血管内皮祖细胞改善骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.003

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (14): 1999-2006.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.003

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血管内皮祖细胞改善骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及凋亡

刘竹影¹，陈颖²，刘倩¹，梁源¹，张瑞¹，文艺¹，丁寅¹

1解放军第四军医大学口腔医院正畸科，军事口腔医学国家重点实验室，陕西省西安市 710032；2解放军第四军医大学药学院天然药物学教研室，陕西省西安市 710032

收稿日期:2016-02-17 出版日期:2016-04-01 发布日期:2016-04-01
通讯作者: 丁寅，博士，教授，主任医师，解放军第四军医大学正畸科，军事口腔医学国家重点实验室，陕西省西安市 710032
作者简介:刘竹影，女，1991年生，河南省孟州市人，汉族，2016年解放军第四军医大学毕业，硕士，医师，主要从事口腔正畸临床与基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81170982)

Indirect co-culture with endothelial progenitor cells improves proliferation and apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells of osteoporosis rats

Liu Zhu-ying¹, Chen Ying², Liu Qian¹, Liang Yuan¹, Zhang Rui¹, Wen Yi¹, Ding Yin¹

1State Key Laboratory of Military Stomatology, Department of Orthodontics, School of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; 2Department of Natural Medicines, School of Pharmacy, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Received:2016-02-17 Online:2016-04-01 Published:2016-04-01
Contact: Ding Yin, M.D., Professor, Chief physician, State Key Laboratory of Military Stomatology, Department of Orthodontics, School of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Liu Zhu-ying, Master, Physician, State Key Laboratory of Military Stomatology, Department of Orthodontics, School of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81170982

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

血管内皮祖细胞：1997年Asahara首次报道由外周血获得能分化为血管内皮细胞的前体细胞，此细胞表达CD34和血管内皮细胞生长因子受体2，在体外培养呈典型的长梭形，可形成管腔样结构，能够表达内皮细胞的特异性抗原，在缺血性动物模型中可观察到它们参与血管的生成，故命名为血管内皮祖细胞。研究发现，血管内皮祖细胞在组织工程骨中参与了血管的再生和修复。

Transwell间接共培养：此项技术的特点在于运用一种特殊的共培养工具进行细胞共培养，观察两种细胞的相互作用。该技术关键部分在于杯子底层有一张有通透性的聚碳酸酯膜，这层膜带有微孔，孔径最大为12.0 μm，最小为0.1 μm，使得培养的两细胞不能相互接触，实现非接触性共培养。

背景：研究发现雌激素缺乏骨髓间充质干细胞的活性降低。

目的：观察血管内皮祖细胞对去势骨髓间充质干细胞增殖及凋亡特性的影响。

方法：①选用6周龄健康雌性SD大鼠行双侧卵巢切除术，建立骨质疏松症动物模型，假手术组仅切除卵巢周围等量脂肪组织；②采用密度梯度离心结合差速贴壁法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞；采用密度梯度离心法结合差速贴壁法利用促进内皮细胞生长的条件培养基诱导培养血管内皮祖细胞；③利用Transwell小室建立血管内皮祖细胞、去势骨髓间充质干细胞间接共培养体系，另设置正常骨髓间充质干细胞-骨髓间充质干细胞组，去势骨髓间充质干细胞-骨髓间充质干细胞组；④采用流式细胞术检测血管内皮祖细胞对去势骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响。

