来源于乳腺癌正常组织乳腺干细胞的安全性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.007

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (41): 6125-6130.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.007

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来源于乳腺癌正常组织乳腺干细胞的安全性

毕晓娟¹，付明刚²，郭丽英²，刘莎²，迪丽米娜•伊拉木²，郭晨明²

新疆医科大学第一附属医院，¹临床医学研究院科研基地科，²消化血管中心乳腺外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2016-09-03 出版日期:2016-10-07 发布日期:2016-10-07
通讯作者: 郭晨明，博士，主治医师，新疆医科大学第一附属医院消化血管中心乳腺外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:毕晓娟，女，1983年生，新疆维吾尔自治区和硕县人，汉族，2016年新疆医科大学毕业，硕士，助理研究员，主要从事干细胞相关研究。
基金资助:
新疆重大疾病医学重点实验室开放课题(SKLIB-XJMDR-ZX-2014-1)；新疆医科大学第一附属医院自然科学基金青年项目(2013ZRQN50)

Safety assessment of mammary gland stem cells from normal tissues in breast cancer patients

Bi Xiao-juan¹, Fu Ming-gang², Guo Li-ying², Liu Sha², Dilimina Yilamu², Guo Chen-ming²

¹Scientific Research Base of Clinical Medicine Research Institute, ²Department of Breast Surgery, Research Center for Digestion and Vessels, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2016-09-03 Online:2016-10-07 Published:2016-10-07
Contact: Guo Chen-ming, M.D., Attending physician, Department of Breast Surgery, Research Center for Digestion and Vessels, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Bi Xiao-juan, Master, Assistant researcher, Scientific Research Base of Clinical Medicine Research Institute, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
Open Topics of Xinjiang Key Laboratory of Critical Diseases, No. SKLIB-XJMDR-ZX-2014-1; the Natural Science Foundation for the Youth in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, No. 2013ZRQN50

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
乳腺干细胞：研究显示乳腺癌是由于乳腺干细胞或接近干细胞水平的祖细胞病变引起，而乳腺干细胞可以从正常乳腺腺体、良性或恶性乳腺肿瘤的瘤旁组织以及乳汁分离的乳腺上皮细胞中获得。通过检测乳腺干细胞的干细胞特性和多种生物学特点、基因特点及其分子生物学方面的安全性，对将来研究乳腺的发生、发育、器官再生有很大帮助。
c-erbB-2基因：又称为neu或HER-2基因，是一种细胞来源癌基因，在多种肿瘤中其癌基因及蛋白产物(P185)均有过度表达和扩增。对c-erbB-2癌基因蛋白产物P185的病理研究首先多见于乳腺癌，其作用也较为明确。目前普遍认为，c-erbB-2蛋白产物的阳性表达可作为判断乳腺癌预后的一个独立指标。

摘要
背景：乳腺干细胞的培养对研究乳腺的发育及乳腺癌具有重要的意义。
目的：找到一种易操作的体外分离培养乳腺干细胞的方法，并验证其安全性。
方法：分离培养乳腺癌旁正常组织中乳腺上皮细胞，流式细胞仪分选CD49f和EPCAM阳性细胞进行干细胞表面标记分析及细胞集落形成能力分析，然后在乳腺干细胞、乳腺癌组织和乳腺癌旁正常组织中提取mRNA，实时荧光定量PCR检测C-erbB-2和Maspin基因的表达。
结果与结论：①成功培养出人乳腺干细胞，并且细胞表面特异性标志物CD49f，EPCAM高表达；②集落形成能力分析可见混合集落、腔上皮细胞集落、肌上皮细胞集落；③乳腺干细胞C-erbB-2低表达，而Maspin高表达，证明来源于乳腺癌正常组织的乳腺干细胞具有生物安全性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2574-8387(郭晨明)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 乳腺干细胞, 乳腺癌, c-erbB-2, maspin, CD49f, EPCAM

Abstract:

