骨髓间充质干细胞培养上清液治疗支气管哮喘及对肺部炎症的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：医学界普遍认为支气管哮喘是一种与Th2相关的免疫反应疾病，目前尚缺乏理想的治疗方法。骨髓间充质干细胞作为一种成体干细胞，不仅具有增殖和多向分化能力，还具有低免疫原性和免疫调节能力。
目的：探讨骨髓间充质干细胞培养上清液对支气管哮喘小鼠肺部炎症的影响。
方法：将20只实验小鼠随机分为对照组和实验组，每组10只，在第0天及第14天小鼠腹腔注射卵清蛋白溶液致敏，并在第24-26天雾化吸入卵清蛋白溶液激发。实验组从第24天开始，在每次激发前2 h，腹腔注射制备好的骨髓间充质干细胞培养上清液2 mL，对照组腹腔注射生理盐水。末次激发后麻醉致小鼠安乐死亡，采取血清、肺泡灌洗液及肺脏组织进行研究。
结果与结论：①对照组小鼠肺组织结构发生异常，黏膜下层和肌层内能够看见大量嗜酸性粒细胞及单核细胞浸润，经骨髓间充质干细胞培养液治疗后，实验组小鼠肺部炎症较轻。②实验组白细胞总数、嗜酸性粒细胞数、嗜酸性粒细胞百分比显著低于对照组(P < 0.01)。③实验组肺泡灌洗液以及血清中白细胞介素17水平显著低于对照组(P < 0.05)；肺泡灌洗液以及血清中白细胞介素4水平与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。上述结果提示支气管哮喘小鼠腹腔注入骨髓间充质干细胞培养上清液能够减轻肺部炎性病理反应严重程度，降低肺泡灌洗液以及血清中相关的炎症指标水平。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞培养上清液, 支气管哮喘, 肺部炎症, 白细胞介素17, 嗜酸性粒细胞

Abstract:

BACKGROUND: Bronchial asthma is considered generally to have an association with Th2 immune response disease, but there is no ideal treatment. Bone marrow mesenchymal stem cells as a kind of adult stem cells not only have the multipotent differentiation and proliferation capacity, but also have low immunogenicity and immunoregulation ability.
OBJECTIVE: To investigate the effect of culture supernatant of bone marrow mesenchymal stem cells on lung inflammation of bronchial asthma mice.
METHODS: Twenty experimental mice were randomly divided into control and experimental groups, 10 mice in each group. At 0 and 14 days, intraperitoneal injection of ovalbumin induced sensitization in mice, and at 24-26 days, aerosolized ovalbumin solution was used for excitation. From the 24th day, in the experimental group, bone marrow mesenchymal stem cell supernatant was intraperitoneally injected at 2 hours before excitation; meanwhile, normal saline was injected in the control group. At the last of excitation, the mice were sacrificed under anesthesia to take serum samples, bronchoalveolar lavage fluid and lung tissues.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Mice in the control group appeared to have abnormal lung tissue structure, and there were a large amount of eosinophils and monocytes in the submucosa and muscularis. However, lung inflammation was relieved in the experimental group after bone marrow mesenchymal stem cell treatment.
(2) The levels of interleukin-17 in the bronchoalveolar lavage fluid and serum were significantly lower in the experimental group than the control group (P < 0.05), but there was no difference in the levels of interleukin-4 between the two groups (P > 0.05). These findings indicate that the intraperitoneal injection of bone marrow mesenchymal stem cells can ease lung inflammation and reduce levels of inflammatory markers in the bronchoalveolar lavage fluid and serum of bronchial asthma mice.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Asthma, Interleukin-17

