异丙酚预处理联合脐血间充质干细胞移植治疗脑缺血再灌注损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.011

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脐带间充质干细胞移植的优势：①无伦理问题，来源广泛，易采集，易扩增。②具有更强的增殖能力，比骨髓间充质干细胞快数倍。③是一种更原始的间充质干细胞群。④能分泌粒细胞集落刺激因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子等。
缺血再灌注损伤严重程度的影响因素：①缺血时间：因为所有器官都能耐受一定时间的缺血。缺血时间短，恢复血供后可无明显的再灌注损伤。②侧支循环：缺血后侧支循环容易形成者，可因缩短缺血时间和减轻缺血程度，不易发生再灌注损伤。③需氧程度：因氧易接受电子，形成氧自由基增多．因此，对氧需求高者，较易发生再灌注损伤。④再灌注压力：再灌注压力愈高造成的再灌注损伤愈严重。

摘要
背景：异丙酚具有脑保护作用，而脐血间充质干细胞具有较高分化潜能，两者联用可能对脑缺血再灌注损伤有更好的治疗效果。
目的：评价异丙酚预处理与脐血间充质干细胞移植联用对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经再生的影响。
方法：将63只SD大鼠随机等分为模型组、异丙酚组和联合组。所有大鼠以内栓线法建立脑缺血再灌注损伤模型。异丙酚组大鼠于损伤前1 d腹腔注射100 mg/kg异丙酚。联合组大鼠损伤前1 d注射异丙酚(100 mg/kg)，并于大鼠尾部静脉静注脐血间充质干细胞(2×10⁹ L^-1) 0.5 mL。
结果与结论：①与模型组相比，异丙酚组和联合组大鼠脑组织病理损伤明显减轻，海马组织中survivn基因表达水平上升，神经功能明显改善；②联合组大鼠上述指标优于异丙酚组，同时与异丙酚组相比，联合组大鼠血清中丙二醛含量较低，而超氧化物歧化酶含量较高；③说明异丙酚预处理联合脐血间充质干细胞移植有效改善脑缺血再灌注损伤，且效果优于单纯异丙酚预处理。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0000-3462-9232(侯少科)

关键词: 干细胞, 移植, 脐血间充质干细胞, 干细胞移植, 异丙酚, 脑缺血再灌注损伤, 丙二醛含量, 超氧化物歧化酶

Abstract:

BACKGROUND: As propofol has a neuroprotective effect, and umbilical cord blood mesenchymal stem cells have a high differentiation potential, their combination will have a better therapeutic effect on cerebral ischemia-reperfusion injury.
OBJECTIVE: To study the effect of propofol pretreatment combined with umbilical blood mesenchymal stem cell transplantation on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.
METHODS: Sixty-three Sprague-Dawley rats were randomized into model, propofol, and combined group (n=21 per group). Rat models of cerebral ischemia-reperfusion injury were made using ligation of the middle cerebral artery occlusion in the three groups. Rats in the combined group were given 100 mg/kg propofol injection at 1 day before injury and injection of umbilical blood mesenchymal stem cells via the tail vein (0.5 mL, 2×10⁹/L).
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the neurological function was improved significantly in the propofol and combined group, especially in the latter one, presenting with a remarkable mitigation in brain injury and an increased level of survivn mRNA in the rat hippocampus. The content of serum malondialdehyde was lower but the activity of superoxide dismutase was higher in the combined group compared with the propofol group. These findings indicate that propofol pretreatment combined with umbilical blood mesenchymal stem cell transplantation has better therapeutic effects than propofol pretreamtnet alone for improving cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.

Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Propofol, Reperfusion Injury, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

侯少科，郝丽娜，魏娇，周亚净. 异丙酚预处理联合脐血间充质干细胞移植治疗脑缺血再灌注损伤[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(19): 2810-2816.

Hou Shao-ke, Hao Li-na, Wei Jiao, Zhou Ya-jing . Propofol pretreatment combined with umbilical blood mesenchymal stem cell transplantation improves cerebral ischemia-reperfusion injuries[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(19): 2810-2816.

