脂肪间充质干细胞注入退变椎间盘局部的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
干细胞移植治疗椎间盘退变：干细胞移植在作为新方法用于椎间盘退变治疗的研究越来越受到临床及科研人员的关注。干细胞作为原始细胞，具有很强的自我更新及潜在分化能力。国内外研究发现，移植干细胞可增加肌细胞数量。近年来研究发现，间充质干细胞具有可增殖，多向分化的能力且可自我更新，在特定条件下可分化为骨细胞等多种细胞，对受损的骨或软骨组织具有一定的修复功能。

摘要
背景：国内研究证实，脂肪间充质干细胞在一定条件下可分化为软骨细胞、成骨细胞等多种类型骨细胞，修复受损的骨或软骨组织。
目的：观察脂肪间充质干细胞对兔椎间盘退变的作用。
方法：将36只成年新西兰大白兔随机分为3组，正常组不进行任何处理，对照组、实验组采用髓核穿刺抽吸法建立兔椎间盘退变模型，造模14 d后，实验组于椎间盘内注射BrdU标记的同种异体脂肪间充质干细胞悬液50 μL(细胞浓度1×10⁹ L^-1)，对照组于椎间盘内注射等量的生理盐水。注射后2，4，8周，进行椎间盘放射学MRI检查、苏木精-伊红和免疫组织化学染色。
结果与结论：①MRI检查：正常组椎间盘高度恒定，T2加权相上椎间盘信号清晰、均一；对照组注射第4周开始出现椎间隙变窄，T2加权相信号减弱，随着时间推移，椎间盘间隙逐渐狭窄，T2加权相信号也越来越低；实验组注射后第4周椎间隙高度和T2加权相信号逐渐增强；②苏木精-伊红染色：与正常组比较，对照组注射后2周出现椎间盘退变表现，并随时间的延长逐渐加重；实验组注射后不同时间点的椎间盘退变表现较对照组明显减轻；③免疫组织化学染色：移植后的BrdU标记脂肪间充质干细胞可在兔椎间盘内存活并增殖；④结果表明：脂肪间充质干细胞对兔椎间盘退变有修复作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2304-3930(徐宏光)

关键词: 干细胞, 移植, 脂肪间充质干细胞, 分离, 体外培养, 干细胞移植, 动物模型, 兔, 椎间盘退变, 修复, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Domestic studies have shown that adipose-derived mesenchymal stem cells can differentiate into osteoblasts, osteoblasts and other types of bone cells under certain conditions, which are used to repair damaged bone or cartilage tissue.
OBJECTIVE: To observe the effect of adipose-derived mesenchymal stem cells on rabbit intervertebral disk degeneration.
METHODS: Thirty-six adult New Zealand rabbits were randomized into normal (no treatment), control and experimental groups. Rabbit models of intervertebral disk degeneration were made in the latter two groups using nucleus pulposus aspiration method. Fourteen days after modeling, model rabbits were given injection of BrdU-labeled allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cell suspension (50 μL, 1×10⁹/L) in the experimental group or same volume of normal saline in the control group. Thereafter, MRI, hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical staining were performed at 2, 4, 8 weeks after injection.
RESULTS AND CONCLUSION: MRI findings showed: unchanged disc height and clear and uniform T2-weighted intervertebral disk signals in the normal group; narrowed intervertebral space and weakened T2-weighted signals in the control group that occurred at 4 weeks and gradually developed with time; and increased disc height and T2-weighted signals in the experimental group. Intervertebral disk degeneration shown by hematoxylin-eosin staining occurred at 2 weeks after injection and aggravated in the control group, but in the experimental group, the degeneration was alleviated significantly compared with the control group. Additionally, the transplanted BrdU-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells survived and proliferated in the rabbit intervertebral discs. To conclude, adipose-derived mesenchymal stem cells contribute to the recovery from intervertebral disk degeneration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Intervertebral Disk Degeneration, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

沈祥，徐宏光，马明明，张骞，肖良，所起凤. 脂肪间充质干细胞注入退变椎间盘局部的作用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 77-81.

Shen Xiang, Xu Hong-guang, Ma Ming-ming, Zhang Qian, Xiao Liang, Suo Qi-feng. Local effects of adipose-derived mesenchymal stem cells injected into the degenerative intervertebral discs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 77-81.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 36只新西兰大白兔均进入结果分析，无脱失。

2.2 细胞形态学观察及表面标记物检测结果 从兔脂肪组织中分离出的脂肪间充质干细胞形状大多呈现圆形或类圆形，体积较小，孵育时干细胞24 h即可见有细胞贴壁，第3-5天细胞贴壁生长，呈集落样分布逐渐形成多个细胞克隆，细胞形态呈现为短梭形、三角形等，细胞逐渐融合；第5-7天，脂肪间充质干细胞形态均一，呈现为呈长梭形或纤维状；培养至第10天，脂肪间充质干细胞铺满大部分培养瓶底面，细胞形态呈栅栏状或漩涡状排列，融合达90%以上。正常传代后，细胞贴壁生长迅速，以均匀分布的长梭形细胞平铺生长(图1)。流式细胞仪检测结果显示，脂肪间充质干细胞表面表达标记物CD29(约81.3%)，但不表达CD45(仅有11.1%)。