结果与结论：①间接共培养第3天，血管内皮祖细胞与去势骨髓间充质干细胞共培养组的S期细胞比例显著大于去势骨髓间充质干细胞组和正常骨髓间充质干细胞组，差异均有显著性意义(P < 0.05)；②间接共培养第10天，血管内皮祖细胞与去势骨髓间充质干细胞共培养组骨髓间充质干细胞凋亡率显著小于去势骨髓间充质干细胞组和正常骨髓间充质干细胞组，差异均有显著性意义(P < 0.05)；③通过血管内皮祖细胞和去势骨髓间充质干细胞间接共培养，发现血管内皮祖细胞可逆转体外去势骨髓间充质干细胞的增殖能力并且抑制其凋亡。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9938-2878(丁寅)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 血管内皮祖细胞, 骨髓间充质干细胞, 绝经后骨质疏松, 去势大鼠骨质疏松模型, 间接共培养, 细胞增殖, 细胞凋亡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that estrogen deficiency causes a reduction in the activity of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).
OBJECTIVE: To explore the effect of endothelial progenitor cells (EPCs) on the BMSCs proliferation and apoptosis ability of osteoporosis rats.
METHODS: Healthy female Sprague-Dawley rats, 6 weeks old, were enrolled and subjected to bilateral ovariectomy to make osteoporosis models. BMSCs and EPCs were isolated using density gradient centrifugation combined with adhesion method, and identified with surface markers, cell proliferation and immunocytochemistry in vitro. We used Transwell inserts to establish EPCs and OVX-BMSCs indirect co-culture system. Control groups were OVX-BMSCs group and sham-BMSCs group in which rats were only subjected to remove the equal amount of fat tissues around the ovary. Flow cytometry was applied to detect BMSCs proliferation and apoptosis ability.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control groups, the results of flow cytometry test showed that the proportion of OVX-BMSCs at S phase was significantly increased at 3 days of indirect co-culture with EPCs and the apoptosis rate was significanty reduced at 10 days of indirect co-culture with EPCs (both P < 0.05). These results suggest that EPCs can promote the proliferation but inhibit the apoptosis of OVX- BMSCs.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Osteoporosis, Postmenopausal, Endothelial Cells, Coculture Techniques, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

刘竹影，陈颖，刘倩，梁源，张瑞，文艺，丁寅. 血管内皮祖细胞改善骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 1999-2006.

Liu Zhu-ying, Chen Ying, Liu Qian, Liang Yuan, Zhang Rui, Wen Yi, Ding Yin. Indirect co-culture with endothelial progenitor cells improves proliferation and apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells of osteoporosis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 1999-2006.

图/表（结果） 11

2.1 实验动物数量分析实验选用雌性SD大鼠20只，分为假手术组和去势组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 去势大鼠骨质疏松模型的建立手术后3个月处死上述两组大鼠，取股骨进行Micro-CT扫描，观察相关指标的变化。去卵巢骨质疏松组骨小梁排列较假手术组稀疏，骨小梁密度减小，间隙增宽(图1)。分析两组大鼠骨组织体积/组织总体积，结果显示假手术组为(64.05±4.31)%，去卵巢骨质疏松组为(35.73±3.67)%，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。以上结果说明，双侧卵巢摘除后构建大鼠骨质疏松模型成功。

2.3 骨髓间充质干细胞鉴定倒置相差显微镜观察原代细胞呈多角形或长梭形，细胞较杂，含有一些成纤维细胞及贴壁的单核细胞，逐渐融合成细胞集落。传代后细胞增殖速度加快，形态均一，为多角形或梭形，呈放射状排列(图3)。细胞诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞分化(图4)。流式细胞仪结果显示细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD90和CD29，几乎不表达造血干细胞表面标志CD34和CD45(图5)。去卵巢骨质疏松组骨髓间充质干细胞和假手术组无明显差异。

2.4 血管内皮祖细胞鉴定倒置相差显微镜显示，原代细胞刚贴壁时呈圆形，随时间延长细胞开始增殖呈多角形或纺锤形。培养第9天，细胞生长更加密集，形成细胞集落，形态由纺锤形变为菱形。培养第12天时，镜下观察细胞呈“铺路石”样结构(图6)。荧光显微镜下显示细胞免疫双荧光染色阳性(图7)。