BACKGROUND: The cultivation of mammary gland stem cells is of great significance for the development of mammary gland and breast cancer.
OBJECTIVE: To seek an easy method to isolate and culture mammary gland stem cell in vitro, and verify the safety of cells.
METHODS: Mammary epithelial cells were isolated from normal tissues surrounding breast cancer, and CD49f- and EPCAM-positive cells were sorted using flow cytometry followed by surface marker analysis and cell colony formation ability analysis. Afterwards, real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect C-erbB-2 and Maspin mRNA expression in mammary gland stem cells, breast cancer tissues and normal tissues surrounding breast cancer.
RESULTS AND CONCLUSION: Human mammary gland stem cells were successfully cultured and highly expressed CD49f and EPCAM, with the presence of mixed colony, pleural epithelial cell colony, and myoepithelial cell colony. c-erbB-2 was lowly expressed while Maspin highly expressed in mammary gland stem cells. Our experimental findings indicate that the mammary gland stem cells derived from normal tissue surrounding breast cancer have biological safety.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Breast Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Genes, erbB-2, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

毕晓娟，付明刚，郭丽英，刘莎，迪丽米娜•伊拉木，郭晨明. 来源于乳腺癌正常组织乳腺干细胞的安全性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6125-6130.

Bi Xiao-juan, Fu Ming-gang, Guo Li-ying, Liu Sha, Dilimina Yilamu, Guo Chen-ming . Safety assessment of mammary gland stem cells from normal tissues in breast cancer patients[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(41): 6125-6130.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

乳腺在结构上是一个动态变化的器官，随年龄、月经周期、孕育状态而发生相应的变化。成年女性的90%乳腺实体细胞由两大类细胞组成：导管上皮细胞和肌上皮细胞，这两类细胞增殖、分化、凋亡失去功能后必须有前体细胞来补充。乳腺干细胞是乳腺中很少的细胞群体，但具有调节乳腺发育、结构重建等多种功能^[1-3]。也有实验证明乳腺癌最初就来源于干细胞样的肿瘤细胞，乳腺癌是由于乳腺干细胞或接近干细胞水平的祖细胞病变引起^[4]。由于乳腺自身发育的特殊性，以及异常分化与乳腺肿瘤的关系，是研究器官发生、细胞分化、器官修复再生等非常合适的模型。

目前有很多方法分离鉴定乳腺干细胞，然而对于它的表型还是很有争议，一些研究者认为乳腺干细胞存在于基底细胞层，主要表达EpCAM^lowCD49f^hi[5-6]，另一些研究者认为ALDH1⁺乳腺干细胞可以在小鼠体内形成乳腺，是乳腺干细胞的标记物^[7-8]。还有学者认为CD44⁺CD24^-^/lowLin^-是乳腺干细胞维持自我更新的重要标记物^[9]。作者拟采用流式分选的方法分离培养乳腺干细胞，从而证明此方法的可行性。

研究中的标本来源于乳腺癌旁正常组织，为了证明乳腺干细胞在增殖分化过程中遗传学或调节机制是否发生异常，需要验证乳腺干细胞的安全性。c-erbB-2是一种细胞来源的原癌基因，参与细胞生长、繁殖、分裂的调控，在浸润性导管癌中c-erbB-2过度表达与腋窝淋巴结转移及肿瘤细胞核分裂数增多呈正相关。maspin是一种抑癌基因，在正常乳腺组织表达，但在乳腺癌组织中表达下降或丧失，其下降与乳腺癌无病生存率缩短相关。

实验在体外分离、培养并鉴定乳腺干细胞，观察其生物学特性并进行与乳腺癌相关基因分析，以证明该细胞的干细胞特性和多种生物学特点，为研究乳腺的发生、发育、生物学特性提供基础依据。

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2015年10月在新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院干细胞研究室完成。

1.3 材料 标本取材于新疆医科大学第一附属医院乳腺外科收治的女性浸润性导管癌患者手术切除的癌组织及癌旁组织，其中用于提取乳腺干细胞的标本来源于10例浸润性乳腺导管癌患者的癌旁组织(> 3 cm)，用于基因检测标本来源于10例浸润性乳腺导管癌患者癌组织与癌旁组织，年龄34-78岁，经病理证实为浸润性乳腺导管癌和正常乳腺腺体。排除标准：有乙肝、艾滋等传染性疾病者。

