无血清悬浮分离培养法分离、培养、鉴定脊髓源性神经干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.022

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (50): 8161-8166.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.022

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无血清悬浮分离培养法分离、培养、鉴定脊髓源性神经干细胞

李军，徐大波，付强，刘彦斌

解放军第二军医大学附属长海医院脊柱外科，上海市 200433

收稿日期:2015-10-26 出版日期:2015-12-03 发布日期:2015-12-03
通讯作者: 付强，副主任医师，副教授，解放军第二军医大学附属长海医院脊柱外科，上海市 200433
作者简介:李军，1988年生，山东省淄博市人，解放军第二军医大学在读硕士，主要从事脊柱外科方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31371011)，项目名称：组织特异性仿生微电流场构建及其对脊髓损伤后内源性神经干细胞的调控作用

Spinal cord-derived neural stem cells cultured by serum-free suspension method: separation, cultivation and identification

Li Jun, Xu Da-bo, Fu Qiang, Liu Yan-bin

Department of Orthopedic Surgery, the Affiliated Changhai Hospital of the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

Received:2015-10-26 Online:2015-12-03 Published:2015-12-03
Contact: Fu Qiang, Associate chief physician, Associate professor, Department of Orthopedic Surgery, the Affiliated Changhai Hospital of the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
About author:Li Jun, Studying for master’s degree, Department of Orthopedic Surgery, the Affiliated Changhai Hospital of the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31371011

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前临床上尚未发现完全治愈脊髓损伤，使其达到结构及功能恢复的治疗方法。已有的神经营养因子治疗方法促进神经细胞再生的效果有限，而干细胞移植治疗可能是现阶段修复脊髓损伤的有效方法之一。
目的：无血清悬浮分离培养法培养胎鼠脊髓源性神经干细胞，采用形态学、免疫荧光技术和多向分化能力进行神经干细胞鉴定。
方法：应用悬浮分离培养法，培养纯化孕13.5 d C57BL/6胎鼠的脊髓源性神经干细胞。倒置显微镜观察细胞形态学变化；CCK-8法检测细胞的增殖能力。免疫荧光技术检测Nestin和Sox2表达；使用自然分化法验证第4代脊髓源性神经干细胞多向分化特性，明确其分化能力。
结果与结论：采用无血清悬浮分离培养法可以顺利获取脊髓源性神经干细胞。培养的脊髓源性神经干细胞增殖活性良好，高表达Nestin和Sox2，且两种标记物与DAPI核染高度均匀吻合，说明细胞纯度高。进一步诱导分化显示，细胞可以向GFAP和Tuj1阳性细胞分化，证明脊髓源性神经干细胞分化潜能较好。该实验可建立一套体外培养脊髓源性神经干细胞分离、培养、纯化及鉴定体系，为后续神经干细胞的应用研究奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 培养, 脊髓源性, 神经干细胞, 无血清悬浮分离培养法, 鉴定, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Until now, there is yet no complete recovery from spinal cord injury in terms of structure and functional recoveries. Neurotrophic factors have limited effects on nerve regeneration. Currently, stem cell transplantation may be an effective way to repair spinal cord injury.
OBJECTIVE: To separate, cultivate and purify mouse spinal cord-derived neural stem cells using serum-free suspension method followed by morphological observation, immunofluorescence technology and multi-lineage differentiation experiments.
METHODS: By using the suspension culture method, mouse spinal cord-derived neural stem cells at embryonic day 13.5 were cultured and purified. Cell morphology changes were observed under inverted microscope. Cell proliferation ability was detected using cell counting kit-8. Nestin and Sox2 expression was detected by immunofluorescence technology. Multilineage differentiation of spinal cord-derived neural stem cells at passage 4 was detected by natural differentiation method in order to prove the differentiation ability.
RESULTS AND CONCLUSION: Serum-free medium suspension culture method was successfully applied to separate spinal cord-derived neural stem cells. Cultured cells had good proliferative ability and highly expressed Nestin and Sox2 that was in accordance with the results of DAPI nucleus staining, suggesting the high purity of cells. After induction, the cells could express both Tuj1 and GFAP, indicating the cells had good differentiation
potential. This experiment has successfully established the isolation, culture, identification system of spinal cord-derived neural stem cells, providing experimental basis for subsequent studies of neural stem cells.