2.5 血管内皮祖细胞对去势骨髓间充质干细胞增殖的影响血管内皮祖细胞与去势骨髓间充质干细胞间接共培养组的S期细胞(15.11±0.56)%显著大于去势骨髓间充质干细胞组S期细胞(5.45±0.47)%，且大于假手术组S期细胞(8.65±0.32)%，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图8，9。结果说明血管内皮祖细胞可逆转去势骨髓间充质干细胞的活性，增强去势骨髓间充质干细胞的增殖能力。

2.6 血管内皮祖细胞对去势骨髓间充质干细胞凋亡的影响通过流式细胞仪技术检测细胞凋亡率的结果显示，在间接共培养第10天，共培养组骨髓间充质干细胞凋亡率为(1.50±0.36)%，显著小于去势组骨髓间充质干细胞凋亡率(9.03±0.41)%(P < 0.05)，且小于假手术组骨髓间充质干细胞凋亡率(4.83±0.33)%(P < 0.05)，见图10，11，结果说明，血管内皮祖细胞可抑制去势骨髓间充质干细胞的凋亡。

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引言

绝经后骨质疏松是绝经后妇女的常见病、多发病，主要原因是绝经后妇女的卵巢功能减退，雌激素水平下降，导致骨生成和骨吸收的代谢失衡^[1]。雌激素缺乏是绝经后妇女骨质疏松的重要原因，导致牙槽骨吸收加快，牙齿缺失，牙周组织的再生与修复困难^[2-3]。近年来应用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)修复颌骨、牙槽骨缺损的研究已取得较大进展^[4-6]。然而，国内外研究发现，雌激素缺乏的微环境会导致骨髓间充质干细胞凋亡增加以及骨向分化能力下降，单纯骨髓间充质干细胞植入时因缺乏必要的营养维系和良好的局部微环境而导致其存活能力下降。因此，如何提高移植物中骨髓间充质干细胞的存活数量并维持其干细胞特性是干细胞移植修复组织缺损成功的关键。

血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是在胚胎发育过程中，发源于中胚层、发源部位邻近并具有发育和分化为外周血细胞和血管壁细胞的细胞群，具有特异性归巢的能力，在生理或病理条件下，可以动员自外周血，归巢于靶区域^[7]。血管内皮祖细胞可以通过自身的分化、增殖而形成新生血管，无需依赖原有的微血管系统，类似于胚胎期的“血管发生”，因此血管内皮祖细胞对改善局部微循环有独特的优越性^[8]。近年研究证实血管内皮祖细胞具有形成新生血管、促进局部营养支持和改善微环境的功能^[9]。骨的发育与再生能力、骨的愈合与修复都依赖局部微血管的生成，以提供骨组织生长、再生、改建的营养与代谢^[10-12]。去势大鼠由于雌激素缺乏，导致骨髓间充质干细胞的增殖及骨向分化能力下降，加之缺乏必要的营养维系，使骨髓间充质干细胞的凋亡增加，其骨修复能力受到影响。在体外培养环境中，若加入血管内皮祖细胞来逆转去势大鼠骨髓间充质干细胞的干细胞特征，提高去势大鼠牙槽骨缺损的修复效果的推测在理论上是有充分依据的。目前，血管内皮祖细胞对去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性及凋亡的影响尚不明确。

实验通过间接共培养方式探讨血管内皮祖细胞对去势大鼠骨髓间充质干细胞的影响，并对去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖能力及凋亡特性进行检测，为临床骨质疏松患者牙周组织缺损的修复奠定理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外实验，样本观察。

1.2 时间及地点实验于2014年12月至2015年7月在解放军第四军医大学口腔医院颌外创伤实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 6周龄雌性Sprague-Dawley大鼠20只，体质量200 g左右，由解放军第四军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK陕2014-002。

