人羊膜间充质干细胞移植治疗去卵巢骨质疏松

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.017

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
人羊膜间充质干细胞：是多种细胞的前体细胞，具有多向分化潜能，在一定条件下可诱导成软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞，是目前运用组织工程的主要种子细胞之一。人羊膜间充质干细胞在体外扩增后移植到以内，可对多种组织损伤进行修复。人羊膜间充质干细胞移植对去卵巢骨质疏松尚需要进一步的研究。
骨质疏松：主要病因为骨密度降低，骨组织的微观结构受到破坏。绝经期妇女是骨质疏松症的高发人群，主要表现为骨折发生率高、骨骼疼痛及身高变低等。目前，研究者普遍认为绝经期妇女的骨质疏松症与体内雌激素水平的改变有关，但是其机制尚不明确。

摘要
背景：目前利用人羊膜间充质干细胞促进骨细胞分化成熟的相关研究缺乏，采用移植人羊膜间充质干细胞治疗骨质疏松很可能为骨质疏松的治疗打开新的视野。
目的：探讨人羊膜间充质干细胞移植对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢指标和骨组织微结构的影响及机制。
方法：选择雌性未孕的Wistar大鼠36只，随机分组，模型组23只行双侧卵巢切除，假手术组13只不切除卵巢。术后3个月，各组均取3只处死，ELISA法测定血清抗酒石酸酸性磷酸酶和骨碱性磷酸酶水平，苏木精-伊红染色观察股骨结构的病理改变，判断造模情况。造模成功后，将模型组剩余20只大鼠随机分为2组，对照组和治疗组分别通过尾静脉注射氯化钠注射液和人羊膜间充质干细胞，2次/周，连续6周。细胞移植6周后，通过ELISA法测定血清抗酒石酸酸性磷酸酶和骨碱性磷酸酶水平，RT-PCR、Western blot法检测大鼠股骨转录因子Runx2、Osterix基因和蛋白表达，苏木精-伊红染色观察骨组织微结构变化。
结果与结论：①造模3个月后，模型组大鼠血清骨碱性磷酸酶水平明显下降，抗酒石酸酸性磷酸酶水平明显升高；苏木精-伊红染色结果显示，股骨骨小梁稀疏、数目明显减少甚至断裂，而假手术组骨小梁结构较完整，证明造模成功；②人羊膜间充质干细胞移植后6周，与对照组相比，治疗组骨碱性磷酸酶水平明显升高，抗酒石酸酸性磷酸酶水平明显下降(P < 0.05)；治疗组大鼠股骨转录因子Runx2、Osterix表达明显增加(P < 0.05)；③细胞移植后6周，治疗组大鼠股骨新生骨小梁广泛形成，骨小梁结构破坏较对照组明显减轻；④结果表明，人羊膜间充质干细胞移植对去卵巢骨质疏松具有治疗作用，可能是通过促进Runx2、Osterix表达发挥作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9388-923X(雷鸣)

关键词: 干细胞, 移植, 人羊膜间充质干细胞, 去卵巢, 大鼠, 骨质疏松

Abstract:

BACKGROUND: There are rare studies directly exploring the use of human amniotic mesenchymal stem cells to promote differentiation and maturation of osteocytes. Therefore, human amniotic mesenchymal stem cell transplantation is likely to open new horizons for the treatment of osteoporosiss.
OBJECTIVE: To explore the effect of human amniotic mesenchymal stem cell transplantation on bone metabolism index and bone microstructure in ovariectomized osteoporosis rats and the relevant mechanisms.
METHODS: Thirty-six female Wistar rats without pregnancy were randomly divided into sham and model group. Twenty-three rats in the model group were ovariectomized, and thirteen rats in the sham group received no treatment. Three months after ovariectomy, three rats from each group were executed. ELISA was used to detect serum levels of tartrate-resistant acid phosphatase (TRACP) and bone alkaline phosphatase (BALP). Hematoxylin-eosin staining was performed to observe the pathological changes of the bone. After successful modeling, the remaining rats in the model group were randomized into control and treatment groups, respectively given tail vein injection of sodium chloride and human amniotic mesenchymal stem cells, twice a week, for consecutive 6 weeks. Six weeks after cell transplantation, ELISA was used to detect serum levels of TRACP and BALP; RT-PCR and western blot assay were used to detect expressions of Runx2 and Osterix mRNA and protein; and hematoxylin-eosin staining was used to observe bone microstructure changes.
RESULTS AND CONCLUSION: At 3 months after ovariectomy, the rats in the model group exhibited significantly decreased BALP and remarkably increased TRACP as well as sparse number of bone trabeculae some of which were even ruptured shown by hematoxylin-eosin staining. However, the bone trabeculae of rats in the sham group still remained intact. These results indicated the successful modeling in the model group. At 6 weeks after cell transplantation, significantly increased BALP, Runx2, Osterix and significantly decreased TRACP were observed in the treatment group compared with the control group (P < 0.05). Additionally, there a wide-range formation of new bone trabeculae in the treatment group, and damage to the trabecular structure was milder in the treatment group than the control group. In summary, human amniotic mesenchymal stem cell transplantation exerts therapeutic effects on ovariectomized osteoporosis, probably through promotion of Runx2 and Osterix.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Mesenchymal Stem Cells, Osteoporosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