2.3 兔椎间盘放射学检测结果 MRI检查显示，正常组各时间点椎间盘高度没有不变，T2加权相上椎间盘信号清晰、均一。对照组、实验组移植后第4周开始椎间隙变窄，T2加权相信号减弱；随着时间推移，对照组椎间盘间隙逐渐狭窄，同时椎间盘的T2加权相信号也越来越低，与正常组、实验组移植第4，8周MRI检测结果相比差异有显著性意义(P < 0.05)；移植后第4周，实验组椎间隙高度和T2加权相信号逐渐增强，与正常组椎间盘MRI检测结果比较差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组组内不同时间点间MRI检测结果比较差异无显著性意义(P > 0.05)，对照组组内各时间MRI检测结果比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1，图2。结果提示脂肪间充质干细胞对兔椎间盘退变模型有修复作用。

2.4 兔椎间盘组织学观察结果 与正常组比较，对照组移植后2周椎间盘退变，椎间盘髓核有缩小趋势，髓核与纤维环之间距离增大，交界区出现连续性中性形态；而在第4周时，髓核组织不完整，且呈簇状出现空泡样变性；第8周，出现分界不清，外层纤维环进入髓核中央，同时髓核组织内细胞数量明显减少。与对照组相比，实验组椎间盘组织退变进程明显减缓，移植第4，8周时，髓核细胞数量减少、形态变化等均较轻，脂肪间充质干细胞对椎间保护有显著的保护作用，呈现中央髓核细胞比较完整，分界清晰，细胞呈团状生长，见图3。

2.5 移植BrdU标记脂肪间充质干细胞示踪检测结果 移植后2，4，8周，BrdU标记的阳性细胞数量逐渐减少，并且从椎间盘中央区域向组织外周迁移，见图4，说明脂肪间充质干细胞可在兔椎间盘退变组织中正常存在及增殖。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机分组对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年4月至2015年2月在皖南医学院弋矶山医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：健康6月龄成年新西兰大白兔37只，雌雄不拘，体质量 2.5-3.0 kg，采购于南京青龙山动物养殖场，许可证号：SYXK(苏)2016-0015。实验中对兔的处置均符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准^[19]。

主要试剂及设备：DMEM培养基(Invitrogen 美国公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(GIBCO公司)；CD29抗体、CD45抗体(ABCAM，美国公司)；EPICS-XL型流式细胞仪(Beckman Corlter公司)；培养箱(上海姚氏仪器设备厂)；IX71型倒置相差显微镜(Olympus日本公司)；YD-6D智能型生物组织包埋机(中国)；SW-CJ-2D型净化工作台(中国苏州)。

1.4 实验方法

脂肪间充质干细胞的分离、纯化与培养：随机取实验大白兔1只，以3 mL/kg从大白兔耳缘静脉注射10 g/L戊巴比妥进行麻醉，将大白兔俯卧固定于实验操作手术台上，脱毛备皮，消毒，无菌操作条件下取大白兔颈后及肩胛间区脂肪组织。将取下的脂肪组织称质量后置于洁净培养皿中，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，除去脂肪组织中的小血管、筋膜及结缔组织，再用磷酸盐缓冲液冲洗2次。剪刀剪碎，置于离心EP管中，加入3倍量0.08%胰酶溶液，置于37 ℃环境下搅拌消化1 h，反复消化3次。加入等量的DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清)终止消化，吸出含有单个核细胞的溶液，100目滤网过滤，3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，再加入等量的DMEM培养液重悬细胞，3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，磷酸盐缓冲液润洗2遍，加入含体积分数10%胎牛血清的培养液使细胞悬浮，计数后，以5×10⁵/cm²的密度移入2个培养瓶中，于37 ℃、95%湿度及含体积分数5%CO₂的培养箱中静置孵育。视培育情况换培养液，用倒置显微镜密切观察细胞的生长情况及状态，约每2 d根据实验情况进行换液，弃去未贴壁细胞。细胞融合达到约90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养，流式细胞仪检测干细胞表型。取第3代脂肪间充质干细胞，用生理盐水调整干细胞浓度为1×10⁹ L^-¹并以BrdU标记，备用。