1.3.2 实验试剂 α-MEM培养基、青霉素、链霉素(Hyclone，美国)，Percoll分离液(GE Healthcare，美国)，胎牛血清(杭州四季青公司)，EGM-2 Bulletkit (Lonza，美国)，DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I(Molecular Probes，美国)，Transwell小室(Corning，美国)，Siemens InveonMirco-CT(Siemens公司，德国)，流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)，离心机(Sigma，美国)，倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 去势骨质疏松大鼠动物模型的建立及评估将大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组和去卵巢骨质疏松组。在无菌条件下，经腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，麻醉成功后行双侧腰背部术野剪毛、碘伏消毒、铺手术洞巾。选用背部双侧切口，钝性分离进腹腔，沿输卵管逆行确定卵巢位置后将其切除，结扎残端、依次缝合切口。假手术组仅切除卵巢周围等量脂肪组织。所有动物均在24-28 ℃和通风良好的相同条件下饲养3个月，自由摄水摄食，饲养3个月后处死。无菌条件下取两组大鼠股骨进行micro-CT扫描，扫描条件为电压 80 kV，分辨率19.64 μm，层扫厚度39.28 μm。

1.4.2 骨髓间充质干细胞原代培养及鉴定术后3个月颈椎脱臼法处死上述两组动物，体积分数为75%乙醇浸泡10 min后于无菌条件下分离双侧股骨，剪断骨骺端显露髓腔，用含体积分数15%胎牛血清的α-MEM培养液反复冲洗髓腔至变白为止，获取骨髓悬液，Percoll分离液分离出骨髓单个核细胞，接种于塑料材质的25 cm²培养瓶中，加体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的孵箱中培养。48 h后换液去除未贴壁细胞，以后每3 d换液，待细胞生长至90%时，消化、传代。倒置相差显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型，诱导成骨、成脂分化鉴定骨髓间充质干细胞。

1.4.3 血管内皮祖细胞原代培养及鉴定利用上述方法获取骨髓悬液后，Percoll分离液分离出骨髓单个核细胞，EGM-2 BulletKit内皮细胞条件培养液培养48 h后，收集非贴壁细胞上清，离心(1 000 r/min，5 min)，制成单细胞悬液，EGM-2继续培养，以后每3 d换液，倒置相差显微镜观察细胞形态，并联合细胞Dil-ac-LDL及FITC-UEA-I双荧光染色鉴定血管内皮祖细胞。

1.4.4 建立间接共培养体系取原代培养第7天的血管内皮祖细胞以5×10⁵ L^-¹细胞浓度接种于0.4 µm孔径的Tanswell底膜上，第3代去势骨髓间充质干细胞以相同数量接种于6孔板底，将Tanswell小室放入6孔板中。另设置正常骨髓间充质干细胞-骨髓间充质干细胞组，去势骨髓间充质干细胞-骨髓间充质干细胞组。用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液继续培养，每3 d换液。以下共培养实验中，如无特殊说明，两种细胞均按1︰1的比例接种。

1.4.5 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的细胞周期变化间接共培养第3天，分别消化3组骨髓间充质干细胞，离心，加入1 mL PBS和2 mL无水乙醇固定，制成单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞周期。
1.4.6 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞凋亡率间接共培养第10天，消化3组骨髓间充质干细胞，离心，加入2.5 mL α-MEM培养液，吹匀，制成单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 主要观察指标 ①倒置相差显微镜下观察血管内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞的形态及结构。②间接共培养条件下，应用流式细胞仪检测各组骨髓间充质干细胞的细胞周期。③间接共培养条件下，应用流式细胞仪检测各组骨髓间充质干细胞的凋亡率。

1.6 统计学分析各组实验数据用x(_)±s表示，应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用非配对t 检验。

讨论

骨质疏松症是以骨密度降低及骨组织微结构破坏为特征，增加骨折的易感性，威胁着人类健康^[13]。女性绝经后，血液及组织内雌激素水平降低，骨组织中雌激素受体表达水平也减少，导致骨吸收作用超过骨形成作用，使骨量减少，骨骼密度降低，引起绝经后骨质疏松的发生。骨质疏松不仅增加女性骨折的风险，而且和牙齿缺失及牙槽骨缺损密切相关^[14]，影响患者牙周组织健康，给口腔各学科治疗如牙齿种植、口腔修复及正畸治疗等带来了极大挑战。Cao等^[15]研究发现由于长期的体内雌激素不足，骨髓间充质干细胞表现出较低的增殖率与成骨能力。研究发现，利用正常组织来源的骨髓间充质干细胞修复去势大鼠牙周组织缺损，显示出一定的修复能力^[5]，然而由于局部微环境的影响导致其存活能力下降，效果不理想^[16]，故一些学者将骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞联合培养期望改善去势大鼠骨髓间充质干细胞的活性。