雷鸣，刘春颖，刘晓峰，孙琳，郑文奎. 人羊膜间充质干细胞移植治疗去卵巢骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 92-97.

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图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 选择雌性未孕的Wistar大鼠36只，随机分组，模型组23只，假手术组13只。术后3个月模型组取3只大鼠处死，判断造模情况，组剩余20只大鼠随机分为对照组和治疗组，每组10只。全部进入结果分析，无脱失。

2.2 造模结果判定 造模术后3个月，对随机选取的模型组和假手术组大鼠进行血清骨碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶水平检测及苏木精-伊红染色结果显示，模型组大鼠摘除双侧卵巢造模成功。结果显示模型组大鼠血清骨碱性磷酸酶水平明显低于假手术组大鼠，而抗酒石酸酸性磷酸酶水平较假手术组明显升高，详见表1。苏木精-伊红染色的结果表明，假手术组大鼠的股骨骨小梁与模型组大鼠相比稠密、数目较多，模型组股骨小梁结构不如假手术组大鼠完整，出现骨断裂现象，见图1，因此判定造模成功。

2.3 抗酒石酸酸性磷酸酶和骨碱性磷酸酶水平变化 移植人羊膜间充质干细胞6周后，与对照组相比，治疗组的骨碱性磷酸酶水平明显升高，抗酒石酸酸性磷酸酶水平明显降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)，结果详见表2及图2。

2.4 Runx2、Osterix基因的表达水平 通过RT-PCR检测Runx2、Osterix mRNA的表达水平结果可知，治疗组的Runx2、Osterix mRNA均高于对照组(P < 0.05)，由此可推测人羊膜间充质干细胞可能在治疗骨质疏松上起到一定的作用，见图3。

2.5 Runx2、Osterix蛋白表达水平 通过蛋白印迹法检测Runx2、Osterix蛋白的表达水平结果可知，治疗组的Runx2、Osterix蛋白表达水平均高于对照组(P < 0.05)，由此可推测人羊膜间充质干细胞可能在治疗骨质疏松上起到一定的作用，此结果与Runx2、Osterix的mRNA表达水平一致，见图4。

2.6 股骨结构的病理变化 通过苏木精-伊红染色，对比治疗组和对照组的股骨微观结构。对照组的骨结构破坏与治疗组相比较严重，治疗组的股骨有新生的骨小梁形成，且骨小梁结构完整、数目较多，可见成骨细胞数目多于对照组，提示人羊膜间充质干细胞对骨小梁起到一定的保护作用，见图5。

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引言

骨质平衡同机体的组织、细胞一样，是一种不断的生成和凋亡的动态平衡^[1-2]。骨质疏松是发病率较高的疾病^[3-4]，其主要特点为骨组织的微观结构不完整，骨密度降低^[5]，骨组织中生成和代谢的平衡被打破^[6]，临床上多表现为身体骨骼部位疼痛、长骨易骨折、身高变低等病症，对绝经妇女及中老年健康造成很大的威胁^[7-8]。其机制尚不明确，可能与雌激素调节相关^[9-10]，对实验雌性动物摘除卵巢，很好的模拟了绝经后低雌激素水平妇女引起的骨质疏松病症，是比较成功的模型^[11]。任何机体的生命活动，都要受到蛋白的调控，Runx2蛋白是调控骨组织生命活动的蛋白之一^[12]，Osterix是成骨细胞分化的转录子之一，两者在成骨细胞分化和软骨细胞成熟上起到重要作用，因此检测二者的mRNA和蛋白的表达，在一定程度上反应了骨组织的结构特征^[13]。