中图分类号:

R394.2

李军，徐大波，付强，刘彦斌. 无血清悬浮分离培养法分离、培养、鉴定脊髓源性神经干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8161-8166.

Li Jun, Xu Da-bo, Fu Qiang, Liu Yan-bin. Spinal cord-derived neural stem cells cultured by serum-free suspension method: separation, cultivation and identification[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8161-8166.

图/表（结果） 6

2.1 实验流程图见图1。

2.2 脊髓源神经干细胞的形态学特点神经干细胞在无血清培养液中生长3 d后，悬浮的细胞抱团生长，有的生长的快一些，形成较大的细胞球，其他杂细胞贴壁生长，随着换液传代逐渐坏死，形成细胞碎片悬浮在细胞培养基中。神经干细胞在无血清培养液中生长1周后，悬浮神经球不断增大，其内的细胞变小，数目不断变多，倒置显微镜下观察，形态规则，球的直径不断增大(图2)。

2.3 脊髓源神经干细胞的鉴定进一步对神经球内细胞进行细胞表面标志物检测。结果发现Nestin阳性显示的免疫荧光分布广泛，红色荧光强度高，而绿色荧光检测证实该细胞亦表达Sox2，说明获取的神经干细胞在发育上处于较早期，具有较强的分化潜力。与DAPI细胞核染相比，基本每个细胞均有表达，表明所获得的细胞是神经干细胞(图3)。

2.4 脊髓源神经干细胞增殖能力检测结果原代至第3代神经干细胞增殖活性逐渐增强，在第4代时增殖活性达到最高峰，之后细胞增殖活性进入平台期(图4)。

2.5 脊髓源神经干细胞分化潜能神经干细胞在爬片上培养24 h后，细胞逐渐生长出突起，呈放射状，而且细胞生长出来的突起明显增粗伸长，符合胶质细胞形态样式，有的细胞还处于分裂状态，在远离神经球的地方，还有细胞突起宽大，呈现星形细胞状态。随着培养时间的延长，细胞生长出来的大量突起相互交错，细胞胞体逐渐变小，呈现出胶质细胞的形态特征，以及神经元细胞的形态特征。使用GFAP和Tuj1标记胶质细胞和早期神经元的免疫荧光检测结果，见图5。

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引言

脊髓损伤是一种以脊髓结构破坏，功能细胞凋亡为主要表现的损伤，其病理机制主要为神经元的损失、轴突联系的中断，以及渐进性的脱髓鞘病变。目前临床上尚未发现完全治愈脊髓损伤，使其达到结构及功能恢复的治疗方法。已有的神经营养因子治疗方法，促进神经细胞再生的效果有限，而干细胞移植治疗可能是现阶段修复脊髓损伤的有效方法之一。既往研究表明，神经干细胞位于成年哺乳动物中枢神经系统的特定区域如海马齿状回室管膜下区和侧脑室颗粒下区，这两个区域构成了哺乳动物脑组织中的神经干细胞池，参与中枢神经系统损伤后内源性神经修复再生进程；而在胚胎期小鼠体内，神经干细胞广泛分布于嗅球、海马、脊髓、侧脑室室周^[1]。研究发现将体外分离培养的神经干细胞移植入不同神经系统疾病动物模型脑组织后，神经干细胞会迁移至受损神经组织区域，分化为具有生物学功能的神经细胞替代受损的神经细胞，在一定程度上改善了脑及脊髓损伤的恢复进程及预后^[2-3]。
多年来，科学家通过多种生物手段，改变脊髓神经干细胞的内外环境促进其向神经元分化，以实现脊髓损伤修复的目的，在修复机制和基因学方面取得了一定的研究进展^[4-9]。本实验通过无血清悬浮分离培养法，获取脊髓源性神经干细胞，并结合细胞增殖能力检测及免疫荧光等相关技术证明脊髓源性神经干细胞分化潜能较好，这说明脊髓源性神经干细胞有望成为治疗脊髓损伤的新途径。