1969年Saville首先建立绝经后骨质疏松大鼠模型，现已成为研究绝经后骨质疏松的经典动物模型^[17-18]。Jee等^[19]认为在12周龄时切除雌性SD大鼠的卵巢，可成功复制出绝经后骨质疏松模型。Wronski等^[20]在切除雌性SD大鼠卵巢12周后，胫骨近端的骨小梁体积明显减小。Li等^[21]切除3月龄SD雌性大鼠卵巢，研究发现在90 d时，股骨的松质骨和皮质骨量明显减小。该项实验中选用12周龄SD雌性大鼠行双侧卵巢切除术，3个月后进行Micro-CT扫描股骨分析相关指标，与假手术组相比，两者差异显著，说明成功建立了骨质疏松大鼠模型。

骨髓间充质干细胞是骨组织工程中修复骨缺损常用的种子细胞。采用密度梯度离心法提取单个核细胞分离培养骨髓间充质干细胞可提高其纯度^[22]，实验验证其具有成骨、成脂的多向分化能力，并且高表达间充质干细胞表面标志，几乎不表达造血干细胞表面标志。

内皮祖细胞是一类来源于骨髓，能在外周血中循环，在生长因子的作用下可分化为内皮细胞的前体细胞^[23]，在出生后血管形成中发挥重要作用^[24]。内皮祖细胞最早由Asahara等^[25]在外周血中获得，体外培养呈长梭形，表达CD34和VEGFR-2。血管内皮祖细胞作为血管内皮细胞的前体细胞具有迟发型高增殖潜能^[26]，并且在VEGF、SDF-1 等趋化因子作用下，血管内皮祖细胞能归巢到缺血组织参与新生血管的形成^[27]。目前对于血管内皮祖细胞的鉴定并无统一标准，可通过血管内皮祖细胞吞噬ac-LDL和UEA-1的内皮细胞及高表达CD133、CD34、VEGFR-2等表面标志来鉴定。实验采用密度梯度离心法结合差速贴壁法，利用内皮细胞特殊培养基诱导培养的细胞符合以上鉴定标准，并且尝试利用间接共培养方式探索血管内皮祖细胞对局部微环境的调节功能能否逆转去势骨髓间充质干细胞的干细胞特性。

细胞共培养分为直接共培养和间接共培养。Xu等^[28]研究发现，血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞在直接共培养条件下通过TACE/TNF-α信号传导促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化，而间接共培养组并未见表达内皮细胞标记物的骨髓间充质干细胞增多。Loibl等^[29]也报道了血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞直接共培养后，骨髓间充质干细胞表达CD146、NG2和α-SMA升高，说明可诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化。因此，此项研究采用血管内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞间接共培养的方式，维持了骨髓间充质干细胞的未分化状态，利用Transwell小室使两种细胞不能直接接触，但细胞分泌的各种因子可互通，借以观察细胞间的相互作用。

综上所述，通过血管内皮祖细胞和去势骨髓间充质干细胞间接共培养，发现血管内皮祖细胞可逆转体外去势骨髓间充质干细胞的增殖能力并且抑制其凋亡，但血管内皮祖细胞对去势骨髓间充质干细胞分化的影响及两种细胞之间的具体作用机制还需进一步的研究，相信随着研究的深入，可为临床骨质疏松患者牙周组织缺损修复奠定理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

血管内皮祖细胞改善骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及凋亡

Indirect co-culture with endothelial progenitor cells improves proliferation and apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells of osteoporosis rats

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