脂肪间充质干细胞治疗外伤性脑损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脑源性神经营养因子：是1982年Barde等首先在猪脑中发现的一种具有神经营养作用的蛋白质。脑源性神经营养因子及其受体在神经系统广泛表达。一种小分子二聚体蛋白质脑源性神经营养因子结构、分布及信号转导脑源性神经营养因子分子单体是由119个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽，蛋白等电点为9.99，相对分子质量为3.5×103，主要由β折叠和无规则卷曲二级结构组成，含有3个二硫键，为一种碱性蛋白质。脑源性神经营养因子分布在中枢神经系统、周围神经系统、内分泌系统、骨和软骨组织等广泛区域内，但主要是在中枢神经系统内表达，其中海马和皮质的含量最高。
胶质细胞源性神经营养因子：于1993年由Lin等从大鼠神经胶质细胞系B49的培养液中首先纯化并命名。目前已在多种神经细胞和神经相关细胞的培养中发现胶质细胞源性神经营养因子表达，并有靶源性神经营养因子的作用。

摘要
背景：临床与动物研究证实，间充质干细胞移植能迁移至脑损伤区域，对创伤性脑损伤有一定的治疗效果。
目的：进一步验证脂肪间充质干细胞对大鼠外伤性脑损伤造成的局部损伤的治疗作用。
方法：大鼠随机分为3组：实验组和对照组参照文献以脑冷冻伤法制作SD大鼠脑损伤模型，实验组造模成功2 d后进行脂肪间充质干细胞尾静脉移植；对照组只尾静脉注射等量生理盐；正常组大鼠不作任何处理。采用Morris水迷宫测试评价大鼠神经功能恢复情况；体个分离、培养脂肪间充质干细胞，在倒置显微镜下观察脂肪间充质干细胞的形态，免疫组织化学检测干细胞在大鼠损伤脑组织中的分布及脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子含量。
结果与结论：①Morris水迷宫测试结果显示：与对照组比，实验组SD大鼠平均逃避潜伏期迅速下降(P < 0.05)，而同时实验组大鼠逃避潜伏期越来越接近于正常组大鼠；②免疫组织化学后倒置显微镜观察：移植的经Brdu标记的脂肪间充质干细胞大量聚集在损伤的大脑皮质，呈不均匀分布。而对照组大鼠脑组织内未见BrdU免疫荧光显色；③Western-blot检测结果显示：实验组经脂肪干细胞静脉移植后，SD大鼠海马区域中的脑源性神经营养因子和周围损伤皮质中的胶质细胞源性神经营养因子的含量明显高于对照组(P < 0.05)。而与正常组SD大鼠比较，对照组大鼠脑组织中海马区域中的脑源性神经营养因子含量升高(P < 0.05)，而皮质周围的胶质细胞源性神经营养因子含量却明显下降(P < 0.05) ；④实验结果提示移植的脂肪间充质干细胞向大鼠脑组织的损伤部位分布，并促进了受损脑组织的胶质细胞源性神经营养因子和脑源性神经营养因子分泌，这也可能是对大鼠神经功能恢复的治疗促进作用之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1743-162X(朱俊卿)

关键词: 干细胞, 移植, 脑损伤, 间充质干细胞, 干细胞移植, 大鼠尾静脉, Morris水迷宫, 间充质干细胞, 大鼠尾静脉, Morris水迷宫, 脑源性神经营养因子, 胶质细胞源性神经营养因子

Abstract:

