重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对脓毒症模型小鼠的治疗作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.014

摘要/Abstract

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文题释义：
白细胞介素：由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。目前至少发现了38个白细胞介素，其在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用。根据细胞因子的结构同源性可将其分为几个蛋白质家族，如白细胞介素1家族、白细胞介素6家族、白细胞介素10家族和造血因子家族等。
中性粒细胞：在瑞氏染色血涂片中，胞质呈无色或极浅的淡红色，有许多弥散分布的细小的(0.2-0.4 μm)浅红或浅紫色的特有颗粒。细胞核呈杆状或2-5分叶状，叶与叶间有细丝相连。中性粒细胞具有趋化作用、吞噬作用和杀菌作用。中性粒细胞来源于骨髓，具有分叶形或杆状的核，胞浆内含有大量既不嗜碱也不嗜酸的中性细颗粒。这些颗粒多是溶酶体，内含髓过氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性水解酶等丰富的酶类，与细胞的吞噬和消化功能有关。

摘要
背景：研究发现粒细胞集落刺激因子可以用于治疗粒细胞减少症，关于粒细胞集落刺激因子治疗脓毒症的研究不多。
目的：探讨重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对脓毒症小鼠的治疗作用。
方法：采用腹腔内注射脂多糖的方法建立脓毒症小鼠动物模型，建模后6，30 h皮下注射重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，观察小鼠的肺组织病理变化、外周血中性粒细胞CD64表达以及血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素10水平。
结果与结论：①治疗后小鼠支气管上皮尚完整，间质轻度增生，见少量中性粒细胞浸润；②治疗后1，3，7 d治疗组小鼠外周血中性粒细胞CD64的表达和血清白细胞介素10水平显著高于模型组和正常对照组(P < 0.05)；③治疗后1，3，7 d治疗组小鼠血清肿瘤坏死因子α水平明显高于正常对照组(P < 0.05)，但低于模型组(P < 0.05)；④结果表明，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子具有增强脓毒症小鼠中性粒细胞功能和抗炎作用。

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ORCID: 0000-0002-2483-8401(冯敏)

关键词: 实验动物, 细胞损伤与修复模型, 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子, 脓毒症, 小鼠, 治疗, 肿瘤坏死因子α, 白细胞介素10

Abstract:

BACKGROUND: Granulocyte colony-stimulating factor has been shown to be used for the treatment of granulocytopenia, but its effect on sepsis is little reported.
OBJECTIVE: To explore the treatment outcomes of recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF) for sepsis mice.
METHODS: A sepsis mouse model was established by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide, and then given subcutaneous injection of rhGM-CSF at 6 and 30 hours after modeling. The morphological change of mouse lung tissue, CD64 expression in peripheral neutrophils, and serum levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-10 were ovserved, respectively.
RESULTS AND CONCLUISON: (1) Complete bronchial epithelial, mild stromal hyperplasia, and a few neutrophil infiltration were found after rhGM-CSF treatment. (2) CD64 expression in peripheral neutrophils, and serum level of interleukin-10 in the treatment group were significantly higher than those in the model and control groups at 1, 3 and 7 days after treatment (P < 0.05). The serum level of tumor necrosis factor-α in the treatment group was significantly higher than that in the control group, but lower than that in the model group after 1, 3 and 7 days of treatment (P < 0.05). (4) These results show that rhGM-CSF can enhance neutrophil function and the anti-inflammatory effects in sepsis mice.

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Key words: Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factors, Recombinant, Sepsis, Tumor Necrosis Factor-alpha, Interleukin-10, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

冯敏，常思远，徐大千，刘刚. 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对脓毒症模型小鼠的治疗作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(49): 7391-7396.

Feng Min, Chang Si-yuan, Xu Da-qian, Liu Gang. Treatment outcomes of recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor in a model mouse with sepsis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(49): 7391-7396.

