携带人端粒酶反转录酶基因脐血间充质干细胞移植治疗肺动脉高压

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：保护机体肺血管的内皮细胞，是降低肺循环压力，预防肺动脉高压的重要环节。
目的：观察携带人端粒酶反转录酶基因的脐血间充质干细胞移植对大鼠肺动脉高压的治疗作用。
方法：体外进行脐血间充质干细胞的培养及纯化，在腺病毒介导下使人端粒酶反转录酶基因成功导入脐血间充质干细胞。将60只SD大鼠随机分成3组：肺动脉高压组、空腺病毒组、腺病毒转染组，每组20只，腹腔注射野百合碱进行肺动脉高压模型复制后，于颈内静脉分别注射1 mL的伊戈尔低糖培养基(L-DBEB)，1 mL (1.5×1010 L-1)脐血间充质干细胞悬液，1 mL(1.5×1010 L-1)腺病毒介导下人端粒酶反转录酶基因转染的脐血间充质干细胞悬液。移植21 d后检测各组大鼠血流动力学水平、血浆内皮素1水平以及右心室的肥大指数。
结果与结论：各组大鼠动脉血压差异无显著性意义(P > 0.05)；与肺动脉高压组及空腺病毒组比较，腺病毒转染组大鼠肺动脉收缩期压力、平均肺动脉压均降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；腺病毒转染组大鼠右心室肥大指数与肺动脉高压组及空腺病毒组相比较，差异均无显著性意义(P > 0.05)；腺病毒转染组大鼠血浆内皮素1水平明显低于肺动脉高压组及空腺病毒组，差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明携带人端粒酶反转录酶基因的脐血间充质干细胞移植后，能够改善大鼠机体血流动力学异常状态，还可以保护机体血管内皮细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 肺动脉高压, 内皮素1, 血流动力学, 脐血间充质干细胞, 人端粒酶反转录酶

Abstract:

BACKGROUND: To protect the pulmonary vascular endothelial cells in the body is an important part to reduce pulmonary circulation pressure and prevent pulmonary hypertension.
OBJECTIVE: To observe the therapeutic efficacy of umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation carrying human telomerase reverse transcriptase (hTERT) in the treatment of pulmonary hypertension in rats.
METHODS: Umbilical cord blood mesenchymal stem cells were cultured, purified and transfected with adenovirus carrying hTERT gene. Sixty Sprague-Dawley male rats were randomly divided into model group, blank adenovirus group, adenoviral delivery group, with 20 rats in each group. Then, the rats were respectively injected via the jugular vein with 1 mL L-DBEB, 1 mL umbilical cord blood mesenchymal stem cell suspension (1.5×1010/L), and 1 mL hTERT-transfected umbilical cord blood mesenchymal stem cell suspension (1.5×1010/L) after models of pulmonary hypertension were established via intraperitoneal injection of monocrotaline. After 21 days of transplantation, hemodynamic changes, plasma endothelin 1 levels and the hypertrophy index of the right ventricle were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no difference in arterial blood pressure among the three groups
(P < 0.05). In the adenoviral delivery group, the systolic pressure of the pulmonary artery, mean pulmonary artery pressure and plasma endothelin 1 level decreased significantly as compared with the model group, blank adenovirus group (P < 0.05); but no difference was found in the hypertrophy index of the right ventricle (P > 0.05). These findings indicate that umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation carrying hTERT gene can improve the hemodynamic abnormalities in the body and also protect vascular endothelial cells in the body.

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Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Hypertension, Pulmonary, Hemodynamics

中图分类号:

R394.2

徐英. 携带人端粒酶反转录酶基因脐血间充质干细胞移植治疗肺动脉高压[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 923-927.

Xu Ying. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells carrying human telomerase reverse transcriptase for pulmonary arterial hypertension[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 923-927.

图/表（结果） 3

2.1 脐血间充质干细胞形态观察培养3 d后，更换培养液弃去未贴壁的细胞后继续培养；四五天以后，贴壁细胞显著增多，细胞呈长梭形或多角形，且可见有丝分裂，少量细胞呈单个或几个细胞的克隆，有粗大突起伸出，形态呈单一的长梭形，胞体中央膨大(图1A)；培养八九天后，细胞铺满培养瓶的底面，出现大量的贴壁细胞，以间充质细胞为主，成漩涡状生长，漩涡中心的细胞为复层生长，周围大部分细胞胞体呈单层的漩涡状或辐射状(图1B)。流式细胞仪检测结果显示脐血间充质干细胞均一性好，脐血间充质干细胞免疫表型鉴定贴壁细胞均高表达CD29、CD49、CD90、CD105(图2)。