图/表（结果） 3

2.1 脐血间充质干细胞的形态 原代培养的脐血间充质干细胞呈圆形及不规则形；培养5 d左右时，出现贴壁细胞，逐渐伸出突起，有胞体较大、多核的破骨样细胞出现；培养八九天时，可见呈漩涡状生长的集落细胞，铺满瓶底，部分呈长梭形或多角形；培养10-14 d时，细胞数量增加，呈集落状。随着脐血间充质干细胞传代次数的增加，细胞集落进一步扩大，破骨样细胞逐渐减少消失，呈梭形的成纤维样细胞均匀分布，传代脐血间充质干细胞可达80%融合(图1)。

2.2 实验动物数量分析 3组大鼠均进入结果分析，无脱失。

2.3 神经功能评分 造模后1 d各组大鼠神经功能评分接近(P > 0.05)；造模后3，7，14，21 d联合组和异丙酚组大鼠神经功能评分明显低于模型组(P < 0.05)，且联合组大鼠神经功能评分低于异丙酚组(P < 0.05；表1，图2)。

2.4 脑组织病理形态 苏木精-伊红染色结果显示，模型组大鼠缺血损伤中心区存在大量神经元胞核破裂、溶解、水肿等细胞坏死现象，细胞形态由多极形变为圆形。经异丙酚预处理后大鼠缺血损伤中心区神经元凋亡、坏死减少；而其联合脐血间充质干细胞干预后可见凋亡、坏死的神经元明显减少，神经元结构完整(图3)。
2.5 survive基因表达水平 反转录PCR检测结果显示，脑缺血再灌注损伤大鼠经异丙酚处理后，survivn基因的表达水平明显增加(P < 0.05)，且异丙酚预处理联合脐血间充质干细胞移植对survivn基因表达水平的提升效果优于单纯异丙酚预处理(P < 0.05；表2，图4)。
2.6 血清丙二醛和超氧化物歧化酶的含量 与异丙酚组相比，联合组大鼠血清中丙二醛含量较低，而超氧化物歧化酶含量较高(P < 0.05；表3，图5)。

参考文献

[1] Koerner IP, Brambrink AM. Brain protection by anesthetic agents. Curr Opin Anaesthesiol. 2006; 19(5):481-486.

[2] 于志君,成彩莲.脑缺血再灌注损伤中凋亡调控基因表达的变化及意义[J].武汉科技大学学报:自然科学版,2006, 29(4):425-428.

[3] 谭海波,于灵芝,边雯,等.脑缺血再灌注后大鼠氧化水平和神经功能损伤及异丙酚的影响[J].山东大学学报(医学版), 2010,48(1):41-44.

[4] 刘显明,李国平,刘月芬.异丙酚对脑缺血-再灌注后大鼠体内氧化水平的影响[J].创伤外科杂志,2008,10(1):61-63.

[5] 刘鹏斌,蔡英敏,宋金鑫.异丙酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响[J].第四军医大学学报,2007, 28(8):682- 684.

[6] 郭建荣,岳云,崔健君,等.异丙酚对缺血再灌注损伤大鼠海马氨基酸递质水平变化及神经元凋亡的影响[J].中国病理生理杂志,2007,23(8):1547-1550.

[7] 唐静,朱京慈.生态营养对重型颅脑损伤后大鼠超氧化物歧化酶及丙二醛的影响[J].中国实用护理杂志,2007, 23(9):1-3.

[8] 吕平,林明涛.银杏内酯对活性氧自由基和过氧化氢清除作用的研究[J].华北农学报,2010,25(1):151-154.

[9] Tuttolomondo A, Di Sciacca R, Di Raimondo D, et al. Neuron protection as a therapeutic target in acute ischemic stroke. Curr Top Med Chem. 2009; 9(14): 1317-1334.

[10] Zhu SM, Xiong XX, Zheng YY, et al. Propofol inhibits aquaporin 4 expression through a protein kinase C-dependent pathway in an astrocyte model of cerebral ischemia/reoxygenation. Anesth Analg. 2009; 109(5):1493-1499.

[11] 侯玲玲,曹华,魏国荣,等.人脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究[J].中华血液学杂志,2002(8):415-419.

[12] 王斌,洪小杨,杜江,等.人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性[J].中华实用儿科临床杂志, 2006,21(10):617-619.

[13] Yang Z, Duan H, Mo L, et al. The effect of the dosage of NT-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells. Biomaterials. 2010; 31(18):4846-4854.

[14] 何展文,刘木金,孟哲,等.异体骨髓间充质干细胞对 EAE 大鼠神经再生保护作用的研究[J].中国实用神经疾病杂志,2015,18(4):1-4.

[15] 戴文达,方涛林,李熙雷,等.人骨髓间充质干细胞的分离培养、多向分化与鉴定[J].复旦学报(医学版),2008,35(3): 448-452.