图/表（结果） 4

2.1 各组小鼠的一般情况脓毒症模型组小鼠毛发竖起、精神比较差、呼吸加快反应迟钝、活动和饮食饮水减少；正常对照组小鼠精神好、反应正常、活动和饮食进水正常；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组小鼠精神稍差、活动和饮食进水欠佳。各组12只小鼠中，7 d时的存活情况分别为：脓毒症模型组存活6只，存活率为50%，正常对照组全部存活，存活率为100%，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组存活8只，存活率为67%。

2.2 各组小鼠的肺组织病理变化脓毒症模型组小鼠的肺组织支气管上皮变性脱落，间质增生，见中性粒细胞浸润，有灶性出血；正常对照组小鼠支气管上皮完整，间质正常，未见中性粒细胞浸润；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组小鼠支气管上皮尚完整，间质轻度增生，见少量中性粒细胞浸润，见图1。

2.3 各组小鼠外周血中性粒细胞表面抗原CD64的表达由表1看出，治疗后1，3，7 d模型组小鼠外周血中性粒细胞表面抗原CD64的表达均明显高于对照组(P < 0.05)，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组小鼠外周血中性粒细胞表面抗原CD64的表达明显高于对照组和模型组(P < 0.05)。对照组小鼠外周血中性粒细胞CD64的表达随着时间的延长没有明显变化；脓毒症模型组和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组小鼠外周血中性粒细胞CD64的表达在治疗后1 d达峰值，随着时间的延长逐渐降低。结果表明中性粒细胞CD64的表达升高是中性粒细胞活化的标志，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗可以提高中性粒细胞CD64的表达，对中性粒细胞的功能具有增强作用。

2.4 各组小鼠血清白细胞介素10水平的变化由表2看出，治疗后1，3，7 d模型组小鼠血清中白细胞介素10水平均明显高于对照组(P < 0.05)，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组小鼠血清中白细胞介素10水平明显高于对照组和模型组(P < 0.05)。对照组小鼠血清中白细胞介素10水平随着时间的延长没有明显变化；脓毒症模型组和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组小鼠血清中白细胞介素10水平在治疗后3 d时最高，随后呈下降趋势。结果表明重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗可以提高血清中白细胞介素10水平，从而提高脓毒症小鼠的抗炎作用。

2.5 各组小鼠血清中肿瘤坏死因子α水平的变化由表3看出，治疗后1，3，7 d模型组小鼠血清中肿瘤坏死因子α水平均明显高于对照组(P < 0.05)，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组小鼠血清中肿瘤坏死因子α水平明显高于对照组(P < 0.05)，但低于模型组(P < 0.05)。对照组小鼠血清中肿瘤坏死因子α水平随着时间的延长没有明显变化；脓毒症模型组和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组小鼠血清中肿瘤坏死因子α水平呈下降趋势。结果表明重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗可以降低血清中肿瘤坏死因子α水平，从而提高脓毒症小鼠的抗炎作用。

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引言

脓毒症是由感染引起的全身性炎症反应综合征，死亡率比较高，当脓毒症患者出现休克或器官功能障碍时，死亡的发生率可达一半以上^[1-3]。对于脓毒症的治疗，目前尚没有特别有效的药物。脓毒症的根本发病机制尚未明了，越来越多的证据显示，脓毒症不仅存在过度的炎症反应，还存在免疫功能抑制。当发生感染时，机体为了清除感染的病原体，启动体内的炎症反应，如果感染能够被及时控制，则病情逐渐好转，如果感染不能被及时有效控制，病原体持续存在，则会引起炎症递质过度释放，炎症反应细胞过度活化，炎症递质出现瀑布效应，引起组织水肿以及凝血等一系列变化，病情严重时，可导致多器官功能障碍、衰竭甚至死亡^[4-5]。由于在脓毒症病理进程中，感染总是并发全身性的炎症，因此，除了抗感染治疗外，抗炎已成为脓毒症治疗的一个重要发展方向。脓毒症的一个重要病理学指标是感染引起的全身炎症反应综合征，常见的促炎递质主要有肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6等。目前，对脓毒症的治疗除了通过抗生素进行抗感染治疗外，靶向全身炎症反应综合征的抗炎治疗也日益得到重视。粒细胞集落刺激因子能够促进粒系造血干细胞的分化、增殖和成熟，增强成熟中性粒细胞的功能，广泛应用于治疗不同原因引起的粒细胞减少^[6-9]。实验采用腹腔内注射脂多糖的方法建立脓毒症小鼠动物模型，给予重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗，发现重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子可以改善脓毒症小鼠的临床症状，提高中性粒细胞表面抗原CD64的表达，提高血清白细胞介素10水平，降低血清肿瘤坏死因子α水平，在增强中性粒细胞功能的同时，提高脓毒症小鼠的抗炎作用。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年9月至2015年10月在郑州大学第一附属医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物选择清洁级、健康雄性KM小鼠48只，8-10周龄，体质量16-22 g，购自河南省动物实验中心，实验前小鼠饲养1周，正常饮食和进水，饲养于小鼠专用鼠笼中。