BACKGROUND: Clinical and animal studies have confirmed that transplanted mesenchymal stem cells can migrate to the area of brain injury, and exert a certain therapeutic effect on traumatic brain injury.
OBJECTIVE: To study the therapeutic effect of adipose mesenchymal stem cells on the local damage induced by traumatic brain injury in rats.
METHODS: According to the literatures, the brain injury model of Sprague-Dawley rats was made by brain freezing injury. After successful modeling, the rats were randomly divided into three groups: model rats in experimental group were administrated with transplantation of adipose mesenchymal stem cells via the tail vein at 2 days after modeling; model rats in control group given the same amount of normal saline; and normal rats in normal group given no treatment. Morris water maze test was used to evaluate the recovery of neurological function in rats. The isolated and cultured adipose mesenchymal stem cells were observed under an inverted microscope. The distribution of these cells in the injured brain and the levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) were detected by immunohistochemistry method.
RESULTS AND CONCLUSION: Morris water maze test results showed that compared with the control group, the average escape latency of rats decreased rapidly in the experimental group, and the difference was statistically significant (P < 0.05), while the escape latency of rats in the experimental group was gradually close to that in the control group. Immunohistochemical findings showed that Brdu-labeled adipose mesenchymal stem cells were accumulated and distributed unevenly in the injured cerebral cortex. In the control group, there was no BrdU immunofluorescence staining in the rat brain tissues. Western blot test results showed that: compared with the control group, the BDNF and GDNF levels in the hippocampus of rats were significantly higher in the experimental group (P < 0.05), but compared with the normal group, the BDNF level in the hippocampus of rats was significantly increased, and the GDNF level in the cortex decreased significantly in the control group (P < 0.05). These findings indicate that adipose mesenchymal stem cells can migrate to the damaged area of rats, and promote the secretion of BDNF and GDNF in the injured brain, which may be one of the mechanisms by which adipose mesenchymal stem cell transplantation improves neurological functional recovery of rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Stem Cell Transplantation, Brain-Derived Neurotrophic Factor, Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor

中图分类号:

R394.2

朱俊卿，洪军，崔建忠，王凯杰. 脂肪间充质干细胞治疗外伤性脑损伤[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 71-76.

Zhu Jun-qing, Hong Jun, Cui Jian-zhong, Wang Kai-jie. Adipose mesenchymal stem cells for treatment of traumatic brain injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 71-76.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验中所用到的50只SD大鼠全部进入结果分析，无脱失。

2.2 体外培养的脂肪间充质干细胞检测结果 在体外培养的SD大鼠腹腔肠系脂肪间充质干细胞经流式细胞仪检测，所分离出的细胞培养整合达90%左右时，脂肪间充质干细胞呈扁圆形和纺锤形，符合脂肪间充质干细胞的形态，具有较好的自我更新能力(图1)。

2.3 SD大鼠外伤性脑损伤建模结果 实验采用脑冷冻伤制作大鼠外伤性脑损伤模型。各组SD大鼠脑冷冻伤建模后没有出现死亡现象，对大鼠的活动没有显著影响，可以正常进行Morris水迷宫测试。苏木精-伊红染色检测显示，建模后的大鼠大脑皮质损伤区域出现局限性损伤，各大鼠脑损伤区域基本一致，可见附近细胞核的碎裂、坏死、凋亡，表明本实验所用模型建模成功(图2)。

2.4 各组大鼠Morris水迷宫测试结果 各组大鼠测量的第1，2，3，4，5天的平均潜伏期，采用单个重复测量因素的方差分析，5次重复测量的数据间存在高度的相关性。脂肪干细胞移植后Morris水迷宫测试潜伏期第1，2，3，4，5天后，实验组与对照组比，实验组SD大鼠平均逃避潜伏期迅速下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，而同时实验组大鼠逃避潜伏期越来越接近于正常组大鼠，结果见表1。各组潜伏期指标总体而言不同，可以看出，实验组的潜伏期低于对照组，而略高于正常组的潜伏期，3组SD大鼠的潜伏期随测量时间逐渐缩短。

2.5 干细胞在大鼠脑损伤区域中的分布 BrdU标记的第4代脂肪间充质干细胞经SD大鼠尾静脉移植后，免疫组织化学后置于倒置显微镜观察在大鼠脑细胞内的分布结果显示，移植的经Brdu标记的脂肪间充质干细胞大量聚集在损伤的大脑皮质，呈不均匀分布。而对照组大鼠脑组织内未见BrdU免疫荧光显色。说明脂肪间充质干细胞经大鼠尾静脉移植后能通过大鼠血脑屏障迁移至外伤性损伤的大鼠的受损区域，进一步在大脑组织中分散(图3)。

2.6 大鼠脑组织中脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子含量检测结果 与对照组比，实验组经脂肪干细胞静脉移植后SD大鼠脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子的含量明显高于对照组(P < 0.05)。而与正常组SD大鼠比较，对照组大鼠脑源性神经营养因子含量升高，而皮质周围的胶质细胞源性神经营养因子含量却明显下降(表2)。单向方差分析显示，各组SD大鼠脑组织损伤部位或附近的脑源性神经营养因子与胶质细胞源性神经营养因子的相对表达量有明显的差异性，同时组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