[16] Estécio MR, Gharibyan V, Shen L, et al. LINE-1 hypomethylation in cancer is highly variable and inversely correlated with microsatellite instability. PLoS One. 2007;2(5):e399.

[17] 陈娜,周建平,黄安宁,等.异丙酚对缺血再灌注损伤神经细胞的保护作用[J].军医进修学报,2011,32(12): 1253-1256.

[18] 钟守琳,陈会平,朱志良,等.异丙酚减轻大鼠脑缺血再灌注损伤[J].基础医学与临床,2011,31(7):804-808.

[19] 王士雷,王世瑞,李瑜,等.异丙酚和异氟醚对大鼠全脑缺血再灌注损伤的影响[J].中国临床药理学与治疗学,2006, 11(5):562-564.

[20] 贾鹤龄,冷玉芳,张彬.靶控输注异丙酚对心脏瓣膜置换术患者炎性细胞因子浓度变化的影响[J].兰州大学学报(医学版),2010, 36(1):78-81.

[21] 沈宁,甘小亮,黑子清,等.异丙酚对沙土鼠全脑缺血再灌注后脑保护作用研究[J].中山大学学报(医学科学版),2010, 31(3):354-358.

[22] Zhou QB, Jia Q, Zhang Y, et al. "Effects of baicalin on protease-activated receptor-1 expression and brain injury in a rat model of intracerebral hemorrhage". Chin J Physiol. 2012;55(3):202-209.

[23] Li Q, Lu J, Wang XY.Propofol and remifentanil at moderate and high concentrations affect proliferation and differentiation of neural stem/progenitor cells. Neural Regen Res. 2014;9 (22):2002-2007.

[24] Sahin1 M, Gullu H, Peker K,et al.Does the intrathecal propofol have a neuroprotective effect on spinal cord ischemia? . Neural Regen Res. 2015; 10(11): 1825-1829.

[25] Manaenko A, Sun X, Kim CH, et al. PAR-1 antagonist SCH79797 ameliorates apoptosis following surgical brain injury through inhibition of ASK1-JNK in rats. Neurobiol Dis. 2013;50:13-20.

[26] Chen WF, Lee JJ, Chang CC, et al. Platelet protease-activated receptor (PAR)4, but not PAR1, associated with neutral sphingomyelinase responsible for thrombin-stimulated ceramide-NF-κB signaling in human platelets. Haematologica. 2013;98(5):793-801.

[27] Babu R, Bagley JH, Di C, et al. Thrombin and hemin as central factors in the mechanisms of intracerebral hemorrhage-induced secondary brain injury and as potential targets for intervention. Neurosurg Focus. 2012;32(4):E8.

[28] Mead B, Scheven BA.Mesenchymal stem cell therapy for retinal ganglion cell neuroprotection and axon regeneration. Neural Regen Res. 2015; 10(3): 371-373.

[29] 王华,熊英,母得志.配对免疫球蛋白B抑制新生大鼠缺氧缺血损伤神经元细胞再生的研究[J].中国新生儿科杂志, 2012,27(4):269-273.

[30] Bao X, Wei J, Feng M, et al. Transplantation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after cerebral ischemia in rats. Brain Res. 2011;1367:103-113.

[31] Wang J, Jin H, Hua Y, et al. Role of protease-activated receptor-1 in brain injury after experimental global cerebral ischemia. Stroke. 2012;43(9):2476-2482.

[32] Crigler L, Robey RC, Asawachaicharn A, et al. Human mesenchymal stem cell subpopulations express a variety of neuro-regulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis. Exp Neurol. 2006;198(1):54-64.

引言

脑缺血再灌注损伤病理过程十分复杂，一直为国内外研究的重点。脑缺血再灌注损伤最直接的危害是神经细胞的凋亡和缺血缺氧坏死^[1]，而神经细胞一旦受损恢复极为困难。已有研究显示，脑缺血再灌注损伤与凋亡相关基因的表达调节有关^[2]。脑缺血后可生成大量的氧自由基，增强脑内脂质过氧化反应^[3-4]，同时多种抗氧化物酶类的活性发生改变^[5-6]。丙二醛是膜脂质过氧化最重要的产物之一，其可加剧膜损伤，通过测量其水平可间接说明膜系统受损程度。超氧化物歧化酶是人体内O₂^-的天然消除剂，是人体内自由基的清道夫，因此，测定丙二醛和超氧化物歧化酶的含量被认为是检测体内自由基和过氧化反应的重要方法之一^[7-8]。