1.3.2 主要试剂和仪器重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(广州拜迪生物医药有限公司)；小鼠肿瘤坏死因子α、白细胞介素10 ELISA试剂盒(广州市泓飞生物科技有限公司)；抗小鼠CD45-FITC抗体、抗小鼠CD64-PE抗体、抗小鼠IgG1-PE抗体(美国Sigma 公司)；红细胞裂解液(美国Biolegend公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术公司)；流式细胞仪(美国 BD公司)；离心机(上海安亭科学仪器厂)；水浴箱(上海精宏实验设备有限公司)；酶标分析仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物分组将48只小鼠随机分为3组：对照组、模型组和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组，每组16只。

1.4.2 建立脓毒症小鼠模型剃除小鼠腹部皮毛，乙醇消毒，模型组和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组小鼠腹腔注射1 mL脂多糖(用生理盐水将脂多糖稀释成1 g/L)，对照组小鼠同一部位注射等量的生理盐水。

1.4.3 各组小鼠的处理重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组小鼠在建模后6，30 h皮下注射重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(50 μg/kg)，模型组和对照组在建模后6，30 h皮下注射等量的生理盐水。每组取4只小鼠处死观察肺组织病理变化，每组剩余12只分别在给药后1，3，7 d进行抽血化验，并观察小鼠的一般情况和存活情况。

1.4.4 各组小鼠肺组织的病理变化给药7 d，对照组、模型组和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗组各取4只小鼠脱颈处死，固定到动物手术台上，切开腹腔，剪断肋骨，暴露胸腔，取出肺组织，制备病理切片进行常规苏木精-伊红染色。

1.4.5 各组小鼠血液标本采集各组小鼠眼眶静脉丛采血，离心，留取上清液，保存备用。

1.4.6 流式细胞仪检测外周血中性粒细胞表面抗原CD64的表达将流式细胞管进行标记，加入相应抗体(抗小鼠CD45-FITC抗体、抗小鼠CD64-PE抗体)，同型对照管中加入抗小鼠CD45-FITC抗体和抗小鼠IgG1-PE抗体，加入抗凝血摇匀后孵育，加入红细胞裂解液裂解红细胞，离心后加入PBS洗涤，再离心，弃去上清液，流式细胞仪检测中性粒细胞群中CD64阳性细胞的百分率。

1.4.7 采用双抗体夹心法检测外周血清肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平在酶标板上设立标准孔、空白孔和待测样品孔，分别加入样品稀释液、标准品和待测样品，加上覆膜进行孵育，加入生物素化抗体孵育，加入洗涤液洗涤，加入HRP酶结合物孵育，洗涤，加入底物溶液孵育，最后加入终止液，采用酶标仪检测各孔吸光度值，计算血清肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平。

1.5 主要观察指标 ①肺组织的病理变化；②外周血中性粒细胞表面抗原CD64的表达；③外周血清肿瘤坏死因子α和白细胞介素10水平。

1.6 统计学分析采用SPSS18.0软件，均数组间比较采用单因素方差分析，两两之间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

