小鼠胚胎干细胞不同分化阶段UGT1a1、UGT1a6和mGST1的表达特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.004

摘要/Abstract

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文题释义：
胚胎干细胞：是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞研究在美国一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，因为胚胎干细胞可以分化成多种功能的细胞，被认为是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。由胚胎来源的原始(未分化)细胞，它们具有分化成为众多特异细胞类型的潜能。
尿普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶(udines 5-diphosphateglucuronosyl transferases，UGTs)：是人体相对比较重要的生物催化酶，它集中分布在肝脏，并且该生物酶种类较多，它的催化、结合反应是机体肝脏解毒功能的重要途径之一，该生物酶和其他没相比具有明显的差异，能与葡萄糖醛酸、谷胱甘肽等物质结合，在药物代谢中发挥重要作用。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶是人体比较特殊的糖蛋白，该蛋白能够促进药物与葡萄糖相互结合，形成普醛酸苷。
微粒体谷肤甘肤S-转移酶1(crosomeglutathiones-transferase，mGST1)：在机体内表达较多，它能够与亲电子基相互融合。UGTs和mGST1均属于集体内最为重要的Ⅱ相代谢酶，并且这些酶更多的分布在肝脏中。从基因表达上看：UGT1a1、UGT1a6在分化过早稳定表达，UGT1a6在分化早期未见表达，至分化后期有较高的表达，而mGST1在分化过程中表达量逐渐增加。

摘要
背景：目前对于小鼠胚胎干细胞不同分化阶段的尿普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶1a1、尿普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶1a6和微粒体谷肤甘肤S-转移酶1表达特征缺乏研究，报道较少。
目的：观察小鼠胚胎干细胞不同分化阶段普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶1a1、尿普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶1a6和微粒体谷肤甘肤S-转移酶1的表达特征。
方法：分离培养Wistar大鼠胚胎成纤维细胞，制备饲养层细胞。将胚胎干细胞接种于饲养层细胞上，诱导胚胎干细胞分化为肝细胞，采用Western blot检测尿普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶1a1、尿普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶1a6和微粒体谷肤甘肤S-转移酶1表达特征，色谱法测定计算微粒体谷肤甘肤S-转移酶1催化活性。
结果与结论：在胚胎干细胞在分化为肝细胞过程中，尿普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶1a1呈现上升趋势；尿普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶1a6在分化起初并未发现其表达，而在分化第18天后表达相对较高；微粒体谷肤甘肤S-转移酶1在胚胎干细胞分化为干细胞整个过程中均具有较高的表达，但表达丰度均低于成年小鼠干细胞。干细胞分化第18天，肝组织微粒存在微粒体谷肤甘肤S-转移酶1催化活性为7.65 μmol/(min•g)。结果表明，胚胎干细胞分化为肝细胞过程中，尿普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶1a1相对比较稳定，尿普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶1a6在分化不同过程中呈现出上升趋势，而微粒体谷肤甘肤S-转移酶1在胚胎干细胞分化为肝细胞过程中表达甚微。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6631-0832(许玲莉)

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 小鼠胚胎干细胞, 肝组织定向分化, 分化阶段, UGT1a1, UGT1a6, mGST1, 表达特征, 胚层结构

Abstract:

BACKGROUND: Until now, limited information has been neported on the characterization of udines 5-diphosphateglucuronosyl transferase (UGT) 1a1, UGT1a6, and microsomal glutathione S-transferase 1 (mGST1) during the differentiation of mouse embryonic stem cells.
OBJECTIVE: To observe the expression characteristics of UGT1a1, UGT1a6 and mGST1 at different stages of differentiation of mouse embryonic stem cells.
METHODS: Embryonic fibroblasts from Wistar rats were isolated and cultured as feeder cells. Mouse embryonic stem cells seeded onto these feeder cells were induced to differentiate into hepatocytes. Subsequently, expression of UGT1a1, UGT1a6 and mGST1 was detected using western blot assay, and catalytic activity of mGST1 was determined by high performance liquid chromatography.
RESULTS AND CONCLUSION: Increasing UGT1a1 expression was visible during the whole cell differentiation, while UGT1a6 exhibited no expression initially but a higher level at 18 days of differentiation. mGST1 expression was visible at high level throughout the differentiation, but its expressive abundance was still lower than that in the adult mouse stem cells. At 18 days after the beginning of differentiation, the catalytic activity of mGST1 in microsomal liver tissue was 7.65 μmol/(min•g). Taken together, stabilized UGT1a1, increased UGT1a6 and little mGST1 expression are confirmed in the differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Embryonic Stem Cells, Hepatocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