材料方法

1.1 设计细胞水平体外观察实验。
1.2 时间及地点于2014年3月至2015年2月在解放军第二军医大学实验中心完成。
1.3 材料健康孕龄13.5 d的C57BL/6小鼠20只，体质量24-28 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，室温下饲养，术前1 d禁食水。实验过程中要善待实验动物，严格遵守动物伦理学相关准则。
1.4 实验方法
1.4.1 脊髓源性神经干细胞的分离和培养将孕13.5 d的C57BL/6雌性小鼠按住头部脱臼处死，用体积分数为75%的乙醇洗浴消毒；行无菌操作取出胎鼠，于胎鼠脑干以下平面取出脊髓，在倒置显微镜下，用显微器械分离出脊髓组织，放入含有Accutase 酶的DPBS液体中，在室温下消化5 min，吹打后，200目细胞筛过滤。1 000 r/min离心5 min，弃去上清。使用预冷的SFM将细胞重悬，在37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养，每3 d换液1次。根据细胞球生长情况，四五天传代1次，使用Accutase酶解聚细胞球。爬片的处理：选择与24孔板直径匹配的爬片，清洗并消毒，放入100 mm细胞培养板，加入0.15 g/L聚鸟氨酸溶液，培养箱中过夜，备用。整个操作过程中注意无菌操作。

1.4.2 脊髓源神经干细胞形态观察每次细胞换液时，取出培养箱中的细胞，在倒置显微镜下观察，并拍照记录。
1.4.3 脊髓源神经干细胞的鉴定选取第4代生长良好的神经干细胞克隆球。按照上述细胞传代培养的方法接种到24孔板的细胞爬片上。待细胞完全贴壁后5 h，进行细胞免疫荧光检测。
用PBS冲洗细胞2次后，用含20-40 g/L多聚甲醛的PBS(新鲜制备的)在室温下固定细胞10-20 min。用含0.05%-0.25%Triton X-100的PBS孵育样品10-15 min，即为通透过程。在含1%-3% BSA的PBS中室温孵育30- 60 min，对其行封闭以阻断非特异性抗体的结合。将细胞的一抗稀释在3%BSA/PBS(保持细胞在黑暗的湿盒)中室温1-4 h或4 ℃过夜。注意使用两种不同来源的抗小鼠的一抗体(Nestin或Sox2)，然后用含有3%BSA/PBS的带有绿色和红色荧光标记的第二抗体标记30-60 min，室温(保持细胞在黑暗的湿盒中)。二抗的抗体可1︰200-1︰500稀释后使用。用DAPI核染5-10 min。淬火自体荧光，用1 g/L硼氢化钠孵化盖玻片，在PBS中浸泡5 min。载玻片上滴一滴封固液30-50 μL，将爬片朝下反扣到载玻片上行封固。最终在荧光显微镜下观察分析并拍照记录。
1.4.4 脊髓源神经干细胞增殖能力检测采用CCK-8法检测6代以内神经干细胞的细胞活力。Accutase酶消化细胞，1 000 r/min离心，培养液重悬。将重悬的细胞接种在多聚鸟氨酸包被过96孔板中，每组6孔，培养至细胞贴壁。每孔加入10 μL CCK-8检测液，3 h后酶标仪测吸光度并记录数据。
1.4.5 脊髓源神经干细胞分化潜能检测取第4代活性较好的克隆球，使用没有细胞因子的独立培养基培养2 d。细胞免疫荧光检测神经干细胞的分化能力，具体抗体孵育方法参见1.4.3，然后在荧光显微镜下观察分析。
1.5 主要观察指标采用CCK-8法、细胞免疫荧光染色法等方法检测脊髓源神经干细胞形态、Nestin阳性率、Sox2阳性率、DAPI细胞核染阳性率等指标以评估脊髓源神经干细胞增殖能力、分化潜能等相关指标。
1.6 统计学分析所有获得数据应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，计数资料采用χ2检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

