补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞对大脑中动脉闭塞再灌注治疗的作用机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.015

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (50): 8120-8125.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.015

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补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞对大脑中动脉闭塞再灌注治疗的作用机制

张运克^1，2，宋军营¹，张振强¹

张运克，男，1966年生，河南省平顶山市人，汉族，2002年黑龙江中医药大学毕业，博士，教授，主任医师，主要从事中医药防治神经系统疾病的研究。

收稿日期:2015-10-16 出版日期:2015-12-03 发布日期:2015-12-03
通讯作者: 张振强，博士，教授，河南中医学院，河南省郑州市 450046
作者简介:张运克，男，1966年生，河南省平顶山市人，汉族，2002年黑龙江中医药大学毕业，博士，教授，主任医师，主要从事中医药防治神经系统疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金课题(81072799/H2708)

Effect of buyang huanwu decoction combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on cerebral ischemia-reperfusion injury

Zhang Yun-ke^{1, 2}, Song Jun-ying¹, Zhang Zhen-qiang¹

Zhang Yun-ke, M.D., Chief physician, Professor, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China; First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2015-10-16 Online:2015-12-03 Published:2015-12-03
Contact: Zhang Zhen-qiang, M.D., Professor, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China
About author:Zhang Yun-ke, M.D., Chief physician, Professor, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China; First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81072799/H2708

摘要/Abstract

摘要：

背景：急性脑缺血时基质金属蛋白酶通过降解细胞外基质，破坏内皮细胞间的紧密连接而增加微血管的通透性，破坏血脑屏障，导致脑水肿的发生。
目的：旨在从基质金属蛋白酶及细胞外基质方面，探讨补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠的治疗作用机制。
方法：将96只SD大鼠随机分为模型组，组织型基质金属蛋白酶抑制剂1组，组织型基质金属蛋白酶抑制剂1+骨髓间充质干细胞组(简称骨髓间充质干细胞组)，组织型基质金属蛋白酶抑制剂1+补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞组(简称联合组，分12，24，36，48 h 4个亚组)。构建大鼠脑缺血再灌注模型，在立体定位仪下采用微量进样器脑部给予基质金属酶抑制剂及培养的骨髓间充质干细胞；联合组术前7 d开始给予补阳还五汤(10 mL/kg)灌胃，其余各组给予等剂量的生理盐水。给药10 d后采集实验动物血清和脑组织，采用ELISA 法测定血清中基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9水平，明胶酶谱法分析脑组织基质金属蛋白酶9活性。
结果与结论：与模型组相比，各组血清基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9水平和脑组织基质金属蛋白酶9的活性均有不同程度的下降，其中基质金属蛋白酶9下降明显(P < 0.05)；与骨髓间充质干细胞组相比，联合组36 h和联合组48 h血清基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9水平和脑组织基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶9前体活性下降最为明显(P < 0.01)。结果表明补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞可与组织型基质金属蛋白酶抑制剂1协同作用，从而抑制因基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9所致的细胞外基质降解，修复受损的血脑屏障及防治缺血后脑水肿的形成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：
干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 补阳还五汤, 骨髓间充质干细胞, 基质金属蛋白酶9, 基质金属蛋白酶2, 大脑中动脉栓塞, 再灌注损伤, 动物模型, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: When acute cerebral ischemia attacks, matrix metalloproteinases (MMPs) lead to the occurrence of cerebral edema through degrading the extracellular matrix, breaking the close connection between endothelial cells, increasing the permeability of capillaries, and destroying the blood brain barrier.
OBJECTIVE: From the aspects of MMPs and extracellular matrix, to discuss the therapeutic effects of buyang huanwu decoction combined with bone marrow mesenchymal stem cell (BMSCs) transplantation on cerebral ischemia-reperfusion injury.

METHODS: A total of 96 Sprague-Dawley rats were randomly divided into model group, tissue inhibitor of MMPs-1 (TIMP-1) group, TIMP-1+BMSCs group (BMSCs group) and buyang huanwu decoction+BMSCs+TIMP-1 group (combined group that was divided into four subgroups, 12-, 24-, 36-, 48-hour groups). Rat models of cerebral ischemia-reperfusion were constructed, and TIMP-1 and BMSCs were injected to the brain of rats by a microinjector in a stereotaxic apparatus. Rats in the combined group were given buyang huanwu decoction (10 mL/kg), and rats in the other groups were given the same volume of normal saline at 7 days before surgery. After 10 days of administration, serum samples and brain tissues were collected to determine MMP-2 and MMP-9 levels using ELISA and to detect MMP-9 activity using gelatinases spectrometry method.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the levels of MMP-2 and MMP-9 in the serum and MMP-9 activity in the brain were decreased in the other groups to different extents, especially the levels of MMP-9 (P < 0.05). Compared with the BMSCs group, the levels of MMP-2 and MMP-9 in serum as well as activities of MMP-9 and pro-MMP-9 in the brain were decreased significantly in the combined group at 36 and 48 hours after treatment (P < 0.01). The results show that the buyang huanwu decoction can be mutually cooperated with TIMP-1 to inhibit the degradation of extracellular matrix induced by MMP-2 and MMP- 9, repair the damaged blood brain barrier, prevent and cure cerebral edema after ischemia.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