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

支气管哮喘是临床常见疾病，且随着人们生活节奏的加快其发生率出现上升趋势。相关数据研究结果显示：支气管哮喘在成人中发病率为8%，儿童中发病率高达20%^[1]。患者发病后主要以呼吸困难、咳嗽、喘息等为主，影响患者正常生活和工作。目前，对于支气管哮喘尚缺乏理想的治疗方法，常规方法更多以激素治疗为主，这种方法虽然能够改善患者症状，但是长期疗效欠佳，预后较差^[2-3]，另外患者长期使用抗生素容易产生病菌耐药性，给患者治疗预后等带来很大不便^[4-5]。中国2007年版支气管哮喘防治指南中明确指出：多数哮喘患者的症状和炎性进程可以应用吸入性糖皮质激素联合长效β受体激动剂进行有效的控制。白三烯受体拮抗剂近年来也被用来医治哮喘的炎症反应，诱导免疫耐受，从而能够对患者进行特异性免疫治疗。通过这些方法能够改善患者症状，但是临床上对于难治性哮喘尚缺乏更好的治疗方法。目前，对于支气管哮喘发病机制尚不完全知晓，医学界普遍认为支气管哮喘是一种与Th2相关的免疫反应疾病^[6-7]，患者在发病早期机体免疫系统Th2会发生作用，并且与之相关的细胞因子参与了支气管哮喘的炎症反应。针对这种发病机制，临床上进行了许多研究，并取得了阶段性进展，成功研制出抗IgE应用于临床。另有研究显示骨髓间充质干细胞能够用于治疗肺部疾病^[8-9]，但是临床对该治疗方案的作用机制尚不完全清楚^[10-11] ，究竟治疗过程中是干细胞本身发挥了损伤修复作用，还是干细胞释放了某种细胞因子发挥了调理局部炎症作用等尚不完全知晓。基于前人研究，本实验探索腹腔内注射骨髓间充质干细胞培养上清液对支气管哮喘小鼠肺部炎症的改善作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年6月至2015年6月在解放军第四军医大学完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 20只实验小鼠，雌雄随机，4-6周龄，体质量为20-25 g，由解放军第四军医大学动物实验中心提供，严格遵守相关标准进行饲养。将20只小鼠随机分为对照组和实验组，每组10只。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

1.3.2 主要仪器和试剂骨髓间充质干细胞(生物工程(上海)有限公司)，雾化吸入器(哈尔滨三联药业股份有限公司)，卵清蛋白(上海恒远生物有限公司)，光学显微镜(德国西门子有限公司)，氢氧化铝凝胶(淄博百达化工)，离心机(美国 BeckmanCoulter公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞培养上清液的制备细胞培养皿中接种骨髓间充质干细胞，每皿1×10⁵，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度细胞培养箱培养，48 h后等量换液1次，再继续培养48 h，收集培养皿中的骨髓间充质干细胞培养上清液。

1.4.2 小鼠支气管哮喘模型的制备方法^[12] 在第0天及第14天小鼠腹腔注射卵清蛋白溶液致敏，并在第24-26天雾化吸入卵清蛋白溶液激发。

1.4.3 骨髓间充质干细胞培养液治疗^[13-14] 从第24天开始，在每次激发前2 h，腹腔注射制备好的骨髓间充质干细胞培养上清液2 mL。对照组腹腔注射生理盐水。

末次激发后处死小鼠，采取血清、肺泡灌洗液及肺脏组织进行研究。

1.4.4 采血经小鼠眼眶摘眼球采血，并滴入肝素抗凝管内，离心(3 000 r/min)10 min，将获得的上清液放在-20 ℃下保存，用于检测血清中白细胞介素17和白细胞介素4水平。

1.4.5 采集支气管肺泡灌洗液采用0.3%戊巴比妥注射麻醉，待麻醉生效后切口气管并插管，生理盐水灌洗2次。将获得的支气管肺泡灌洗液进行离心(1 500 r/min)10 min，将得到的上清液转移到另一个清洁的试管中，放在-20 ℃下保存，用于检测支气管肺泡灌洗液中白细胞介素17和白细胞介素4水平。采用10 mL生理盐水对细胞沉淀进行重悬，制作细胞涂片，并对细胞进行计数分类^[15-16]。

1.4.6 肺组织病理学检查取小鼠肺组织放入到体积分数为4%甲醛溶液中进行固定过夜。常规取材后，进行梯度乙醇脱水，组织透明处理，浸蜡，石蜡包埋切口，苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察小组肺组织炎性改变^[17-18]。

