HLA匹配角膜缘干细胞联合羊膜移植修复翼状胬肉

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗翼状胬肉是眼科医生治疗的新理念，该方法治疗后并发症少、康复快、复发率低，尤其是能减少移植排斥反应等已被广泛接受。
目的：探讨HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗翼状胬肉疗效。
方法：选取2013年3月1日至2014年4月30日行HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗的翼状胬肉患者47例(47眼)作为试验组；回顾性分析2010年3月1日至2012年12月1日采用单纯翼状胬肉切除方法治疗的翼状胬肉患者40例(47眼)作为对照组，对两组患者治愈和复发情况进行比较。
结果与结论：试验组47例，全部顺利完成治疗，无并发症，其中1例切口感染，特殊对症治疗后均已好转出院，全部患者均无移植排斥反应。试验组治愈45眼，复发2眼，复发率为4.3%。对照组47眼中治愈32眼，复发15眼，复发率31.9%。结果表明HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗翼状胬肉并发症少、复发率低，是治疗翼状胬肉一种行之有效的方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 角膜缘干细胞, HLA相合移植, 羊膜移植, 翼状胬肉

Abstract:

BACKGROUND: Co-transplantation of HLA-matched limbal stem cells and amniotic membrane is a new concept for the treatment of pterygium, which is characterized as few complications, fast recovery, and low relapse rate. This treatment has been widely used because of reduced rejections.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of HLA-matched limbal stem cells and amniotic membrane co-transplantation in the treatment of pterygium.
METHODS: Forty-seven patients with pterygium (47 eyes) who underwent the co-transplantation of HLA-matched limbal stem cells and amniotic membrane from March 1, 2013 to April 30, 2014 were enrolled as test group. Another 40 patients with pterygium (47 eyes) who received traditional surgical method acted as control group. Therapeutic effectiveness and relapse were compared between the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: The 47 cases in the test group were successfully treated with no complications and rejections, and only one case suffered from incision infection but discharged from hospital after symptomatic treatment. After treatment, pterygium relapsed in 2 of 47 eyes in the test group and 15 of 47 eyes in the control group, and the relapse rates were 4.3% and 31.9%, respectively. Results from this study show that the co-transplantation of HLA-matched limbal stem cells and amniotic membrane for treatment of pterygium has fewer complications and lower relapse rate, which is an effective method for the treatment of pterygium.

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Key words: Pterygium, Amnion, Limbus Corneae, Stem Cells

中图分类号:

R394.2

杨洁，张金莎，樱峰. HLA匹配角膜缘干细胞联合羊膜移植修复翼状胬肉[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 934-939.

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图/表（结果） 3

2.1 参与者数量分析试验组患者随访6-12个月，平均8个月，失访2例，实际随访率95.7%(45/47)，电话随访率为89.4%(42/47)。对照组患者随访6-12个月，平均9个月，失访6例，实际随访率87.2%(41/47)，电话随访率为93.6%(44/47)。
2.2 两组各项基本资料两组患者在年龄、性别、胬肉侵入角膜长度及宽度、胬肉总面积之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性，见表1。
2.3 两组手术时间、住院时间、治疗成功率两组手术时间、平均住院时间[19]比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。两组各47例患者的翼状胬肉全部清除。试验组46例患者治疗后恢复良好，于治疗后5-7 d出院，1例切口感染

患者治疗前白细胞数大于22×109 L-1，中性分叶核粒细胞比率大于91%，治疗后及时进行切口分泌物细菌培养等后针对性应用抗生素等特殊对症治疗后均已好转出院。对照组治疗过程顺利，治疗后恢复良好，3-5 d出院，无治疗失败及并发症患者。

2.4 两组患者复发情况、矫正视力对照组47眼中有15眼复发，复发率31.9%，治愈率68.1%。试验组47眼中有2眼复发，复发率为4.3%，治愈率为95.7%，经统计学分析，两组差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。
2.5 角膜上皮愈合时间和移植片愈合时间试验组角膜上皮愈合时间为(4.75±1.24) d，明显短于对照组(6.37± 1.13) d，差异有显著性意义(P < 0.05)。试验组移植片愈合时间为(6.34±2.11) d，对照组为(8.29±1.49) d，差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.6 不良反应 HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗2个月后，部分患者有干眼症状，对症治疗半年后症状消失，考虑为角膜缘干细胞在半年后与受体融合良好并发挥其生理作用。其中1例出现移植排异反应者应用免疫抑制剂后症状消失。
2.7 典型病例分析
典型病例1：47岁，左眼翼状胬肉10余年，视力：左眼4.3，矫正不应，右眼5.0，睑裂部球结膜充血、肥厚，可见三角形隆起组织，其尖端指向角膜，侵入角膜约 6.8 mm，遮盖全部瞳孔区，行HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗(图4)。
典型病例2：58岁，左眼翼状胬肉8余年，视力：左眼4.5，矫正4.6，右眼4.9，内外眦部球结膜充血、肥厚，可见鼻、颞侧均有三角形隆起组织，其尖端指向角膜，胬肉分别侵入角膜约2 mm、2.5 mm，鼻侧未达瞳孔区，颞侧接近瞳孔缘，行HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗(图5)。