中图分类号:

R394.2

张运克，宋军营，张振强. 补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞对大脑中动脉闭塞再灌注治疗的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8120-8125.

Zhang Yun-ke, Song Jun-ying, Zhang Zhen-qiang. Effect of buyang huanwu decoction combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on cerebral ischemia-reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8120-8125.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析参加造模SD大鼠96只，最后进入结果分析的动物数分别为模型组10只，TIMP-1组8只，骨髓间充质干细胞组8只，联合组12，24，36，48 h分别为9，8，7，7只。
2.2 ELISA 法检测血清 MMP-2、MMP-9水平与模型组相比较，TIMP-1组MMP-9水平下降明显，差异有显著性意义(P < 0.05)，MMP-2水平有一定程度的下降，统计学差异无显著性意义(P > 0.05)。骨髓间充质干细胞组MMP-2水平有所下降，但与模型组及TIMP-1组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；MMP-9水平下降明显，与模型组及TIMP-1组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)。联合组MMP-2、MMP-9水平下降明显，12 h时与模型组及TIMP-1组比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)；24，36，48 h时与模型组及TIMP-1组比较，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。与骨髓间充质干细胞组相比，12，24 h时差异有显著性意义(P < 0.05)，36，48 h时差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见表1和图1。

2.3 明胶酶谱法检测脑组织MMP活性在施加TIMP-1后，大鼠脑组织中Pro MMP-9和MMP-9的活性下降明显，两者的变化一致。统计结果显示，与模型组相比较，TIMP-1抑制后，Pro MMP-9及MMP-9下降明显，差异有显著性意义(P < 0.05)。骨髓间充质干细胞组Pro MMP-9、MMP-9活性显著下降，与模型组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，但与TIMP-1组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)。联合组12，24，36，48 h Pro MMP-9、MMP-9活性均下降，与模型组相比，12 h时差异有显著性意义(P < 0.05)；与TIMP-1组相比，12 h下降不明显，差异无显著性意义 (P > 0.05)。与模型组相比，24，36，48 h时差异有非常显著性意义(P < 0.01)；与TIMP-1组比较，36，48 h下降最为明显(P < 0.01)。与骨髓间充质干细胞组相比，12 h变化不大(P > 0.05)，24 h后变化明显(P < 0.05)，36，48 h下降最为明显(P < 0.01)，见表2，图2，3。

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引言

水肿常继发于急性缺血性脑血管病，直接影响患者的疗效和预后，是脑梗死患者急性期死亡的主要原因^[1]，缺血后瀑布效应引起的血脑屏障通透性改变，是脑水肿的主要原因。血管内皮细胞及细胞外基质是一种多功能蛋白和糖蛋白复合体，与器官系统内细胞和组织的结构完整性相关，为血管提供结构支持，是血脑屏障的重要组成部分^[2]，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一组降解基底膜细胞外基质成分的锌依赖性酶。MMP-2和MMP-9是重要的明胶酶，与脑缺血再灌注时微血管损伤的关系最为密切。脑缺血再灌注后，MMP表达增加，血脑屏障通透性急剧上升，大量水分子从细胞旁路渗入脑组织内，脑组织体积增加，发生脑水肿^[3]。组织型基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase，TIMPs)家族是体内存在的一种天然的MMP抑制剂，TIMP-1可与 MMP-9 特异性结合，形成复合物而发挥其抑制作用。研究表明，脑缺血和缺血再灌注时，给予外源性TIMP-1可减轻缺血和再灌注损伤^[4] 。
补阳还五汤是清代王清任创立的治疗缺血性中风的经典名方，对中医辨证为气虚血瘀型中风具有显著的临床疗效，可以应用到中风的急慢性各期。为了揭示其对急性脑缺血保护作用的机制，课题组前期进行了补阳还五汤对脑水肿、Ca2+、神经细胞凋亡的影响^[5]，结果证明补阳还五汤能降低脑缺血再灌注模型脑组织含水量，具有减轻脑水肿作用。高颖等^[6]的研究证明：补阳还五汤干预后，大脑中动脉栓塞模型再灌注24，48 h后MMP-9活性及酶原含量下降，血脑屏障通透性下降，脑水肿减轻。
在国家自然科学基金的支持下，课题组进行了补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血损伤保护机制的研究，结果发现：两者联合对抗脑缺血损伤具有协同作用^[7]，补阳还五汤能够诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化^[8]，抑制神经细胞凋亡、缩小脑缺血体积，减轻脑水肿等^[9-10]。为了从MMP及细胞外基质方面研究补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞移植对大脑中动脉栓塞再灌注大鼠血脑屏障的保护机制，采用TIMP-1对模型进行干预，然后给予骨髓间充质干细胞移植联合补阳还五汤治疗，用ELISA 法测定血清中MMP-2、MMP-9水平、明胶酶谱法分析脑组织MMP-9活性，现将结果报道如下。