胚胎干细胞能够在体外分化为外、中、内胚胎中的任何细胞类型，是从早期胚胎内细胞团或桑椹胚分离后，能在体外长期传代培养并保持高度未分化的全能细胞系，具备三胚胎结构，能够利用细胞因子及信号网络相互诱导，形成肝细胞^[1]。与一般细胞相比，胚胎干细胞具有以下特征：分化后获得的肝细胞具备胚胎干细胞的3层胚层结构；依赖时空表达肝细胞特异性转录因子以及干细胞的特异基因^[2-3]；胚胎干细胞分化获得肝细胞后能够获得双核表型，并且能够促进干细胞合成、分泌白蛋白等物质^[4-5]；能够表达微粒体Ⅰ相代谢酶，并且该酶具备一定的活性。正是由于这些特征，胚胎干细胞体外分化为肝细胞被认为重演了体内肝细胞的分化过程，逐渐成为肝脏研究替代模型，如：肝脏发育生理学、肝脏病理学及肝脏疾病学的研究，分化获得的干细胞和肝组织可以运用于组织工程学，能够为肝脏疾病细胞治疗提供参考和方法^[6-7]。

药物的Ⅱ相代谢反应又称为结合反应，包括与葡萄糖醛酸，谷胱甘肽等结合反应，属于机体中肝脏的重要解毒功能，并且在人体中主要以药物的非活性形式存在，使之极性增加排除体外。在药物代谢中，尿普二磷酸葡萄糖醛酞转移酶(udines 5-diphosphateglucuronosyl transferases，UGTs)是人体相对比较重要的生物催化酶，它集中分布在肝脏，并且该生物酶种类较多，它的催化、结合反应是机体肝脏解毒功能的重要途径之一，该生物酶和其他没相比具有明显的差异，能与葡萄糖醛酸、谷胱甘肽等物质结合，在药物代谢中发挥重要作用^[8-9]。UGTs是人体比较特殊的糖蛋白，该蛋白能够促进药物与葡萄糖的相互结合，形成普醛酸苷。微粒体谷胱甘肽S-转移酶1(microsomal glutathione S-transferase 1，mGST1)在机体内表达较多，它能够与亲电子基相互融合^[10-11]。因此，临床上研究鼠胚胎干细胞不同分化阶段UGT1a1、UGT1a6和mGST1表达特征具有重要的意义^[12-13]。

实验探讨小鼠胚胎干细胞在肝组织定向分化中的作用，研究小鼠胚胎干细胞不同分化阶段UGT1a1、UGT1a6和mGST1表达特征。

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年10月至2015年10月在南通大学医学院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：10只孕13 d Wistar大鼠，体质量为0.13-0.35 kg，平均(0.26±0.01) kg，由南通大学医学院动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为SCXK(苏)2007-0010。

对大鼠进行等条件喂养，对动物的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则^[14-15]。

1.4 实验方法

1.4.1 胚胎干细胞的支持培养

原代胚胎成纤维细胞的制备：取10只Wistar大鼠，断颈处死，充分暴露并取出子宫，将其放置在含有D-Hank’s液培养器皿中，去除血迹。将子宫系膜和胎膜去除，放置在含有D-Hank’s液的培养器皿中，清洗二三次去除红细胞。将胚胎头部、内脏、四肢及尾巴等去除，放在含有D-Hank’s液的培养器皿中，清洗2次^[16-17]。将躯干剪成1 mm³碎片，放入离心管中，加入0.25%胰蛋白酶，放入37 ℃水浴箱中消化10 min，吸取上层清液置入另一只离心管中，加入小牛血清终止消化。向离心管中加入鼠胚胎成纤维细胞生长培养基制成悬液，计数，以4×10⁴/cm²密度接种在培养皿中，放入体积分数5%CO₂温箱内孵育，每天换液，待细胞长满后进行传代^[18-29]。

饲养层细胞制备：取长满的第3-5原代大鼠胚胎成纤维细胞，去除旧培养液，加入新配置的含有丝裂霉素C的鼠胚胎成纤维细胞培养基，孵育1 h，使得饲养层细胞失去增殖能力(丝裂霉素C母液；2 mL丝裂霉素C溶淤 5 mL无菌PBS中，4 ℃下储存2周，使用时利用鼠胚胎成纤维细胞生长培养基稀释到质量浓度为10 mg/L)。去除培养液，采用D-Hank’s液进行5次清洗，加入适量的胰酶消化制成形成单细胞悬液，以4×10⁴/cm²密度接种在培养瓶中，放入孵育箱中培养24 h^[20]。

胚胎干细胞支持培养：胚胎干细胞从液氮中取出后，迅速放置在37 ℃水浴中解冻，待完全融化后移入预先加有培养液的离心管中，去除上层清液，按照并将4×10⁴/cm²密度接种在饲养层细胞上，并放入孵育箱培养，每天换液1次，二三天传代1次。采用高糖DMEM，0.1 mmol/L β-琉基乙醇作为培养液，置入含体积分数10%胎牛血清及10⁶ U/L小鼠白血病抑制因子，每2 d传代1次^[21]。

1.4.2 胚胎干细胞分化为肝细胞

悬滴培养：将获得的小鼠胚胎干细胞制作成2×10⁴/cm²的单细胞悬液，并且将30 µL细胞悬液接种在10 cm的培养皿中，加入10 mL D-Hank’s液，保证盖子上小滴倒挂成悬液，置入培养箱中培养5 d。