1.4 实验方法

1.4.1 乳腺上皮细胞的原代培养 手术后将乳腺癌旁正常组织(> 3 cm)用无菌纱布包裹装入密封袋，4 h内进行细胞培养。用无菌剪刀去除乳腺腺体周围脂肪组织及毛细血管，在培养皿中反复用生理盐水冲洗，然后剪碎成大小为0.3 cm×0.3 cm的组织块，加入300 U/mgⅠ型胶原酶消化液10 mL，37 ℃恒温摇床振动16 h，加入40 mL PBS终止反应，80×g离心30 s，离心管底部为细胞团块，收集上清继续200×g离心3 min，弃上清，留下底层细胞团块。将两次收集的细胞团块分别加入0.25% Trypsin- EDTA 1 mL，上下吹打1 min，直至细胞团块变成云雾状，加入9 mL PBS冲洗，350×g离心5 min，弃上清，收集底层细胞，继续加入2 g/L DNaseⅠ200 μL，上下吹打直至云雾状消失，细胞完全溶解在液体中，加入9 mL PBS冲洗，350×g离心5 min，弃上清，收集底层细胞，用含体积分数为5%血清的乳腺干细胞专用培养基重悬，计数，按照2×10⁴/cm²接种细胞，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中孵育，24 h后换成不含血清培养基继续培养7-10 d，拍照观察。

1.4.2 乳腺上皮细胞的传代培养 当细胞汇合达80%时，进行传代培养，弃去培养基，加入适量0.25% Trypsin-EDTA，37 ℃消化约10 min，待细胞回缩变圆，加入PBS终止消化，收集细胞350×g离心5 min，弃上清，收集底层细胞，用含体积分数为5%血清的乳腺干细胞专用培养基重悬，计数，按照2×10⁴/cm²接种细胞，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中孵育，24 h后换成不含血清培养基继续培养7-10 d。

1.4.3 应用流式细胞仪分选乳腺干细胞 乳腺上皮细胞常规培养、传代至细胞数量(1.0-2.0)×10⁷个，消化后用PBS冲洗2次，然后用90 μL PBS重悬细胞，加入CD49f，EPCAM抗体各5 μL，于4 ℃孵育30 min。取出试管，用500 μL PBS重悬细胞，上流式分选仪分选CD49f，EPCAM阳性细胞。收集的细胞继续培养或者提取mRNA备用。

1.4.4 乳腺干细胞的鉴定

流式细胞仪检测：细胞形成克隆并且融合达80%传代，加入EpCAM，CD49f单克隆抗体，避光孵育15 min，流式细胞仪分析标记的乳腺干细胞。

吉姆萨染色：用甲醛固定细胞标本10 min，取1份醋酸，3份甲醛固定30 min，染色液染10-15 min，然后用自来水将玻片上的染液冲洗掉。空气干燥，二甲苯透明。光学树脂胶封固后摄像。

细胞集落形成能力(CFU)分析：使用Stemcell公司的人乳腺干细胞集落鉴定试剂盒EpiCult^TM-B评估祖细胞集落形成能力，操作方法按说明书进行。

1.4.5 qRT-PCR检测C-erbB-2和Maspin基因的表达情况 Trizol一步法收集乳腺干细胞、乳腺癌组织和乳腺癌旁正常组织中mRNA，每个样本按1 μg mRNA反转录为cDNA。以GAPDH为内参对照。反应体系20 μL：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，无RNA酶水6 μL，cDNA模版2 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，扩增40个循环，每个循环包含：95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s。采用2^-^??Ct方法进行结果分析。

1.5 主要观察指标 ①乳腺干细胞形态；②流式细胞仪检测乳腺干细胞EpCAM，CD49f的表达；③细胞集落形成实验鉴定干细胞的自我更新能力；④瑞士吉姆萨染色观察导管上皮细胞和肌上皮细胞的形态；⑤C-erbB-2和Maspin mRNA的表达。

1.6 统计学分析 使用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，数据均使用x(_)±s表示，两组之间比较采用t 检验统计方法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