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材料方法

1.1 设计体内动物实验，血清及组织中蛋白表达检测。
1.2 时间及地点实验于2012年6月至2013年5月在河南中医学院动物实验研究中心和分子生物学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物用于提取骨髓间充质干细胞的SD大鼠10只，雄性，体质量280-300 g；用于造模的SD大鼠96只，清洁级，雌雄不拘，体质量250-300 g，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，质量合格证号：11400700017030。
1.3.2 主要试剂与仪器大鼠血清MMP-9和MMP-2 ELISA试剂盒(美国R&D公司，货号CK-E30434R和CK- E30505R)，基质金属蛋白酶明胶酶谱分析试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，货号：P1700)，Mini-PROTEAN 3小型垂直电泳槽和iMARKTM酶标仪(美国BioRad公司)，DYY-8C电泳仪(中国北京六一生物科技有限公司)，ImageScannerTM凝胶图像扫描仪(美国GE公司)，Gel-Pro专业图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)。
1.3.3 实验药物补阳还五汤选用优质当归60 g、川芎30 g加水720 mL，蒸馏，收集芳香水200 mL备用。药液过滤备用。在药渣中依次加入黄芪1 200 g、赤芍60 g、地龙30 g、红花30 g、桃仁30 g，再加入10 800 mL水，煎煮2次，每次1 h，滤过，合并煎液及上述药液，使用旋转蒸发仪减压浓缩至近400 mL，加入制备的200 mL芳香水，吐温-80 3 mL及蒸馏水适量，至600 mL，所得药液较稠应充分搅匀，既得。所得药液呈深褐色，每1 mL相当于原药材2.4 g，并进行高温高压蒸汽灭菌，分装入无菌250 mL输液瓶密封，放入4 ℃冰箱保存备用。实验药物由河南中医学院第一附属医院制剂科制备。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞的制备将健康SD大鼠颈部脱臼处死，体积分数为75%乙醇浸泡15 min，取出股骨和胫骨，置于无菌1×PBS溶液中，将股骨和胫骨两端剪断，暴露骨髓腔；用1×PBS溶液反复冲洗骨髓腔，收集骨髓腔内的细胞于15 mL无菌离心管中，采用密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞[11]。加入3-5倍体积的1×PBS，1 500 r /min、15 min离心洗涤2次，弃上清。锥虫蓝染色计数活细胞，以1.0×109 L-1的细胞浓度接种于T75培养瓶中，加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱培养，并标记为原代。5 d后首次换新培养液，以后每隔3 d或4 d换新培养液1次，待细胞完全融合时传代。经过不断的传代使干细胞扩增和纯化直至第10代时使用。
1.4.2 大鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型制备参照Rupadevi等[12]建立的方法改进。主要步骤为：10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，常规消毒，取颈正中切口，分离右侧颈总动脉，颈外动脉与颈内动脉，结扎颈总动脉近心端及颈外动脉，将线栓插入颈总动脉，经颈内动脉送至颅内，稍遇阻力则止，线栓插入深度距离颈内、外分叉处19 mm左右，收紧线栓。缝合切口，留置线头于体外，用手术灯照射，2 h后实现再灌注时，抽提线栓至颈总动脉内即可。
1.4.3 动物分组将96只大鼠随机分为模型组(n=12)，TIMP-1组(n=14)，TIMP-1+骨髓间充质干细胞组(简称骨髓间充质干细胞组，n=14)，TIMP-1+补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞组(简称联合组，分12，24，36，48 h 4个亚组，每亚组14只)。