人羊膜间充质干细胞来源广泛，对产妇及新生儿几乎没有影响，且其分化、增殖能力具有独特的优势^[14-15]，未出现传代后衰老的现象^[16]，并有特有的胎盘屏障，其中的干细胞已成为越来越多的研究者关注的对象。近年来，学者不断挖掘干细胞的作用，越来越多的学者致力于应用干细胞治疗各种疾病，但是目前利用人羊膜间充质干细胞促进骨细胞分化成熟的相关研究缺乏，采用移植人羊膜间充质干细胞治疗骨质疏松很可能为骨质疏松的治疗打开新的视野。

实验对去卵巢大鼠移植人羊膜间充质干细胞，检测血清抗酒石酸酸性磷酸酶和骨碱性磷酸酶水平，测定调控蛋白Runx2和Osterix的表达并从微观角度观察了大鼠股骨的结构变化，旨在探索人羊膜间充质干细胞对骨质疏松的治疗作用。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2014年3月至2015年10月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

实验动物：雌性未孕的Wistar大鼠36只，鼠龄6-8个月，体质量200-280 g，由河北医科大学动物实验室提供。按随机数字表法挑选13只大鼠为假手术组，其余大鼠为模型组。所有大鼠的饲养条件为23-27 ℃，恒温，湿度为50%-70%，喂养饲料：颗粒型普通大鼠饲料及消毒无菌水，让其自由饮水和进食，实验前1 d禁食不禁水。

主要材料及来源：人羊膜间充质干细胞及细胞冷冻液购自赛默飞公司，RT-PCR试剂盒购于TaKaRa公司，Runx2、Osterix抗体购于Proteintech公司，GAPDH抗体购于Bioworld公司，二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体)购自优维宁生物技术公司紫外分光光度计购于上海奥析原，CO₂培养箱购于上海人和科技有限公司，细胞培养皿、细胞培养瓶购于上海百研生物科技有限公司，DNA engine opticon PCR 仪购于MJ Research，USA。

1.4 方法

1.4.1 大鼠双侧卵巢切除术 对所有大鼠进行乙醚麻醉，其中对23只模型组大鼠行卵巢摘除术。无菌条件下，模型组大鼠取俯卧位，捆绑固定大鼠四肢，将大鼠置于手术台上，于腰椎后侧络合碘消毒，切开皮肤，分离脊柱旁1 cm、肋弓下缘1 cm的肌肉和组织，腹膜切开，见腹腔中乳白色组织，剥离后，切除双侧黄豆大小粉红色卵巢。假手术组大鼠依上述方法去腹腔卵巢大小脂肪。2组大鼠均撒青霉素粉，皮肤缝合，外切口涂抹庆大霉素消毒^[17-18]。

1.4.2 实验分组 造模术后3个月，模型组及假手术组均取3只大鼠处死，ELISA法测定血清抗酒石酸酸性磷酸酶和骨碱性磷酸酶水平，苏木精-伊红染色观察股骨结构的病理改变，判断造模情况。造模成功后，将模型组剩余20只大鼠随机分为2组，对照组通过尾静脉注射氯化钠注射液50 μL，治疗组通过尾静脉注射人羊膜间充质干细胞50 μL，细胞数为6×10⁴，2次/周，连续6周。

1.4.3 ELISA法测定血清抗酒石酸酸性磷酸酶和骨碱性磷酸酶水平 ELSIA固相抗体为待测样品抗体，固相抗体与待测样品发生特异性反应，反应产物与酶标抗体结合形成复合物，加入底物，显色后检测。在移植人羊膜间充质干细胞6周后，随机从对照组和治疗组大鼠选3只，乙醚麻醉后断头取血，1 000 r/min离心20 min，用移液枪吸取上清液，滴入酶标包被板上，10∶1的比例稀释后，加至酶标板孔底部，不间歇摇晃均匀。用封板膜覆盖后，37 ℃，恒温箱，放置30 min。此时，稀释洗涤液30倍。去掉封板膜后自然烘干，每孔加入洗涤液，静止1 min后，甩干，多次重复洗涤。每孔加酶标试剂50 μL，排除空白孔，37 ℃，恒温箱，放置30 min，多次洗涤，每孔分别加入显色剂A和B 50 μL，混匀，37 ℃暗室放置15 min后，加入终止液50 μL。快速在分光光度计下测定450 nm波长下的吸光度(A)值^[19]。