研究已证实异丙酚预处理可改善大鼠脑缺血局灶部位损伤^[9]。由于脑组织中耗氧量高且含有丰富的脂类，且异丙酚含有与酚基类自由基清除剂结构类似的丙基酚结构，因此可抑制体内氧化反应，减轻脑缺血的损伤程度^[10]，对脑组织有一定的保护作用^[3]。也有研究认为，异丙酚的脑保护作用与氨基酸有关，其一方面能增强神经元抑制性氨基酸的表达，一方面减少神经元兴奋性氨基酸的释放，降低神经元的兴奋毒性，降低神经元的凋亡，提高神经元的存活^[6]。研究显示，脐血间充质干细胞具有较高分化潜能，可替代受损的神经元，还能促进神经元的再生，并促进造血功能的恢复^[11-12]。对脑缺血损伤大鼠移植间充质干细胞，可以促进其增殖及向神经元的分化^[13]。因此作者推测异丙酚预处理联合脐血间充质干细胞移植可能会提升对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗效果，改善神经再生能力。实验拟对此进行分析。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年4月至2015年7月在河北医科大学动物实验中心完成，历时15个月。

1.3 材料

实验动物：①健康雄性SD大鼠63只，鼠龄2.0-3.0个月，体质量300-400 g。②即将分娩的雌性SD大鼠1只，体质量约350 g。2种大鼠均由河北医科大学动物实验中心提供，许可证号SCXK(冀)20070001。实验动物饲养环境为温度23-27 ℃，湿度50%-70%，颗粒型普通大鼠饲料及消毒无菌水，自由饮水和进食。实验前1 d禁食不禁水。实验符合动物伦理学的要求。

1.4 方法

1.4.1 脐血间充质干细胞的分离与培养 无菌环境下，对足月待分娩雌鼠行剖腹产，取脐血20 mL，放置培养皿中，以预先配置的体积分数15%胎牛血清的DMEM培养液冲洗脐血3次^[14]。无菌注射器抽取含有Hank’s液冲洗2次，制成细胞悬液。1 000 r/min离心12 min，去上清液，加入含有体积分数10%的胎牛血清、1×10⁵ U/L青霉素G钠、100 mg/L硫酸链霉素和0.25 mg/L两性霉素B的DMEM基培养^[15]。常温静置24 h后，贴壁细胞为脐血间充质干细胞，弃除未贴壁的细胞。每2d更换培养液，每6 h观测一次细胞生长情况，生长95%后传代，第4代脐血间充质干细胞用于实验。

1.4.2 实验动物分组及脑缺血再灌注损伤模型的建立将63只大鼠随机等分为3组：模型组、异丙酚组和联合组。所有大鼠均采用内栓线法建立脑缺血再灌注损伤模型。大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，仰卧位固定。取颈正中切口逐层切开，显露胸锁乳突肌，延胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，深部分离暴露颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，以动脉夹夹闭颈内动脉；用头皮针于颈总动脉结扎的远心端刺一小口导入栓线，松开颈内动脉动脉夹，使栓线进入颈内动脉，用缝合线系住栓线。确认无活动性出血后缝合，术后2 h再次打开切口，直视下抽出线栓。

1.4.3 异丙酚的注射及脐血间充质干细胞的移植 异丙酚组大鼠于造模前1 d，腹腔注射100 mg/kg异丙酚。联合组大鼠造模前1 d注射异丙酚(100 mg/kg)，并于造模前经大鼠尾部静脉注射脐血间充质干细胞(2×10⁹ L^-¹) 0.5 mL ^[14]。

1.4.4 神经功能评价 参照Longa等^[16-17]的方法，分别于造模后1，3，7，14，21 d对3组大鼠进行神经系统评分。0分：无神经损伤，大鼠神经功能正常；1分：轻度神经功能缺损，即瘫痪侧前爪不能完全伸展。2分：中度神经功能缺损，行走时大鼠向瘫痪侧倾倒。3分：重度神经功能缺损，行走时大鼠身体向瘫痪侧倾倒。4分：不能自发行走，意识下降。

1.4.5 苏木精-伊红染色 造模后24 h，每组取3只大鼠，断头取脑，制成石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，自来水洗，苏木精染色，自来水洗，体积分数1%盐酸乙醇分化，自来水洗，稀氨水(1%)反蓝，自来水洗，伊红染色，自来水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜观察。