最早是由雷诺和维斯发现神经干细胞存在于成年哺乳动物中枢神经系统。从中枢神经系统分离的成人神经干细胞能在有丝分裂原表皮生长因子的存在下增殖，未分化神经细胞增殖形成的球体称为神经球^[10]。这些神经球可连续传代，以形成更多的神经球，去除表皮生长因子后，在黏性处理过的培养基板上分化成两类细胞：神经元和神经胶质细胞类型。研究表明，该细胞具有自我更新和多能性。因此，雷诺和维斯已反向证实在成年鼠前脑的脑室周围白质区域有神经干细胞的存在，这也就造成了成年神经再生不发生在哺乳动物的这一基本教条受到了挑战，现在很明显在成年哺乳动物大脑不断有神经再生，如侧脑室和海马齿状回的颗粒下层区的脑室下区，并且这些神经干细胞自然状态下呈星形细胞^[11]。由于技术本身的可操作性强，以及在培养过程中细胞可以产生大量的子代，神经球培养系统已被广泛采用^[12]，常常用于研究神经发育模型，还用于研究神经干细胞的功能、可塑性和治疗潜力^[13]。同样可以利用这种方法，研究来自于其他器官的前体细胞，如角膜、心脏、皮肤、前列腺、乳腺组织和脑肿瘤^[14]。
目前广泛应用于细胞组织消化的酶类对细胞损伤都非常大，而且在细胞脱离细胞板或者解聚后，都需要使用酶抑制剂进行中和，例如牛血清对干细胞的分化影响非常大，因为牛血清中含有大量的因子等物质^[15-16]。本实验使用的Accutase代替胰蛋白酶/EDTA先从胚胎的脊髓组织中分离细胞，然后进行后续培养。Accutase在许多方面都优于传统的胰蛋白酶/EDTA试剂，对细胞的损害较小从而增加存活率。此外，因为它不含有任何哺乳动物或细菌来源的蛋白，风险较低，可以防止引入外来细胞培养物时带来的风险。本实验先从孕13.5 d C57小鼠中分离出胎鼠的脊髓组织，经过上述酶消化后，在无血清培养基中完成悬浮培养，成球状态良好，从实验结果看，细胞倍增时间与国外类似实验相似。随后通过分化潜能检测，验证在撤除表皮生长因子后培养的神经球具有生成神经元和神经胶质细胞的能力^[17] 。
本实验采用并改良了Chojnacki等^[18]使用的神经干细胞悬浮培养获取方法。神经干细胞在无血清培养液中生长3 d后，悬浮的细胞抱团生长，有的生长的快一些，形成较大的细胞球，其他杂细胞贴壁生长，随着换液传代逐渐坏死形成细胞碎片，悬浮在细胞培养基中。神经干细胞在无血清培养液中生长1周后，悬浮神经球不断增大，其内的细胞变小，数目不断变多。进一步对神经球细胞进行细胞表面标志物检测，发现Nestin阳性显示的免疫荧光分布广泛，红色荧光强度高，而绿色荧光检测证实该细胞亦表达Sox2，说明获取的神经干细胞在发育上处于较早期，具有较强的分化潜力。与DAPI细胞核染相比，基本每个细胞均有表达，表明所获得的细胞是神经干细胞。所培养的神经干细胞由原代至第3代时增殖活性逐渐增强，在第4代时增殖活性达到最高峰。随着培养代数的增加，细胞扩增能力逐渐增强，而且细胞形态均匀。成球生长的细胞免疫荧光染色检测结果主要为Nestin和Sox2阳性细胞^[19]。进一步通过分化实验提示，神经干细胞在处理过的爬片上24 h后，细胞逐渐生长出突起，呈放射状，而且细胞生长出来的突起明显增粗伸长，符合胶质细胞形态样式，有的细胞还处于分裂状态，在远离神经球的地方，还有细胞突起宽大，呈现星形细胞状态。随着培养时间的延长，细胞生长出来的大量突起相互交错，细胞胞体逐渐变小，呈现出成熟细胞的形态特征。免疫荧光检测提示GFAP和Tuj1阳性表达，说明获得的细胞可以满足后续实验要求。
研究人员不但能够从脑和脊髓获得大量神经干细胞，还可以从胚胎干细胞等其他干细胞诱导获得^[19]。近年为了避免伦理问题，大量的学者已经成功的利用生物学技术将成体细胞转分化为神经干细胞^[20-21]，这为神经干细胞提供大量的来源。但是体外培养的神经干细胞脱离了体内的细胞微环境小室，同时也剥夺了维持其功能及生物学特性的调控能力，并不能完全符合体内情况，所以需要进一步在完整的个体内验证实验结果^[22]。
关于神经干细胞调控因素的研究发现，不仅与损伤局部微环境信号相关，还和细胞本身相关，这是由基因调节等内部因素决定的。脊髓损伤以后，这些具有干性神经细胞增殖，增殖后向很宽的范围分化参与脊髓重建修复^[23]。神经干细胞增殖后参与少突胶质细胞的髓鞘发生和或神经元环路构建，恢复传导。神经干细胞可以分化为神经胶质(包括星形、少突和小胶质细胞)等。以往大多数的研究表明，在脊髓体内不可能产生神经元细胞^[24]。现在有可能在轻度脊髓损伤中出现神经干细胞向神经元的分化，并参与神经再生。这些研究也说明内源性神经干细胞遵循机体时空调控，脊髓区是一个神经干细胞向神经元分化的环境抑制因子^[25-26]。如果将神经干细胞和神经干细胞的炎性细胞因子白细胞介素6共培养，神经干细胞可以优先分化为星形胶质细胞，而减少神经元发生。还有白血病抑制因子能够提高神经干细胞的增殖，减少细胞球分化^[27]。局部微环境在神经干细胞的分化中有重要的作用^[25，28-30]。虽然在体外能够培养出神经干细胞，这只能说明脊髓区域能存在有向神经元分化的神经干细胞，并不能说明其在体内也能分化为神经元，这就依然需要考虑体内微环境对神经干细胞的影响。
本研究发现从胎鼠脊髓所分离获取的脊髓源性神经干细胞经培养后主要向胶质细胞分化，神经元则相对较少，这可能是脊髓损伤后机体自我修复困难的主要原因之一。实验从胎鼠脊髓组织中提取出神经干细胞，观察其在体外培养条件下生物学特性，建立了一套神经干细胞分离培养、纯化、鉴定的方案，从而为后续神经干细胞研究的顺利进行奠定了理论及实验基础。