创伤性脑损伤主要是神经元损伤，是神经系统常见不可逆性损伤，往往会给患者带来严重伤害，而且后期生理功能难以恢复，临床上目前对其仍没有有效的治疗方案。近年来研究发现，干细胞具有可增殖及多向分化的能力，且可以自我更新，分化为神经系统中的各类细胞，对受损的神经组织具有一定的修复功能^[1]。干细胞移植给创伤性脑损伤带来了新希望^[2-4]。目前，对于神经系统功能障碍最佳的治疗方案是进行胚胎干细胞移植或神经干细胞移植，进而恢复神经系统的正常生理功能。但由于胚胎干细胞、神经干细胞等受到伦理和来源的限制^[5]，临床上实施应用问题较多，所以临床上应用比较棘手。

脂肪间充质干细胞是近年来医学、生命科学等领域研究的热点之一，其作为一种成体间充质干细胞，具有来源丰富，易于体外培养等优点，具多种潜能分化能力，可分化为神经元样细胞、成骨细胞、内皮细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、成软骨细胞等^[6-9]。国内研究证实，脂肪间充质干细胞在一定的条件下能分化为神经元和神经胶质细胞^[10-12]。和其他间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞具有取材方便痛苦小、细胞收获量大且广泛、易于体外培养等优点^[13-15]，所以实验采用脂肪充质干细胞作为移植种子细胞。

实验通过脑冷冻伤制作SD大鼠脑损伤模型，对SD大鼠进行脂肪间充质干细胞尾静脉移植，研究脂肪间充质干细胞对大鼠外伤性脑损伤造成的局部损伤的治疗作用。

材料方法

1.1 设计 随机分组细胞学动物实验。

1.2 时间及地点 于2014年2至12月在河北医科大学附属唐山工人医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：七八周龄SPF雄性SD大鼠50只，体质量(210±10) g，采购于南方医科大学实验动物中心，合格证书号为SCXK粤2014-0024，购回后于本实验中心在温度(25±2) ℃、湿度(50±5)%条件下适应性喂养1周。其中5只SD大鼠，用于提取腹腔肠系膜脂肪组织，进行脂肪间充质干细胞的分离及培养。实验的整个过程，以及最后对SD大鼠的处置均符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准^[16]。

主要试剂及设备：DMEM(Gibco美国公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclon公司)；荧光素标记抗体(BD美国公司)；磷酸盐缓冲液(上海麦莎生物科技有限公司)；EPICS-XL型流式细胞仪(BeckmanCorlter公司)；IX71型倒置相差显微镜(Olympus 日本公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 外伤性脑损伤模型建立 模型的建立方法参考文献制作^[17-18]。造模前，SD大鼠禁食不禁水24 h。所有SD大鼠称质量后，随机分为正常组，对照组和实验组，每组10只。取对照组和实验组雄性大鼠20只，以3 mL/kg腹腔注射体积分数10%水合氯醛麻醉，将SD大鼠头部固定于手术操作台面上，慢慢剪去大鼠头顶部皮毛，用碘消毒后在手术处铺巾，沿中线切开大鼠头皮，剥开骨膜，在人字缝前、矢状缝左侧、冠状缝后用磨钻钻出一直径5.0 mm骨窗，打孔过程中要保持硬膜完整。用预冷(-80 ℃)处理的铜棒与大鼠硬脑膜接触1 min，清理创面，缝合骨膜头皮。实验组于模型建造成功24 h后经大鼠尾静脉进行脂肪间充质干细胞移植，对照组经尾静脉注射等量的生理盐水，而正常组大鼠不作任何处理。