贴壁培养：在电子显微镜下利用吸管将拟胚体转移到24孔板内，每次孔放入8个拟胚体，进行4.0-5.0 h孵育，使其吸附贴壁后每孔加入1 mL培养液，观察细胞形态^[22-23]。

1.5 主要观察指标

UGT1a1、UGT1a6和mGST1测定：①Western blot法检测：利用细胞铲刮取法收集分化过程不同时间点的拟胚体获取总蛋白，并将其放置在12.5%SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，电泳2 h，将蛋白电膜到硝酸纤维素膜上，时间1.5 h，采用5%脱脂牛奶溶液在室温下封闭1 h，采用T-PBS漂洗3次一次加入UGT1a1、UGT1a6和mGST1抗体，孵育2 h，并采用T-PBS进行3次漂洗^[24]。假设辣根过氧化物标记的抗兔二抗进行室温1.5 h孵育，采用ECL法检测印迹膜，在暗室内压片，采用Gel Doc2000型凝胶成像系统将获得的条带密度进行分析。将β-Actin作为内参照^[25]。②mGST1活性测定：将上文获得的肝脏组织，将其放入1.5 mL的离心管中，加入0.94 mL缓冲液，分别加入250 mmol/L GSH 20 µL及20 µL 50 mmol/L CDNB，混合均匀后加入20 µL样品，并测定340 nm吸收光度(A₃₄₀)变化情况^[26]。

酶活性测定方法：将第80秒的A₃₄₀及第20秒A₃₄₀差值作为酶促反应速率，酶的活性计算公式为：酶促反应速/9.6/酶蛋白量，多次测量求取平均值^[27-28]。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件处理，计数资料行χ²检验，采用n/%表示，计量资料行t 检验，采用x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

胚胎干细胞是机体比较常见的细胞，该细胞具有体外培养无限增殖以及自我更新能力^[29]。研究显示：胚胎细胞无论在何种环境下均可以分化成机体所有细胞^[30]。多能干细胞是一种特殊的细胞，自从该细胞问世后一直引起广泛的灌注。相关研究显示：多能干细胞在特定环境下能诱导胚胎干细胞分化、增殖，但是该结论尚未得到证实。临床上，利用胚胎干细胞在体外定向能够分化为肝组织，并且该细胞在药物代谢中也有其独特之处，能够为肝脏疾病的研制提供动物模型^[31-32]。

通常情况下，胚胎干细胞在形成拟胚体3层结构，且在不需要添加诱导因素下成功诱导产生肝组织发育必须具备相应的信息和诱导因子，在整个过程中均能很好的获得机体内肝组织的发育过程中^[33-34]。此次研究中，第3代小鼠胚胎干细胞以聚落状贴壁生长为主，而对于未分化的胚胎干细胞克隆类似岛屿，呈现圆形或圆形；边缘清晰、光滑，与饲养层边界比较清晰，并未发生分化现象；干细胞排列紧密，但是细胞边界不清晰，由此看出：实验中小鼠体内分化得到的胚胎干细胞具备基因表达的特性，并且具备P450酶的代谢功能，实验中分化获得的干细胞在白蛋白分泌等功能上均具有较大的优势，并且实验步骤也相对比较简单^[35-36]。

UGTs和mGST1均属于集体内最为重要的Ⅱ相代谢酶，并且这些酶更多的分布在肝脏中。从基因表达上看：UGT1a1、UGT1a6在分化过早稳定表达，UGT1a6在分化早期未见表达，至分化后期有较高的表达，而mGST1在分化过程中表达量逐渐增加。提示：由胚胎干细胞分化的成熟肝细胞在基因层面类似成熟肝细胞Ⅱ相代谢酶的表达特征。此次研究中，小鼠胚胎干细胞在分化为肝细胞过程中，UGT1a1呈现上升趋势；UGT1a6在分化起初并未发现其表达，分化第18天后UGT1a6水平达到最高，而mGST1在胚胎干细胞分化为干细胞整个过程中均具有较高的表达，但是表达丰度均低于成年鼠干细胞。由此看出^[37-38]：胚胎干细胞分化的干细胞在分化终点Ⅱ相代谢酶功能趋于成熟。同时，机体胚胎肝细胞中尚存在少量的Ugt1a1基因的表达，随着肝细胞分化的不断进行，Ugt1a1蛋白表达水平得到增加，且分化终点其含量最高^[39]。此次研究中，取18天肝组织微粒体测定微粒体mGST1催化性，结果显示：干细胞分化第18天mGST1催化活性为7.65 μmol/(min•g)。

综上所述，在小鼠胚胎干细胞分化为干细胞过程中，UGT1a1相对比较稳定，UGT1a6在分化不同过程中呈现出上升趋势而mGST1在胚胎干细胞分化为肝细胞过程中表达甚微，具有其代谢功能，能够作为肝脏病理和生理体外研究典型模式，具有较高的临床研究价值。