1.4.6 反转录PCR检测survivn基因表达水平 造模后24 h，每组取3只大鼠，断头取脑，取海马组织，按Trizol Total Isolation Reagent说明书提取海马组织总RNA，紫外分光光度仪测定RNA浓度，依据TaKaRa反转录试剂盒说明书半定量RT-PCR的方法合成cDNA。扩增产物需琼脂糖凝胶电泳测定，紫外灯下拍照，并在图像分析系统上扫描密度。PCR所用的引物序列及反应条件如下：Survivn引物序列为：上游引物5’-ACC ACC GCA TCT CTA CAT TCA-3’，下游引物5’-TTC TTG GCT CTT TCT CTG TCC-3’，产物大小286 bp，β-actin：上游引物：5’-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3’，下游引物：5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3’，产物大小305 bp。反应条件为：97 ℃行变性1 min，91 ℃变性30 s、60 ℃退火60 s、72 ℃延伸1 min进行反应，33个循环后，再以72 ℃延伸6 min。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶自动成像及分析系统，取PCR扩增产物进行电泳，电泳结果用凝胶图像分析系统行电泳条带吸光度分析，计算survivn mRNA的表达水平。

1.4.7 血清丙二醛和超氧化物歧化酶含量的检测 造模后3，7 d，异丙酚组和联合组各取5只大鼠，背部固定，于颈动脉取血10 mL，1 500 r/min低温离心5 min，取血清。以硫代巴比妥酸比色法测定血清中丙二醛含量，采用邻苯三酚自氧化法测定血清中超氧化物歧化酶活性^[18]。

1.5 主要观察指标 大鼠脑组织形态、海马中survivn基因表达水平以及血清丙二醛和超氧化物歧化酶含量。

1.6 统计学分析 数据以x(_)±s表示，应用SPSS 19.0软件包对多组结果采用方差分析及t 检验进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脑缺血必然造成脑缺氧，线粒体呼吸链在缺氧环境中电子传递紊乱，黄嘌呤脱氢酶下转变为氧化酶，即细胞内大量生成与病变有重要关系的超氧阴离子、过氧化氢及羟自由基等自由基^[18-19]。这些产物半衰期较短，在体外不易检测，且易与细胞膜上的磷脂和不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，生产丙二醛^[20]。而丙二醛可与磷脂和蛋白质上的氨基发生交联反应，使得膜的流动性变差，破坏细胞形状，损伤细胞功能^[20-21]；但超氧化物歧化酶可促进超氧离子的分解。

实验结果显示模型组中大鼠血清丙二醛含量最高，超氧化物歧化酶活性最弱，而联合组丙二醛含量最低，超氧化物歧化酶活性最强。模型组大鼠海马中神经元破坏最严重，凋亡、死亡及神经元损伤程度最大。联合组和异丙酚组大鼠海马中survivn基因表达水平明显高于模型组，且联合组海马中survivn基因表达水平高于异丙酚组。可以推测，异丙酚的抗氧化作用及脐血间充质干细胞的分化在脑缺血再灌注损伤的治疗中发挥了巨大的作用^[22]。

有研究证实，亲脂性较好的异丙酚，对细胞器膜的磷脂双分子层亲和力较强，能有效减少丙二醛的形成，并提升超氧化物歧化酶的活性^[21^，^23]。也有实验结果显示，异丙酚能够与体内的自由基结合，阻止过氧化脂质和自由基引起的可逆的离子通道开放，防止线粒体内膜溶血磷脂堆积、肿胀和通透性升高^[17^，^24]。有研究证实移植的间充质干细胞可向受损处迁徙，并向神经元、神经胶质细胞分化以替代死亡的宿主细胞，并能与局部剩余的神经元重新关联，恢复神经元回路^[25-28]。具有高分化潜能的间充质干细胞可以激发再生相关基因的表达，促进轴突功能的再生^[29-31]。间充质干细胞移植可促进脑源性神经营养因子、白细胞介素6，7，12等多种细胞因子的分泌^[32]。同时神经功能评分的结果也佐证了脑缺血损伤的大鼠进行异丙酚预处理联合脐血间充质干细胞移植治疗脑缺血再灌注损伤效果最好。

综上，异丙酚联合脐血间充质干细胞移植能更恢复大鼠病灶部分的神经元，并促进其再生。