1.4.2 脂肪间充质干细胞的分离、培养和移植 取SD大鼠5只，腹腔注射体积分数10%水合氯醛麻醉，无菌条件下从大鼠腹部取脂肪组织，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，剪刀剪碎，置于离心EP管中，加入0.08%胰酶溶液5 mL，37 ℃消化20 min，反复消化3次，用DMEM培养液终止消化，吸出含有单个核细胞的胰酶溶液，100目滤网过滤，以3 000 r/min离心10 min，磷酸盐缓冲液润洗2遍，再离心收集间质血管碎片细胞。加入含体积分数10%胎牛血清的培养液使细胞悬浮，计数后以密度1×10⁴/cm²移入培养瓶中，于37 ℃、体积分数95%湿度及含5%CO₂的培养箱中孵育。用倒置显微镜密切注意观察细胞的生长状态，约每2 d根据实验情况进行换液，弃去未贴壁细胞。细胞融合达到约90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。实验移植用细胞为第4代脂肪间充质干细胞，经流式细胞学鉴定其为脂肪间充质干细胞。实验组SD大鼠造模成功2 d后进行脂肪间充质干细胞尾静脉移植。脂肪间充质干细胞移植前，第4代标有Brdu的脂肪间充质干细胞行免疫化学荧光染色，培养3 d后，置于荧光显微镜下观察脂肪间充质干细胞Brdu的标记情况。收集细胞计数，用生理盐水使干细胞重悬，调整干细胞浓度为5×10⁸ L^-¹，实验组每只SD大鼠经尾静脉注射干细胞悬液1 mL，对照组注射等量生理盐水，正常组不作任何处理。

1.4.3 脂肪间充质干细胞的鉴定及Brdu标记 加入5 mL 0.08%的胰酶对脂肪间充质干细胞进行消化，再用磷酸盐缓冲液润湿洗涤4次后细胞计数，分装至离心管中，加入培养基制备成脂肪间充质干细胞悬液，样本的细胞数量在2×10⁹ L^-¹左右，分别加入CD29-APC单抗、CD45-PE单抗、CD106-PE单抗，FITC单抗标记的CD90单克隆抗体，避光于37 ℃培养箱中培养30 min，用磷酸盐缓冲液洗涤5次，加入含体积分数5%胎牛血清的磷酸盐缓冲液，采用流式细胞仪进行检测细胞表面标志的表达率。

1.4.4 SD大鼠神经功能检测 参照文献方法进行Morris水迷宫测试^[19]。实验开展前对大鼠进行一定的引导训练，每天1次，训练2 d，每天上午8：30开始检测，水温维持在(25±1) ℃。按照随机的原则分别从不同的象限将SD大鼠从池壁放入，记录SD大鼠从入水到寻找到平台的轨迹线路、以及花费的时间即是逃避伏期。寻找到平台休息并停留约25 s后，进行下一象限的测试，最后结果取平均用时，即为大鼠潜伏期。如果大鼠在100 s内未找到平台，将大鼠牵引至平台，并停留30 s，则大鼠逃避潜伏期记录为100 s。每天训练1次，均在同一时间、地点进行，连续5 d。

1.4.5 免疫组织化学检测干细胞在大鼠脑损伤中的分布及脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子含量分别于干细胞移植后5，10，15，20，30 d分批从3组大鼠中每组随机取2只，分别用体积分数为10%水合氯醛腹腔注射将SD大鼠麻醉，固定于解剖台面上，解剖使大鼠心脏充分暴露，用12号灌注针快速给大鼠心脏灌注含10 U/mL肝素的生理盐水，观察大鼠肝脏为白色为止，开始换成40 g/L多聚甲醛固定液灌注，大鼠四肢抽动，表明已经进入大鼠大脑区域，得大鼠完全变硬后快速断头取出大鼠脑组织。固定、包埋、切片，进行免疫组织化学染色，观察Brdu标记的脂肪干细胞在大鼠脑组织中的分布情况、病理学变化及脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子含量检测。

1.5 主要观察指标 各组大鼠的Morris水迷宫检测结果，干细胞形态学观察，免疫细胞化学检测结果。

1.6 统计学分析 实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，Morris水迷宫检测采用单因素的方差分析，组间比较釆用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

创伤性脑损伤常常会给患者造成对物认知、肢体行为等能力缺陷，严重影响到患者的身体健康，以及给患者家庭带来沉重思想或经济负担，目前临床上对其缺乏有效、安全的治疗技术。虽然大脑拥有有限的再生功能，但促进和扩大脑组织的再生功能技术尚不成熟。大量的临床和动物基础研究显示，胚胎、神经等干细胞移植能够明显促进患者或动物脑损伤后的行为学、认识等功能的恢复改善，移植的干细胞能够通过血脑屏障分布到脑损伤区域，减少损伤区域的细胞损坏，并能促进行为学的改善^[20-22]。