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引言

材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

设计：非同期病例对照观察。

时间及地点：于2010年3月1日至2014年4月30日在新疆医科大学第二附属医院完成。

对象：

试验组：选取2013年3月1日至2014年4月30日行HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗的翼状胬肉患者47例(47眼)，其中男26例(26眼)，女性21例(21眼)；年龄47-79岁，平均(56.7±5.9)岁；胬肉侵入角膜长度0.28-5.96 mm，平均(2.21±1.42) mm，宽度1.53-8.62 mm，平均(3.37± 1.43) mm；总面积(1.9-21.3) mm²，平均(6.8±3.5) mm²，翼状胬肉在鼻侧36例，在颞侧及鼻颞侧者11例。

纳入标准：①原发性单眼或双眼翼状胬肉。②无其他眼表疾病，如沙眼、结膜炎、睑缘炎等。③无糖尿病等全身免疫性疾病。④无其他眼部手术史。

排除标准：①复发性翼状胬肉。②有先天性或者后天性角膜缘干细胞缺失，如角膜缘干细胞缺乏疾病、眼部各种物理性或者化学性烧伤。③合并有其他结膜退行性病变者。④患有青光眼等其他手术禁忌者。

对照组：回顾性分析2010年3月1日至2012年12月1日采用单纯翼状胬肉切除治疗的翼状胬肉患者40例(47眼)，其中男15例(17眼)，女25例(30眼)；年龄45-73岁，平均(53.8±4.6)岁；翼状胬肉均在鼻侧，全部病例内侧胬肉头部侵入角膜缘内2 mm以上，胬肉侵入角膜长度2.04-5.68 mm，平均(3.47±1.42) mm，宽度1.83-7.46 mm，平均(2.97±1.54) mm；总面积(2.1-22.6) mm²，平均(7.3±2.59) mm²。

纳入标准：①符合翼状胬肉《眼科学》分级标准^[8]。②所有患者完成血、尿等术前常规检查，排除手术禁忌者。③患者年龄为30-75岁。④翼状胬肉均在鼻侧。

排除标准：①结膜急性炎症及慢性泪囊炎患者。②年龄低于10岁或高于75岁者。③合并有严重的脏器功能障碍者，如心、脑、肺等疾病者。④未行规律用药且临床资料收集不全者。

两组患者年龄、性别、胬肉大小比较差异无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性。

材料：

生物羊膜：治疗所用生物羊膜均为江西瑞济生物工程技术有限公司生产，可根据需要选择不同大小的规格，该羊膜已用⁶⁰Co辐照灭菌，发生病原污染的风险几乎不存在，拆袋后用无菌生理盐水浸泡使羊膜复水^[9]，羊膜片的羊膜面朝上，基底面为与眼表接触面，用此面与眼表相贴缝合伤口(图1)。

HLA匹配的角膜缘干细胞：①角膜缘干细胞分离准备：在无菌条件下取自配型成功者的新鲜角膜，取眼下方角膜缘上皮组织2 mm×2 mm，取材时尽量不连带筋膜下结膜组织，每个组织剪成1 mm×1 mm大小4个组织块。②将切取好的组织片用PBS清洗3次后加入完全培养基中(含体积分数为20%胎牛血清、青霉素、链霉素的DMEM/F12培养液)，送入超净室置于37 ℃温室培养箱进行体外培养。③在倒置显微镜下观察培养细胞体外生长的形态，培养2 d后如果有细胞增长进行首次换液，培养五六天后对培养出的细胞进行鉴定(图2)。

Schermer等^[10]首先发现角膜特异性分化蛋白K3存在于整个角膜上皮以及角膜缘上皮基底层，基底层细胞缺乏分化表型，分化最低的细胞即为干细胞。采用角蛋白K3的单克隆抗体AE-5染色免疫组化鉴定角膜缘干细胞，染色阳性细胞核呈深蓝色或褐色，细胞质不着色。图3可见多数细胞染色呈阳性，少数细胞染色呈阴性，即为角膜缘干细胞。