2.2 RT-PCR产物电泳鉴定结果以腺病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染后，腺病毒转染组脐血间充质干细胞检测到人端粒酶反转录酶mRNA表达，对照组、空腺病毒组未检测到人端粒酶反转录酶mRNA表达，表明人端粒酶反转录酶基因已稳定表达入脐血间充质干细胞的基因组中，见图3。

2.3 实验动物数量分析参加实验SD大鼠60只，均进入结果分析，中途无脱落。

2.4 各组大鼠血流动力学水平变化治疗3周后，经多导生理记录仪记录大鼠全身动脉血压(BP)、肺动脉收缩期压力(PASP)及平均肺动脉压(mPAP)。各组大鼠的动脉血压在80-110 mm Hg之间波动，组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；与肺动脉高压组及空腺病毒组比较，腺病毒转染组大鼠肺动脉收缩期压力、平均肺动脉压均降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.5 各组大鼠右心室肥大指数比较腺病毒转染组大鼠右心室肥大指数为42.101 0±6.961 6，与肺动脉高压组(46.759 0±7.142 6)及空腺病毒组(46.651 0±10.321 2)相比较，差异均无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 各组血浆内皮素1水平比较腺病毒转染组大鼠的血浆内皮素1水平为(21.763 7±6.327 8) ng/L，明显低于肺动脉高压组(30.273 0±3.303 8)ng/L及空腺病毒组 (31.748 0±6.448 1) ng/L，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年1月至2014年10月在天津医科大学完成。

材料：

实验动物：健康雄性成年SD大鼠60只，体质量250-300 g，由天津医科大学实验动物中心提供。

脐血标本：经产妇同意，采集天津市津南区咸水沽医院产科健康分娩新生儿脐血，标本采集方法符合伦理学要求。

携带人端粒酶反转录酶基因的脐血间充质干细胞移植治疗大鼠肺动脉高压实验所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
野百合碱	美国Sigma 公司
L-DBEB培养基、胎牛血清	杭州吉诺生物公司
胰蛋白酶/EDTA	美国 Hyclone 公司
空腺病毒的载体、腺病毒载体	中国医学科学院
免疫试剂盒	杭州博日公司
二氧化碳培养箱	美国Invitrogen公司
T25培养瓶	Corning公司
流式细胞仪(TPICS XL-4)	Beckman 公司

实验方法：

脐血间充质干细胞的培养及鉴定：标本在采集后3 h内进行分离，脐血平均容积为50-100 mL，将脐血与Hank’s液以1∶1稀释。取数个无菌离心管，先加入密度为1.077 g/cm³的淋巴细胞分离液，再以1∶2的比例加入稀释后的脐血，将抗凝血装于50 mL无菌离心管中，2 500 r/min离心20 min，保持液面分界状态进行离心，小心吸取中间白膜层，转移至另一个50 mL无菌离心管中，PBS洗涤2次，彻底弃上清。分离单个核细胞后，将细胞重悬于含体积分数为15%胎牛血清、5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养液中，以1.0×10⁶ L^-¹细胞浓度接种于T25培养瓶中，置37 ℃、体积分数为5% CO₂饱和湿度培养箱中培养。3 d后进行第1次换液，当细胞生长至75%-85%融合时，选用0.125%的胰酶按1∶3比例消化传代，传代后的细胞标记为第1代。根据细胞生长状况每三四天换液1次，当细胞生长达到70%-80%融合时，重复上述操作，不易洗脱的细胞弃去即可。

腺病毒介导下实施人端粒酶反转录酶基因转染：采用腺病毒介导的方法进行人端粒酶反转录酶基因转染。第4代脐血间充质干细胞生长融合率达到80%，弃掉上清液，并置无血清培养基中培养24 h后按感染倍数为10⁵加入携带人端粒酶反转录酶基因的腺病毒载体(Ad-hTERT) 200 μL，使其彻底覆盖细胞培养面积，在37 ℃恒温下孵育2 h，之后分别加入适量胎牛血清和L-DMEM培养基，按常规贴壁细胞继续培育1周后进行下列实验，检测前3 d勿更换细胞培养液。空载病毒组在同等条件下进行空载病毒转染，对照组为同等培养条件下不进行转染的正常脐血间充质干细胞。