1.4.4 模型给药方法在立体定位仪下，参考大鼠立体定位仪图谱在大鼠前囟后1 mm，旁开1.5 mm，深3.5 mm处为正常大鼠侧脑室结构，模型组用微量进样器通过侧脑室给予生理盐水10 μL；TIMP-1组给予TIMP-1 5 μL，生理盐水5 μL；骨髓间充质干细胞组及联合组给予TIMP-1 5 μL、培养的骨髓间充质干细胞组5 μL(1×106个)。联合组造模前 7 d给予补阳还五汤(10 mL/kg)灌胃，造模后继续给药3 d，其他各组以同等体积的生理盐水灌胃，每日1次。
1.4.5 ELISA法测定大鼠血清MMP-9、MMP-2含量给药10 d后，暴露腹主动脉，每只大鼠取血5 mL，分离血清，放置于-20 ℃冰箱内备用。ELISA 法检测血清MMP-9、MMP-2水平，按照试剂盒操作说明书进行。以标准品浓度作横坐标，对应吸光度值作纵坐标，绘制出标准品回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
1.4.6 大鼠脑组织蛋白提取及MMP-9活性测定给药 10 d后，游离出完整的脑组织，快速放入液氮罐中，保存备用。提取总蛋白时，将大鼠脑组织放入加入液氮的研钵，按每100 mg组织加500 μL蛋白裂解液加入研钵，充分短时研磨，获得组织悬液。将悬液放入EP管中，冰浴20 min，4 ℃ 14 000 r/min离心20 min，收集上清，即是总蛋白。BCA法测蛋白浓度。取蛋白样品加入样品缓冲液(5×，0.4 mol/L Tris-HCl pH6.8，5%SDS，20%甘油，0.03%溴酚蓝)，上样于含1%明胶的PAGE胶中，设置恒流30 mA，45 min电泳，结束后，置胶于2.5% TritonX-100，振荡30 min；放入孵育液(50 mmol/L Tris，pH7.5，150 mmol/L NaCl， 10 mmol/L CaCl2，0.102%NaN3)漂洗 30 min。再置37 ℃孵育液36 h。用0.5%考马斯亮蓝G250染色3 h后，脱色至 pro MMP-9、MMP-9消化区透明清晰为至。扫描仪获得凝胶扫描图像，以 Gel pro4.0版凝胶光密度软件分析，比较阳性条带积分吸光度值。酶活性=条带面积×(条带灰度-背景灰度)。
1.5 主要观察指标各组血清和脑组织中MMP-2、MMP-9水平及活性变化。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计分析软件进行数据处理，计量数据以x(_)±s表示，多组间比较用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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MMP是Zn2+依赖性金属蛋白内切酶家族，能降解绝大多数细胞外基质，在组织重塑、血管发生、胚胎发育和创伤愈合等生理学过程中起着重要作用。MMP在血管内皮细胞、胶质细胞、神经元和中性粒细胞以无活性的酶原形式分泌，在体内经水解而活化。在生理条件下，MMP可参与胚胎发育、正常组织重塑、创伤愈合及血管发生^[13-14]，在病理条件下，参与微血管损伤、纤维变性、肿瘤侵袭、转移等过程^[15]。通常在中性条件下发挥活性，其活性增加与脑微血管通透性、血脑屏障通透性、炎性细胞侵入和脑水肿明显相关^[16]。根据分子结构和作用底物的不同，MMP分为5种类型：明胶酶、胶原酶、基质溶解素、膜型金属蛋白酶和其他不能分类的MMP^[17]。MMP-2和MMP-9是重要的明胶酶，MMP-2 除来源于粥样斑块的合成分泌，也可由内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和单核巨噬细胞合成，在正常人中枢神经系统中，脑血管内皮细胞、星形细胞和小胶质细胞中己经发现MMP-2，MMP-9^[18-19]。MMP-9主要以无活性的酶原形式存在并分泌到细胞外，属于分泌型，只有被活化才能降解基底膜。脑缺血时，MMP-2和MMP-9可降解细胞外基质、改变血管通透性、参与血管源性脑水肿和白细胞浸润。Rosenberg等^[20]发现大鼠脑内注射MMP-2可促使血脑屏障开放。脑缺血后MMP-2通过蛋白水解作用破坏毛细血管紧密连接和基底膜，继而引起血管源性脑水肿。在局灶性脑缺血区发现MMP-2和MMP-9的表达均升高，但二者有明显的时间差异。MMP-9在缺血后3.0-4.0 h表达即开始增加，12 h后明显增高，24-48 h达高峰，一直持续到缺血后15 d左右回落到基础水平；而MMP-2则从缺血24 h后开始出现表达水平增高，第5天明显增高，至30 d仍有低水平表达。缺血部位MMP-2和MMP-9表达的时间和分布明显不同，MMP-9表达很早，且在许多内皮细胞和浸润中性白细胞表达，24 h后所有中性白细胞表达MMP-9，可能大多数表达MMP-9的中性白细胞与它们在卒中后某个时间点的移行有关。脑缺血时，MMPs 活性与血脑屏障通透性的时程变化密切相关^[21] 。