乳腺癌是危害女性生命和健康的常见恶性肿瘤，在中国约占全身恶性肿瘤的7%-10%，其发病率位于女性肿瘤的首位，且发病率逐年升高。1999年，Chepko和Smith研究证实，乳腺上皮的生成和维持是通过乳腺干细胞完成的^[10]。乳腺干细胞具有自我更新能力，是产生乳腺管状和小叶状结构的基础，能分化为所有系列乳腺上皮细胞。正是这些乳腺干细胞保证了哺乳动物乳腺在多次怀孕生产过程中乳腺再生、泌乳和退化周期的维持。2002年，Welm等^[11]首次利用造血干细胞的标记蛋白Sca-1，结合抗原抗体免疫磁珠反应和流式细胞仪分选出小鼠乳腺干细胞，并对其特性以及再生分化潜能进行了研究。因此，乳腺干细胞的研究越来越受到肿瘤学家的重视。国外已有的动物实验研究也证实小鼠乳腺干细胞在裸鼠体内可以生长出完整的具有功能的乳房，包含所有的正常乳腺细胞，且有分泌乳汁的功能^[12]。乳腺干细胞可以从正常乳腺腺体、良性或恶性乳腺肿瘤的瘤旁组织以及乳汁分离的乳腺上皮细胞中获得^[13-16]，国内在这方面的研究很少。

国外不同实验室分离培养乳腺干细胞的方法各有不同，比如用剪刀剪碎或用手术刀切碎，胶原酶的选择及浓度，消化时间的长短，免疫磁珠法或流式分选技术^[17-22]。作者认为胶原酶消化的浓度和时间非常重要，最初尝试用高浓度的胶原酶消化4 h，结果得到的乳腺上皮细胞非常少，并且纯度不高，混杂很多成纤维细胞。采用0.3%Ⅰ型胶原酶消化16 h，虽然时间长，但得到的乳腺上皮细胞较多，且纯度更高。

流式分选技术是将荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入充满鞘液的流动室内，液滴充以正、负不同的电荷，在高压电场的作用下落入各自的收集容器中，从而实现细胞的分离。流式细胞仪分选精确度高达99%，因此实验采用流式分选技术获得乳腺干细胞。乳腺干细胞的表面标志物不同课题组也有不同的选择，如CD24，CD44，CD49f，EPCAM，ALDH1等^[23-25]。实验采用分选CD49f⁺EPCAM⁺细胞进行集落分析及细胞分化实验，发现这群细胞具有乳腺干细胞的多向分化能力，并且增殖能力很强。

目前乳腺干细胞与乳腺癌研究现状显示：乳腺普通型导管增生、不典型导管增生和导管原位癌以线性发展的模式进展为浸润性乳腺癌^[26-27]。干细胞模型有助于更好地理解良性增生性乳腺病变和乳腺癌的发生关系。乳腺中仅有少部分细胞可以自我更新，其间如果分子遗传学或调节机制发生异常，则为癌症的发生奠定基础。实验标本来源于乳腺癌旁正常组织，为了验证乳腺干细胞是否具有生物学安全性，检测了c-erbB-2 和maspin这2个基因的mRNA表达水平。c-erbB-2是表皮生长因子受体超家族成员，具有蛋白激酶活性的细胞膜糖蛋白，参与细胞生长、繁殖、分裂的调控，在疾病启动阶段后期，这种机制使某些不正常细胞获得失控的独立生长能力从而转为肿瘤细胞^[28]。maspin是一种抑癌基因，其抑瘤机制可能为：①抑制组织型纤维蛋白溶解酶原激活因子(tPA)活性；增强乳腺癌细胞的同质黏附，减少肿瘤细胞从原发灶脱落，这个过程主要是通过增强 E-Cad 的表达实现的；②maspin蛋白与Ⅱ/Ⅳ型胶原互相作用，引起细胞黏连，抑制肿瘤转移和血管生成；降低肿瘤细胞的异质黏附，避免肿瘤细胞与血管内皮细胞黏附；③maspin增强癌基因活性抑制药物诱导的凋亡，包括促进DNA的断裂，增强多聚ADP核糖聚合酶的蛋白水解作用失活，促进Caspase8、caspase3激活，抑制肿瘤细胞运动、侵袭和转移^[29]。maspin在正常乳腺组织表达，但在乳腺癌组织中表达下降或丧失，其下降与乳腺癌无病生存率缩短相关^[30]。实验结果显示乳腺干细胞c-erbB-2低表达，而maspin高表达，证明分离的乳腺干细胞具有生物安全性。
目前利用成体干细胞进行器官移植和组织再造工程是国内外研究的热点，应用乳腺成体干细胞长出的乳腺组织可用于乳房切除术后的乳房Ⅰ，Ⅱ期再造手术或隆胸手术，对乳腺癌患者或者其他相关疾病的患者都有着十分广阔的应用前景。

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