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脊髓损伤的治疗是临床医学的世界性难题，据不完全统计，中国脊髓损伤人数已突破百万。目前，对干细胞治疗脊髓损伤效果及机制方面的研究已然成为一大热点，随着研究的不断深入，取得了一定进展。但是与脑内神经干细胞不同，神经干细胞分化为神经元细胞的效率较低。脊髓神经干细胞很难向有重要功能意义的神经元细胞分化，这一直是神经干细胞研究的难点。近年，神经干细胞迁移分化调控的微环境研究，逐渐成为研究的热点。研究发现不是因为脊髓源神经干细胞缺乏向神经元细胞分化的潜能，而是微环境不同造成的。
体外培养的神经干细胞是研究神经发育、再生及脊髓生理、病理、评价神经营养因子等的理想材料，因此，其研究地位也显得越来越重要。各年龄段中枢神经系统来源的干细胞及其后代，当它们暴露于含有生长因子的无血清组织培养基中时，可以被刺激不断增殖，自我更新。通过适当的接种密度建立细胞培养体系，持续的细胞分裂能够产生非贴壁的球形细胞簇，通常被称为神经球。神经球培养检测方法已被证明非常适用于分离神经干细胞和神经祖细胞，研究细胞谱系的分化和潜力。很多器官组织可以解离出细胞球，通过该悬浮培养体系扩大和集中足够的数量用于后续的科学探究。许多因素促成并影响了神经球形成，关键变量包括动物种属，接种密度和传代次数，以及年龄都会影响神经细胞球的同质性或异质性，定性和定量观察神经球的实验研究是必需的。在了解一项实验科学价值之前，需要明确知道神经干细胞克隆球的来源及其生长培养的体系。不同培养方法获得的神经干细胞，可导致不同实验室之间实验结果有所不同，因此需要严格掌握神经干细胞体外培养的条件。实验详细描述了该培养体系的步骤。从胎鼠脊髓组织解剖分离神经干细胞后，以神经球的形式悬浮培养并扩增神经干细胞数目。除了摸索神经球培养条件，研究还包括制备神经球并进行的光镜分析。神经球的组织学或免疫细胞实验，提供了研究神经球的特定分子和细胞表型详细数据，为进一步鉴定提供了有利条件；另外，本实验将得到体外原代培养脊髓内源性神经干细胞的自然生长规律，为应用此实验模型进行相关研究提供有意义的参考依据。

无血清悬浮分离培养法分离、培养、鉴定脊髓源性神经干细胞

Spinal cord-derived neural stem cells cultured by serum-free suspension method: separation, cultivation and identification

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