(图2)，流式细胞仪分析骨髓干细胞表型特征，即CD29、CD44阳性，CD34、CD45阴性。两组患者在硬膜外麻醉下根据缺血范围选取肢体大腿中下段及小腿部前、后、外肌群肌肉注射，每次每个穿刺点注入约0.5 mL细胞悬液，间隔1 cm，多点穿刺注射。

1.5 主要观察指标

1.5.1 临床症状评分 分别在治疗前，治疗后7 d，2周，3个月和6个月对两组患者进行临床症状评分，评分标准见表1。

1.5.2 临床疗效评定 治疗后3个月进行疗效评价。显效：自觉症状消失或不明显，存在足部病变者创面愈合在80%以上；有效：患者自觉症状显著减轻，存在足部病变者创面愈合40%以上；无效：症状改善不明显，存在足部病变者创面愈合不足40%，或病情继续加重，创面扩大。

1.5.3 踝肱指数、皮温、经皮氧分压 治疗后3个月采用ES-i000 SPM多普勒血流控测仪检测踝肱指数，采用PICCOLO多功能红外线体温仪检测下肢皮温；采用PF5000经皮氧分压监测仪(瑞典PERIMMED公司)检测经皮氧分压。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行数据处理，计量资料采用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，同一指标不同时间点多次测量采用F 检验，有序资料比较采用秩和检验，计数资料采用卡方检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着近些年来经济的快速发展，人民生活水平显著提高，日常饮食中高脂肪、高蛋白类食物所占比例增加，造成心血管疾病、代谢类疾病风险增加，尤其是糖尿病发生率快速增长，由此并发的周围血管病变的发生率也逐年增加，患者因血管狭窄、闭塞而导致下肢缺血，病情严重者甚至需要截肢治疗。临床对下肢缺血性疾病的治疗主要有两类方法，一类是内科通过药物治疗，另一类是外科通过手术进行血流重建。内科治疗疗效不理想，外科手术治疗风险较大，且由于下肢缺血患者以老年人群居多，身体机能减退，手术风险极大。骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病近年来在临床取得较大进步，成效显著，但在实践过程中也发现由于老年患者骨髓干细胞数量较少，采集困难，且其分化能力降低，对临床疗效产生影响。为此，试验旨在探讨脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血的临床疗效，为提高临床对下肢缺血的治疗成效提供依据。

骨髓中含有血管内皮祖细胞和间充质干细胞，在一定条件作用下间充质干细胞能够定向分化形成血管内皮细胞和平滑肌细胞，这是骨髓干细胞能够治疗下肢缺血的基础。近年来多项研究已经表明来源于骨髓的干细胞能够在局部血管损伤位置分化形成新生血管，进而改善肢体血供^[16-17]。与骨髓干细胞相比，脐带间充质干细胞具有资源丰富，采集方便等优势。更为重要的是间充质干细胞更加原始，具有更强的分化增殖能力，诱导分化后能够获得足量的干细胞，具有更加优异的干细胞潜能，免疫原性也较弱。关于脐带间充质干细胞移植在临床方面及动物基础研究的应用为其奠定了坚实的基础^[18-23]。试验结果表明观察组总有效率显著高于对照组(χ²=4.261，P=0.039)，这说明脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血的临床疗效显著优于单独采用骨髓干细胞，其原因可能有以下2个方面：一方面是老年患者由于身体各项机能衰退，骨髓干细胞的分化、增殖能力显著降低，其黏附和参与血管形成的能力也显著降低，机体不能为移植后的细胞提供理想的增殖分化环境，造成移植后分化形成血管的能力较弱，因此改善血供的作用也较差^[24-25]。另一方面脐带间充质干细胞分化能力强，移植后能够快速分化、增殖形成血管内皮细胞，进而形成血管，恢复下肢血供，改善临床症状。

此外，试验结果表明观察组患者皮温、经皮氧分压和踝肱指数均显著高于对照组(P < 0.05)，治疗后观察组患者肢体疼痛，患肢冷感和间歇性跛行评分均显著低于对照组(P < 0.05)。上述结果的出现主要得益于机体下肢血供的改善，下肢血流通畅，代谢增强，产热增加，因而皮温、经皮氧分压显著升高。由于下肢缺血症状改善，机体下肢疼痛及冷感均明显缓解。

综上所述，脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血较单独采用骨髓干细胞能够更加有效的提高患肢皮温、经皮氧分压和踝肱指数，改善患者疼痛及冷感等临床症状，疗效更佳。