兔椎间盘退变模型：取24只大白兔，造模前6 h禁食禁饮，记录体质量。以3 mL/kg从大白兔耳缘静脉注射浓度为10 g/L的戊巴比妥进行麻醉，将动物仰卧位固定于实验操作实验台上，腹部剪毛备皮约10 cm²，先用碘伏消毒3次，再用乙醇棉签脱碘2次。无菌操作条件下，铺布，于大白兔腹部正中切口，切口长约10 cm，将肠管翻出，钝性分离椎体前方软组织，保护动脉血管，暴露脊柱L_3/4、L_4/5、L_5/6椎间盘,以髂前上棘定位节段，用1 mL注射器21 G针头在兔的腰椎第7节平行终板方向刺入，刺入纤维环5 mm，刺入后用10 mL注射针管回抽无血液抽出即确定穿刺成功，抽取髓核组织湿重6 mg，缝合切口，消毒伤口，用绷带固定切口，放回兔笼。术后连续3 d于大白兔大腿内侧注射青霉素以免感染。

实验分组及脂肪间充质干细胞移植：将造模成功的24只大白兔随机分为对照组和实验组，每组12只，另取不作任何处理的12只大白兔作为正常组。造模14 d后，实验组L_4/5椎间盘注入脂肪间充质干细胞悬液50 μL(细胞浓度1×10⁹ L^-¹)，对照组注射等量生理盐水。

1.5 主要观察指标

兔椎间盘放射学检测：脂肪间充质干细胞移植后2，4，8周，对各组兔进行磁共振成像(MRI)检测，应用Thompson分级法作为评估标准：一级信号表现为正常；二级表现为髓核区域信号强度轻度减弱；三级表现为髓核区域信号强度重度减弱。

兔椎间盘组织学检测：脂肪间充质干细胞移植后2，4，8周，放射学检测后，每组每个时间点用空气栓塞法处死4只兔。取兔椎间盘，用钢锯锯开椎间盘，保留椎体骨质(约4 mm)，组织用体积分数10%甲醛固定2 d，再脱钙处理2 d，包埋、组织切片，一部分组织进行BrdU免疫组织化学染色，观察脂肪间充质干细胞；另一部分组织进行苏木精-伊红染色，观察椎间盘组织形态。

1.6 统计学分析 实验数据符合正态分布，采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以平均数与标准差表示。计数资料以实验动物量表示。组间采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

引起椎间盘病变的因素有很多，如年龄、过度劳累、创伤等，主要原因是椎间盘的退变，退变可诱发椎间盘髓核突出以及导致椎管狭窄。由于椎间盘的发病率高、致残率高及高昂的治疗费用，在给患者造成身体劳动能力受限外，同时也给患者家庭和社会带来沉重负担。目前，临床治疗的手段主要是摘除突出的髓核、减轻椎管压力及整合退变脊柱节段等，但这些治疗手段只能短暂缓解疾病，并不能修复受损的椎间盘组织。

干细胞移植在作为新方法用于椎间盘退变治疗的研究，越来越受到临床及科研人员的关注。干细胞作为原始细胞，具有很强的自我更新及潜在的分化能力。国内外研究发现，移植的干细胞可增加肌细胞数量^[20-21]。近年来研究发现，间充质干细胞具有可增殖、多向分化的能力且可自我更新，在特定条件下可分化为骨细胞等多种细胞，对受损的骨或软骨组织具有一定的修复功能^[22-29]。脂肪间充质干细胞也称为胶脂细胞，具有与骨髓间充质干细胞类似的功能，所以目前对脂肪间充质干细胞的研究越来越多，多项研究证实脂肪间充质干细胞具有多向分化、自我更新等特性，在体外有向骨细胞、软骨细胞、成骨细胞等组织分化的能力^[30]。实验体外培养的脂肪间充质干细胞可正常增殖，细胞形态呈栅栏状或漩涡状排列，融合达90%以上，正常传代后，细胞贴壁生长迅速，以均匀分布的长梭形细胞平铺生长；流式细胞仪检测结果显示，脂肪间充质干细胞表面表达标记物CD29，但不表达CD45，表现出间充质干细胞的特征。

模拟建立良好的实验动物模型是研究的关键。本实验是参考文献[31]，采用髓核穿刺抽吸法建立兔椎间盘退变模型，模拟人后路髓核摘除，可以很好地模拟髓核结构和功能的丧失，可作为本研究的首选模型。经放射学MRI及病理学检测，髓核穿刺抽吸法建立兔椎间盘退变模型成功，可以满足实验研究。移植于兔椎间盘BrdU内标记的脂肪间充质干细胞在各时间点均可正常存活增殖，与对照组相比，实验组椎间盘组织退变进程明显减缓，第4周与第8周时，实验组髓核细胞细胞数量减少、形态变化等均较轻，脂肪间充质干细胞对椎间保护有显著的保护作用，呈现中央髓核细胞比较完整，分界清晰，细胞呈团状生长。

实验成功分离兔脂肪间充质干细胞，在体外可迅速传代增殖，满足实验需要，兔椎间盘退变模型建造科学合理。通过病理检测发现，脂肪间充质干细胞注入退变椎间盘后，其中的脂肪间充质干细胞可存活增殖并向髓核细胞进一步分化，证明其中的髓核细胞及脂肪间充质干细胞具有较强生物学活性。实验结果提示脂肪间充质干细胞可明显减缓椎间盘的退变，对兔椎间盘退变模型有修复作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程