方法：

治疗前处理：常规清洗结膜囊，消毒眼睑及附近皮肤，术前10 min盐酸丙美卡因表面麻醉2次，所有操作均在手术显微镜下进行。

试验组治疗方法：

供者角膜缘干细胞的配型和获取：供者角膜缘干细胞取自患者直系亲属，在移植前供受者之间进行组织配型实验，利用单抗法及DNA检测法检测HLA抗原，用此法进行角膜缘干细胞的配型。将培养14 d后的角膜缘干细胞以羊膜为载体经消化酶消化后继续培养，形成增殖能力高、多层的移植片，将移植片放入-196 ℃液氮灌内长期保存。手术前将其取出置于40 ℃恒温水中进行快速复温处理，用20%的人血白蛋白冲洗，无菌保存后放入冰壶内送往手术室^[11]。

受者胬肉切除和角膜缘干细胞联合羊膜移植：2%的利多卡因5 mL加0.1 mL肾上腺素混合充分后行翼状胬肉局

部浸润麻醉，根据病灶大小，暴露2 mm宽的巩膜及角膜缘组织片，板层切除角膜表面不正常上皮、纤维血管翳、角膜表面瘢痕，使角膜创面平滑，避免角膜实质层切除。参照Tsubota等^[12]报道，将生物羊膜剪成适当方块，经无菌生理盐水复水后贮存于无菌瓶内。根据病灶范围选取羊膜片，将修剪后的生物羊膜片羊膜上皮面朝上覆盖于整个角膜及角膜缘创面，用10-0尼龙线将羊膜在角膜缘侧间断缝合，8-0可吸收缝线间断缝合固定于角膜缘后4.0-5.0 mm巩膜浅层。确定匹配的供受者后，将以羊膜为载体经消化酶消化后继续培养的形成增殖能力高、多层的移植片进行复温、冲洗等处理，将移植片上皮面朝上置于术眼相应部位角膜缘处用10-0尼龙线在角膜缘侧及巩膜侧间断缝合，薇乔用于结膜线圈缝合^[13]。

对照组治疗方法：显微镜下予2%利多卡因5 mL+ 0.1 mL肾上腺素自胬肉头部作结膜下局部浸润麻醉，予棉签按压扩散利多卡因液，帮助分离球结膜，提起胬肉头部，充分分离胬肉与球结膜，用有齿镊在胬肉头部的侧方轻提起胬肉头部组织，保持一定张力。提起胬肉的头部钝性分离胬肉与巩膜面至半月皱襞，距角膜缘2 mm处弧形剪开球结膜，切除胬肉，小心操作避免损伤眼肌。予眼科显微镊撕除角膜残留胬肉组织，角膜缘处予尖刀清刮干净，巩膜面烧灼止血，平衡液充分冲洗，8-0尼龙线缝合球结膜固定(带浅层巩膜面)。

治疗后处理：两组患者均从治疗后次日开始每日进行伤口处常规眼科换药，局部点抗生素眼液，结膜囊涂红霉素眼膏后加压包扎。裂隙灯检查角膜上皮、组织浸润及伤口愈合情况及植片情况，待愈合后开放使用双氯芬酸钠及妥布霉素滴眼液滴眼，可适当给予促上皮生长的药物，对照组治疗后１周拆线，试验组治疗后2周拆线^[14]。

疗效评定标准：治疗后的前2周每周来院复诊，2周后每月来院复诊，平均6个月，复诊时常规行视力、裂隙灯及角膜散光度等检查^[15]。

痊愈标准^[16]：术区结膜平整无充血，角膜上皮愈合良好，表面光滑且基本透明，角膜及球结膜无新生血管和结膜下组织增生。

复发标准：在原切除部位，再次发生巩膜表面的结膜及结膜下纤维结缔组织肥厚和血管增生^[17]，纤维血管及增生组织侵入角膜缘内超过1 mm^[18]。

主要观察指标：①患者异物感、疼痛、眼红等临床症状的改善情况。②角膜创面愈合情况：裂隙灯检查荧光素染色阴性为角膜创面愈合。③胬肉复发及新生血管出现情况。

统计学分析：应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，对获得的临床数据进行统计学描述，角膜上皮愈合时间及移植片愈合时间用x(_)±s表示，胬肉复发率比较用卡方检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