MMP-9作为脑卒中严重程度的判断标准^[22]，其水平可作为反应脑梗死患者梗死体积大小以及近期预后的一个重要指标。MMP-9在神经组织损伤中作用机制可能包括：①破坏血脑屏障血管基膜和紧密连接，导致血脑屏障通透性增加，有利于炎性细胞和炎性因子通过血脑屏障，形成脑水肿并导致脑组织的进一步损伤^[23]。②在炎症反应中活性氧通过半胱氨酸转换区中的半胱氨酸作用而发挥活化MMP前体的作用^[24]。③MMP与TIMPs特别是MMP-9与TIMP-1失衡。TIMP-1以1︰1的比例与活化的MMP-9结合，通过其氨基末端折叠成的一个特殊结构抑制其活性^[25]。在酶原水平，Pro-MMP-9与TIMP-1结合，并被活化的MMP-2纤溶酶激活。脑缺血再灌注损伤可激活MMP-9，引起MMP-9与TIMP-1的失衡，造成血脑屏障受损。因此，通过调节脑缺血损伤后明胶酶系统失衡可发挥血脑屏障保护作用。如能降低脑缺血后MMP-9的表达，减少连接蛋白的损伤，降低血脑屏障的通透性，则可起到脑组织保护作用^[26]。
补阳还五汤作为治疗缺血性脑血管疾病的经典方剂，对急慢性脑梗死都有很好的临床疗效。关于整方及主要方药对MMP-9影响的研究报道较多，如吴飞燕等^[27]报道，补阳还五汤能够下调急性脑梗死患者血浆MMP-9水平，抑制炎症反应。王红祥等^[28]报道，君药黄芪的开发产品黄芪注射液降低脑损伤大鼠脑组织的MMP-9水平，发挥抗炎及降低脑水肿的作用。李敬文等^[29]报道其臣药川芎的提取物川芎嗪能够增加动脉损伤后管壁TIMP-1 mRNA的表达，拮抗MMP-9对细胞外基质的降解，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。王栋等^[30]报道其臣药红花的提取物红花注射液降低MMP-2/TIMP-2的比值，保护损伤的心肌。骨髓间充质干细胞具有多种分化的潜能，能够促进神经细胞的分化，治疗多种神经系统疾病，其作用机制较多，有报道与MMP-9有关，如方顺森等^[31]报道骨髓间充质干细胞移植修复动脉粥样硬化破裂斑块与MMP-9的降低有关。
从此次实验结果来看，模型组血清MMP-2、MMP-9水平及脑组织MMP-9、Pro-MMP-9活性均有一定程度的升高，TIMP-1干预后水平下降，说明脑缺血再灌注后，MMP参与微血管损伤、纤维变性等过程^[15]，TIMP-1有抑制MMP-2、MMP-9的作用，对MMP-9的抑制作用更为明显 (P < 0.01)，通过抑制MMP-9，发挥缺血脑组织的保护作用。骨髓间充质干细胞组对TIMP-1干预后血清MMP-2的作用不明显，对MMP-9的降低作用明显(P < 0.01)，对脑组织MMP-9、Pro-MMP-9的降低作用不明显(P > 0.05)，可能与骨髓间充质干细胞在脑损伤后，透过血脑屏障的能力降低有关。与骨髓间充质干细胞组相比，联合组对TIMP-1干预后血清MMP-2、MMP-9均有降低作用(P < 0.05)，以36，48 h最为明显(P < 0.01)。12 h时段脑组织MMP-9、Pro-MMP-9活性的降低作用不明显(P > 0.05)，24 h作用明显(P < 0.05)，36，48 h最为明显(P < 0.01)。说明补阳还五汤与TIMP-1可协同作用，抑制MMP-2、MMP-9对细胞外基质的降解，防治缺血后脑水肿的形成。
综上所述，补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞移植可与TIMP-1协同作用，使大脑中动脉梗塞再灌注大鼠血清MMP-9、MMP-2表达显著下降，且随着联合干预时间延长这种协同作用得以加强，并于观察的最后时间48 h达到最高，说明补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞协同TIMP-1可通过抑制细胞外基质的降解，发挥对血脑屏障的保护作用，防治缺血后脑水肿的形成。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞对大脑中动脉闭塞再灌注治疗的作用机制

Effect of buyang huanwu decoction combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on cerebral ischemia-reperfusion injury

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