脓毒症是烧伤、感染、创伤以及内外科危重病比较常见的并发症，脓毒症一旦进展为脓毒症休克或者重症脓毒症，死亡率比较高，对人类的健康造成严重危害^[10-11]，当病原体侵入人体后，病原体的相关分子能够被PRRs识别，引起炎症细胞的活化，炎症递质被释放，引起全身性炎症反应综合征^[12-13]。病原体相关分子具有比较高的保守性，机体用有限数量的受体识别多种多样的病原体。脓毒症的主要病原体是细菌，机体的免疫系统通过模式识别受体识别病原体相关分子，引起炎性递质的释放，导致炎症风暴，造成组织损伤，当这种炎症反应对患者的生命造成危害时，机体会通过神经中枢进行体液调节，出现免疫功能抑制，引起二重感染或者感染迁延，危及生命，脓毒症的发生是机体多个系统共同参与的结果^[14-15]。脓毒症没有特别有效的治疗方法^[16-21]，主要为早期应用有效的抗生素，同时进行支持治疗，包括营养支持、液体疗法、呼吸支持、血管活性药物、抗凝治疗、免疫调节剂治疗以及肾替代治疗等，但这些治疗方法并没有有效降低脓毒症的死亡率。

粒细胞集落刺激因子来源比较广泛，单核巨噬细胞以及血管内皮细胞、间皮细胞等均能产生一定量的粒细胞集落刺激因子^[22-23]，某些恶性肿瘤也能分泌粒细胞集落刺激因子，人类的粒细胞集落刺激因子是一种酸性糖蛋白，粒细胞集落刺激因子和粒细胞集落刺激因子受体结合发挥生物学效应，粒细胞集落刺激因子的动员和造血祖细胞表面是否有粒细胞集落刺激因子受体没有关系，主要是影响造血干细胞或者造血祖细胞表面黏附分子功能及表达^[24-25]，诱导粒系祖细胞的分化增殖和成熟，抑制造血干细胞或造血祖细胞的凋亡，降低内皮细胞黏附分子水平，降解细胞外基质，增加基质金属蛋白酶的释放^[26-28]。粒细胞集落刺激因子能够增加中性粒细胞的作用，提高T淋巴细胞和单核细胞的数量，主要用于恶性肿瘤患者放化疗后引起的白细胞减少症，艾滋病患者治疗后白细胞减少症，骨髓移植后粒细胞缺乏引起的严重感染，再障或者严重烧伤引起的粒细胞减少症，在抗肿瘤增殖、保护神经、治疗心肌梗死、抗再灌注损伤以及抗休克中也有应用^[29-36]。

脓毒症是一种复杂的免疫-炎症过程，目前的治疗方法效果不太理想，因此对脓毒症进行免疫调理是治疗脓毒症的一种思路^[37]，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子能够增强中性粒细胞的功能，促进粒系干细胞的分化、增殖以及成熟，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子同时具有抗炎作用，脓毒症作为一种免疫-炎症反应过程，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对其具有潜在的治疗意义。实验采用腹腔内注射脂多糖的方法建立脓毒症小鼠动物模型，应用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗脓毒症模型小鼠。脓毒症模型组小鼠的肺组织支气管上皮变性脱落，间质增生，中性粒细胞浸润，有灶性出血；治疗组小鼠支气管上皮尚完整，间质轻度增生，有少量中性粒细胞浸润。治疗后1，3，7 d模型组小鼠外周血中性粒细胞CD64的表达明显高于对照组，治疗组小鼠外周血中性粒细胞CD64的表达明显高于对照组和模型组。治疗后1，3，7 d模型组小鼠血清中白细胞介素10水平明显高于对照组，治疗组小鼠血清中白细胞介素10水平明显高于对照组和模型组。治疗后1，3，7 d模型组小鼠血清中肿瘤坏死因子α水平明显高于对照组，治疗组小鼠血清中肿瘤坏死因子α水平明显高于对照组，但低于模型组。由此可见，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子治疗可以提高外周血中性粒细胞CD64的表达，对中性粒细胞的功能具有增强作用，同时可以提高血清中白细胞介素10水平，降低血清中肿瘤坏死因子α水平，从而提高脓毒症小鼠的抗炎作用。

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