反转录-聚合酶链反应：应用Trizol(Takara公司)试剂说明书介绍的方法提取各组细胞的总RNA，RNA的含量应用紫外分光光度计测定，取5 μL总RNA，在B-BLV反转录酶作用下进行反转录反应。人端粒酶反转录酶基因：上游引物为5’-CTG AAG TGT CAC AGC CTG TTT-3’，下游引物为5’-CAC ACA TGC GTG AAA CCT GTA-3’，产物大小 111 bp；β-actin上游引物为5’-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3’，下游引物为5’-CTC AGC CTT GAC TGT GCC-3’，产物大小151 bp；PCR反应条件：94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循环32周期，最后72 ℃延伸7 min。每一反应重复3次。取5 mL的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离。电泳后置GDSS000凝胶自动成像仪上拍照提取图像进行分析，以人端粒酶反转录酶与β-actin条带的灰度比值作为扩增产物的相对表达量。

野百合碱诱导肺动脉高压模型制备：将60只雄性SD大鼠随机分成3组：肺动脉高压组、空腺病毒组、腺病毒转染组，每组20只。将3组大鼠一次性腹腔注射野百合碱 60 mg/kg，21 d后观察大鼠的食欲、行为等生活习性，并通过右心导管测定肺动脉压力，平均肺动脉压>35 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)为造模成功。

细胞移植：3组大鼠分别进行肺动脉高压模型复制后，肺动脉高压组于颈内静脉注射1 mL的伊戈尔低糖培养基(L-DBEB)，空腺病毒组于颈内静脉注射1.5×10¹⁰ L^-¹空载病毒转染的脐血间充质干细胞悬液1 mL，腺病毒转染组于颈内静脉注射移植1.5×10¹⁰ L^-¹腺病毒介导下人端粒酶反转录酶基因转染的脐血间充质干细胞悬液1 mL。

主要观察指标：移植21 d后检测各组大鼠的血流动力学水平、血浆内皮素1水平以及右心室的肥大指数。

统计学分析：选择SASS 19.0软件对数据予以统计处理，计量资料以x(_)±s表示，采用t 检验方法进行数据比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

肺动脉高压是一类以血管重建为特征、以机体肺血管的阻力持续增高为表现的一种肺血管恶性增生性综合征^[14-16]，肺血管内皮细胞在肺动脉高压血管结构重建中发挥着极为重要的作用^[17-18]。肺血管内皮细胞的损伤和功能障碍被认为是肺动脉高压的触发点^[19]。肺血管内皮细胞作为血管的内衬，担负着保持细胞形态、维持血液流动状态、选择性通透和屏障等功能。肺血管的内皮细胞受损、局部或全身炎症反应导致血管收缩，机体肺血管床数量减少，平滑肌细胞和外膜增厚，最终引起肺小动脉的重构，引发血栓形成和肺循环的阻力呈持续升高^[20-22]。所以，保护机体肺血管的内皮细胞，是降低肺循环压力，预防肺动脉高压的重要环节^[23]。

目前组织工程的发展为人类征服多种严重疾病开辟了新的途径和希望^[24]，干细胞作为组织工程的种子细胞进行移植是肺动脉高压治疗中相当有前景的方法^[25-27]，脐血间充质干细胞含有丰富的干细胞和祖细胞，利于损伤部位的血管重建和血运改善，可发挥辅助修复的功能^[28-30]。脐血间充质干细胞具有多向分化潜能，其来源丰富，采集方便，与骨髓间充质干细胞相比扩增能力更强，取材安全创伤小，它的应用不涉及伦理学问题，且同种异体移植无免疫排斥的限制，有望成为组织工程种子细胞的重要来源^[31-33]。很多实验证实，脐血间充质干细胞移植可对多种疾病产生疗效^[34-36]，应用脐血间充质干细胞对肺动脉高压进行治疗能够改善机体血流动力学异常状态。

本实验以野百合碱诱发的肺动脉高压大鼠模型为研究对象，移植携带人端粒酶反转录酶基因的脐血间充质干细胞，结果显示经3周治疗后，各组大鼠动脉血压差异无显著性意义(P > 0.05)；与肺动脉高压组及空腺病毒组比较，腺病毒转染组大鼠肺动脉收缩期压力、平均肺动脉压均降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；腺病毒转染组大鼠右心室肥大指数与肺动脉高压组及空腺病毒组相比较，差异均无显著性意义(P > 0.05)；腺病毒转染组大鼠血浆内皮素1水平明显低于肺动脉高压组及空腺病毒组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

综上所述，将携带人端粒酶基反转录酶基因的脐血间充质干细胞进行移植治疗，能够显著降低肺动脉收缩期压力、平均肺动脉压，同时亦能降低血浆中的内皮素1水平，还可以保护机体血管的内皮细胞，并拮抗血管的收缩。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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