实验采用脑冷冻伤制作大鼠外伤性脑损伤模型。各组SD大鼠脑冷冻伤建模后没有出现死亡现象，对大鼠的活动没有显著影响，可以正常进行Morris水迷宫测试。苏木精-伊红染色检测显示，建模后的大鼠大脑皮质损伤区域出现局限性损伤，各大鼠脑损伤区域基本一致，可见附近细胞核的碎裂、坏死、凋亡，表明本实验所用模型建模成功。

间充质干细胞是一种有多向分化能力的干细胞，由于其独特的特点，所以有重要的应用价值。其分布存在范围广，包括脐带、骨髓、脂肪等组织中^[23-26]，从人及其他动物中均可得到。其中研究最多的是骨髓间充质干细胞，在一定的条件下能分化为神经细胞等多种细胞^[27-30]。与其他间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞具有取材方便痛苦小、细胞收获量大且广泛、易于体外培养等优点。

脑源性神经营养因子是一种蛋白质，在脑组织内合成，它广泛分布于中枢神经系统内，对神经细胞的生长发育、分化等起着十分重要的作用,同时可以改善神经细胞的病理状态、防止神经细胞受损而死亡、促进受损神经细胞的再分化和再生长发育等，也是成熟神经中枢和周围神经系统的神经细胞生存及发挥正常生理功能所必需的营养物质。研究发现，脑源性神经营养因子可通过自分泌、靶源性等方式与神经细胞TrkB受体结合，发挥生物学等作用，对神经细胞的分化、发育等起到关键支持功能^[31-33]，并在记忆和学习等功能中承担着不可缺少的重要角色^[34-36]。胶质细胞源性神经营养因子于1993年由Lin等首次从大鼠神经胶质细胞系B49的培养液中分离、培养、纯化所得^[37]。目前已在多种神经细胞和神经相关细胞的培养中发现胶质细胞源性神经营养因子表达，并有靶源性神经营养因子的功能,对损伤神经细胞修复机能有调节作用，在交感神经和感觉神经的生存方面具有一定的支持作用，促进神经细胞的分化，对轴突的伸展方向取一定的决定作用^[38-39]。研究表明胶质细胞源性神经营养因子对多种神经元有营养支持功能，对缺血性带来的损害有保护作用^[40-42]。实验研究显示Westem-blot检测结果表明：实验组经脂肪干细胞静脉移植后SD大鼠海马区域中的脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子的含量明显高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。而与正常组比，对照组大鼠脑组织中脑源性神经营养因子含量升高，而皮质周围的胶质细胞源性神经营养因子含量却明显下降。单向方差分析显示，各组脑源性神经营养因子与胶质细胞源性神经营养因子的相对表达量之间有显著差异，组与组之间差异显著，有统计学意义(P < 0.05)。

本实验研究发现，采用单个重复测量因素的方差分析，5次重复测量的数据间存在高度的相关性。脂肪干细胞移植后Morris水迷宫测试结果显示，实验组与对照组比，实验组SD大鼠平均逃避潜伏期迅速下降，差异具有统计学差异(P < 0.05)，而同时实验组大鼠逃避潜伏期越来越接近于对照组大鼠。免疫组织化学后置于倒置显微镜观察在大鼠脑细胞内的分布结果显示，移植的经Brdu标记的脂肪间充质干细胞大量聚集在损伤的大脑皮质，呈不均匀分布。而对照组大鼠脑组织内未见BrdU免疫荧光显色。说明脂肪间充质干细胞经大鼠尾静脉移植后能通过大鼠血脑屏障迁移至外伤性损伤的大鼠的受损区域，进一步在大脑组织中分散。

实验提示移植的脂肪间充质干细胞向大鼠脑组织的损伤部位分布，并促进了受损脑组织的胶质细胞源性神经营养因子和脑源性神经营养因子分泌，这也可能是对大鼠神经功能恢复的治疗促进作用之一。