翼状胬肉是眼科常见病和多发病，是一种慢性炎症性病变，单眼或双眼受犯，为睑裂部球结膜与角膜上一种赘生组织，侵犯角膜后日渐增大，严重影响视力。该病的发生可能与慢性结膜炎症、风尘、长期阳光光线刺激所引起的结膜变性增厚所引起^[20]。手术治疗方法及优缺点如下：①翼状胬肉单纯切除适应于翼状胬肉侵入角膜较多，威胁患眼视功能者，此种手术方法操作亦较简单，手术时间相对较短，但易复发^[21]。②翼状胬肉切除联合游离结膜瓣移植适应于翼状胬肉较大且较充血肥厚、生长较快者，此手术方法操作相对较复杂，并有一定难度，且用于移植的结膜瓣特别要预防正反面颠倒，但治疗效果较好，复发率相对较低^[22]。③翼状胬肉切除及带蒂结膜瓣移植方法亦适用于胬肉较肥厚充血、生长较快者。此法不会出现结膜瓣被反转，且血液供应好，被移植的结膜生长愈合较快。缺点是结膜被牵拉移位时可能有一定张力，故缝合伤口时应良好对位以免结膜伤口裂开^[23]。

羊膜供体材料已应用于外科移植手术中^[24]，1940年Roth用羊膜修补损伤的结膜^[25]，Kim和Tseng在1995年把羊膜运用于兔角膜重建并取得成功后，人们开始对羊膜的生物学特性有了一个全新的、深入的认识^[26]，羊膜作为一种新型生物材料，越来越受到眼科工作者的青睐，因其含有各种生长因子和细胞因子^[27]，具有抗炎、抑制增殖、营养神经、抑制血管化等作用在眼表重建用途中取得良好的临床效果^[28]，长入羊膜表面的上皮细胞可减少纤维母细胞及瘢痕增生的形成^[29]，在眼科的临床应用亦越来越广泛、成熟。

角膜缘干细胞具有细胞更新和组织再生能力，主要分布于上下角膜缘，具有不断分裂增生，能够良好维持眼表平衡等特点，是角膜上皮再生的来源^[30]。将干细胞移植到创面角膜缘，干细胞就会向角膜内增生、延伸、分化为上皮细胞，覆盖角膜创面，同时能够阻止异常组织和浅层新生血管侵入角膜，有效防止翼状胬肉的复发^[31]。异源供体的同种异体角膜缘移植已被证明是治疗角膜表面病变有效和安全的方法，角膜缘干细胞具有高度增生和分化程度低等特点^[32]，可重建角膜上皮与结膜上皮之间屏障，使其保持动态平衡，当角膜缘严重受损(角膜缘干细胞缺乏)，结膜上皮取代角膜上皮，导致显著视觉恶化。自体角膜缘干细胞移植在1989年被第一次描述治疗翼状胬肉^[33]，近些年使用同种异体角膜缘移植(LAT)。关于移植重要问题是在大多数的情况下，供者与受者之间HLA不相合，因此它需要延长使用免疫抑制剂的时间。本研究使用匹配HLA角膜缘干细胞移植，有效防止了角膜移植后的排斥反应。

一项随机对照研究显示^[34]：HLA匹配组显示出免疫排斥反应较对照组明显减少(P=0.005)，治疗后5年复发率具有明显差异(3%与74%，P < 0.05)；但手术时间较对照组明显延长(P=0.003)。本研究结果显示：试验组和对照组各47例患者的翼状胬肉全部清除，其中45例患者治疗后恢复良好，于治疗后5-7 d出院。1例伤口感染患者治疗后及时进行切口分泌物细菌培养，针对性应用敏感抗生素等特殊对症治疗后均已好转出院，其中2眼复发，复发率为4.3%，治愈率为95.7%。传统手术切除组47眼中有15眼复发，复发率31.9%，治愈率68.1%。试验组与对照组相比愈合时间差异有显著性意义(P < 0.05)，角膜缘干细胞移植患者较传统手术患者恢复时间短，可能与干细胞移植提供的是具有高成长及修复能力的细胞环境有关^[35]。

据近些年国内外文献报道研究，未切除干净的结膜下增生血管纤维组织是复发的关键因素^[36]。本研究的HLA匹配的角膜缘干细胞联合羊膜移植具有降低排斥反应，减少复发等优势，本试验较传统手术治愈成功率高，复发率低，恢复时间快。随着医疗技术的发展，操作技能的提高和经验的积累，此治疗方法会有更加广阔的应用前景。治疗后积极针对性控制感染，改善全身状况，提高营养状态等阻断病理的连锁反应可显著减少并发症的发生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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