1.4.4 RT-PCR检测Runx2、Osterix基因的表达水平 总RNA从转染6周后的骨细胞中提取，对治疗组和对照组已处死的3只大鼠，剥离股骨肌肉组织，取少量股骨粉碎后，加入含1 g/L亚铁离子的PBS多次反复冲洗，用匀浆器打匀，并过100 mm滤膜，备用。按Gbeo公司Trizol Total Isolation Reagent说明书进行提取总RNA并以总RNA的mRNA为模板，参照说明书的反转录酶法反转录合成cDNA，在扩增仪上进行RT-PCR。吸取2 μL的悬浮细胞液，正反向引物各加入1 μL悬浮细胞液。Runx2的上游引物为：5’-AAC CCA CGA ATG CAC TAT CCA-3’，下游引物为：5’-CGG ACA TAC CGA GGG ACC TG-3’，扩增目的基因片段长度为76 bp。Osterix的上游序列为：5’-CTC TGC GGG ACT CAA CAA CTC TG-3-3’，下游序列为：5’-CTC TGC GGG ACT CAA CAA CTC TG-3’，扩增目的基因片段长度为316 bp。内参物GAPDH的上游序列为：5’-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3’，下有序列为：5’-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3’，扩增目的基因片段长度为306 bp^[20]。Runx2反应循环条件如下：95 ℃变性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30循环，最终72 ℃延伸1 min^[21]。Osterix反应循环条件如下：95 ℃变性10 min，95 ℃退火45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35循环，最终70 ℃延伸1 min。GAPDH反应循环条件为：94 ℃变性5 min，94 ℃ 20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃ 40 s，25循环，最终72 ℃延伸10 min。将PCR产物10 μL于1.2%琼脂糖凝胶电泳30 min，采用凝胶自动成像及分析系统，电泳结果用凝胶图像分析系统分析电泳条带A值，计算Cx43 A值与GAPDH的A值比值^[22]。

1.4.5 Western blot检测Runx2、Osterix蛋白表达水平 术后6周，分别取治疗组和对照组已处死的各3只大鼠骨组织，用PBS洗涤3次，加入100 μL含有蛋白抑制剂PMSF的RIPA细胞裂解液(预先冰浴10 min)，测定蛋白含量^[23]。4%聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳，15 mA电泳1 h后，取下凝胶，蛋白条带电转膜至聚偏氟乙稀膜，将转移完成的聚偏氟乙稀膜放入培养皿，加入5%脱脂奶粉(pH 7.6的TBS配置)，浸过聚偏氟乙稀膜即可，封闭1 h。与多克隆兔抗体Cx 43(1∶250) 反应，阴性对照组与GAPDH(1∶1 000)抗体反应。一抗稀释后放入培养皿中，加入加入聚偏氟乙稀膜，4 ℃恒温过夜，过夜振荡孵育后，取出聚偏氟乙烯膜，用TBST液冲洗多次，每次浸润5 min。与二抗反应，常温下振荡孵育2 h，取出聚偏氟乙烯膜，用TBS液冲洗多次，每次浸润5 min。按照ECL说明书的操作步骤，对聚偏氟乙稀膜进行荧光染色，液体A和液体B等量混合后，将其加入聚偏氟乙稀膜正面，反应1 min，置于暗室10 min，曝光、显影、定影，通过Alpha2200图像分析仪对各组条带扫描拍照，进行半定量分析^[24-25]。

1.4.6 苏木精-伊红染色观察股骨结构的病理改变 术后2周，治疗组和对照组分别取3只大鼠，麻醉处死后取骨组织，冷冻切片机横向切片，明胶包被盖玻片，将厚度为8 μm的切片贴于盖玻片上，-20 ℃保存^[26]。盖玻片完全浸没于无水乙醇，静止0.5 h，放入PBS，漂洗3次，浸入苏木精染液，15 min后，多次浸入蒸馏水，标本为深蓝色。浸入体积分数1%HCl，静止片刻，分色后，脱去多余蓝色浮色，标本此时转为淡紫红色，而细胞质为无色或灰蓝色。蒸馏水多次浸洗，15 min后，浸入淡氨水(2滴氨水加入到400 mL蒸馏水中)，10 min后，出现淡蓝色。蒸馏水再次浸洗15 min，浸没伊红染液，染色15 min，蒸馏水浸洗1次，体积分数95%乙醇脱水2次，无水乙醇脱水3次，2次滴入二甲苯，均浸入1 min，最终用中性树胶封盖^[27]。荧光显微镜400倍镜下观察细胞分布情况，储存数字图像，Image-Pro Plus 6.0组织切片图像分析软件。

1.5 主要观察指标 通过ELISA方测定血清抗酒石酸酸性磷酸酶和骨碱性磷酸酶水平，RT-PCR、Western blot法行大鼠股骨转录因子Runx2、Osterix基因和蛋白检测，苏木精-伊红染色观察骨组织微结构变化。

1.6 统计学分析 所有计量数据以x(_)±s表示，成组设计的均数比较采用t 检验方法，多组间的数据比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义，应用SPSS 11.0软件进行数据分析。

讨论

绝经后，雌激素水平下降引起的骨质疏松属于Ⅰ型原发性骨质疏松症^[28]，受雌激素水平的影响，骨吸收的增量大于骨形成的增量，引起的微观骨结构发生改变，骨小梁变细、数目降低、出现断裂现象^[29]，甚至骨表面出现孔隙、骨表层变薄，脆性增加^[30]，严重可导致全身骨病^[31]。目前，研究者公认雌激素可以调节分布于骨细胞的雌激素受体，改善成骨细胞能力，提高骨形成^[32-33]。

本实验对未孕雌鼠摘除双侧卵巢，成功的模拟了雌激素水平低下的机体情况^[34]。人羊膜间充质干细胞是一种极具分化潜能的干细胞^[35-36]，在细胞分化增生上起到非常重要的作用^[37-38]。本实验在成功模拟机体雌激素水平低下的情况下，对部分大鼠转染了人羊膜间充质干细胞，通过测定血清抗酒石酸酸性磷酸酶和骨碱性磷酸酶活性、Runx2和Osterix蛋白表达、微观骨机构方面，研究了人羊膜间充质干细胞对Ⅰ型原发性骨质疏松症的作用。破骨细胞分泌的糖蛋白抗酒石酸酸性磷酸酶，具有降解钙磷矿物质的作用，灵敏的反应了骨吸收能力^[39]。在本实验中，治疗组的抗酒石酸酸性磷酸酶活性要远远低于对照组，可见治疗组的骨吸收能力要低于对照组。成骨细胞释放的胞外酶骨碱性磷酸酶，是水解磷酸酯的催化剂，磷酸酯的产物为磷酸是合成羟基磷灰石的合成物之一，同时骨碱性磷酸酶可以有效的阻止骨盐形成，提高了成骨的生成能力，在本实验中治疗组的骨碱性磷酸酶活性高于对照组。从血清抗酒石酸酸性磷酸酶和骨碱性磷酸酶活性的结果可以看出，治疗组可以减少骨吸收增大骨形成，有益于维持骨组织的动态平衡。作为靶基因启动子的Runx2基因是可特异性的识别基因序列，对基因转录起到调节作用，目前已研究出Runx2基因可以调控成骨细胞的分化，还可以促进骨钙素的表达，Osterix是较晚发现的调控成骨细胞的转录因子，Osterix基因缺乏会生成没有骨膜的异性成骨，同时影响成骨细胞的分化。在本实验中同时检测了Runx2和Osterix的mRNA和蛋白表达水平，两者结果相互印证，治疗组的mRNA和蛋白水平都高于对照组，可见从基因水平上证实了人羊膜间充质干细胞对成骨细胞的促进作用。同时，在微观结构上，也可发现治疗组的微观骨结构较完整、骨小梁数目多于对照组，未发现骨小梁断裂的情况，而在对照组中发现了骨小梁断裂情况，同时在治疗组中也观测到新生的骨小梁，因此从微观角度证实了移植人羊膜间充质干细胞对骨小梁起到保护作用，进而对骨质疏松起到一定的疗效。

通过文章结果可推测，移植人羊膜间充质干细胞对去卵巢骨质疏松大鼠具有治疗作用，很可能是通过促进Runx2、Osterix表达发挥作用。