1.4.7 炎症因子水平检测为了进一步了解小鼠肺部炎症情况，对支气管肺泡灌洗液和血清中细胞因子白细胞介素17和白细胞介素4水平进行检测。

具体如下：从ELISA试剂盒中取出所需要的条板，加样封孔并进行孵育，对洗板连续清洗4次，向细胞中加入生物素化抗体工作液，封闭条板进行孵育。向各个孔中加入100 μL酶结合物工作液，然后采用胶纸密封，放于37 ℃孵育30 min。再次对洗板进行4次清洗，加入100 μL显色剂，在37 ℃温度下孵育10-15 min，最后加入100 μL终止液，测量A₄₅₀值^[19-20]。

1.5 主要观察指标 ①肺组织病理学改变。②支气管肺泡灌洗液细胞学改变。③支气管肺泡灌洗液和血清中白细胞介素17和白细胞介素4水平。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件对数据进行t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

支气管哮喘是临床上常见的疾病，这种疾病发病率较高，且医学界对其发生机制尚不完全知晓，患者发病后主要以慢性炎症为特征，临床症状比较显著，患者发病早期如果不采取及时、有效的方法治疗将会诱发其他疾病，严重者将会威胁其生命^[21-22]。

目前，临床上对于支气管哮喘尚缺乏理想的治疗方法，常规方法更多的以吸入性糖皮质激素治疗为主，这种方法虽然能够改善患者症状，但是对于气道重塑患者疗效并不明显，并且药物不良反应发生率较高，治疗依从性也比较差^[23-24]。近年来，相关研究已经研制出针对白细胞介素4、白细胞介素5以及白细胞介素13等细胞因子的拮抗剂，并且部分药物已经开始用于支气管哮喘的治疗^[25-26]，这种方法也能够取得预期的临床治疗效果，但是该方案治疗时只能够针对某一种炎症因子，而治疗时需要同时采用多种细胞抑制因子，并且不同拮抗剂之间可能存在的相互作用并不完全知晓，使得该治疗方案在临床使用时也受到一定的限制^[27-28]。因此，研究支气管哮喘的发病机制、治疗方法具有重要的意义^[29-30]。

近年来医学界对于骨髓间充质干细胞的研究成为了一个新的方向。最新一项研究结果显示：在一定的外界刺激下，骨髓间充质干细胞具有多向分化功能，它在机体组织修复过程中能够发挥了重要的作用。骨髓间充质干细胞和其他细胞相比具有其独有的特性，具体如下^[31-32]：①骨髓间充质干细胞能够自我增殖和分化，在组织损伤修复和再生过程中发挥重要的作用。②骨髓间充质干细胞能够参与机体的免疫调节作用，具有免疫逃避潜能。③骨髓间充质干细胞更加易于体外分离和培养，能够在各种趋化因子的协同作用下，向机体损伤或者病灶部位进行迁移。基于骨髓间充质干细胞上述特征，使得骨髓间充质干细胞成为治疗支气管哮喘的理想治疗方法之一，通过该方法能够有效的促进机体恢复，改善支气管哮喘患者机体内的炎性反应，从而能够提高患者肺功能^[33-34]。本研究中，对照组小鼠肺组织结构发生异常，肺部组织过于膨胀，黏膜下层和肌层内能够看见大量嗜酸性粒细胞及单核细胞浸润，支气管平滑肌增厚，经骨髓间充质干细胞培养上清液治疗后，实验组小鼠肺部炎症较轻^[35-36]。有研究表明，移植骨髓间充质干细胞能够有效缓解过敏性气道炎症反应^[37]。本研究中，实验组白细胞总数、嗜酸性粒细胞数、嗜酸性粒细胞百分比显著低于对照组(P < 0.01)，实验组肺泡灌洗液以及血清中白细胞介素17水平显著低于对照组(P < 0.05)，由此看出，支气管哮喘的肺部急性炎症可以通过腹腔注射骨髓间充质干细胞培养上清液进行改善，能够有效减轻肺部炎症，提高机体肺功能。

通常而言，骨髓间充质干细胞主要通过以下两种方式对机体免疫功能进行调节，具体如下：①机体植入骨髓间充质干细胞后，细胞之间相互接触，使得细胞的某些功能被直接抑制^[38]。②骨髓间充质干细胞植入后免疫细胞通过旁分泌的方式，使得其功能能够被间接抑制。骨髓间充质干细胞培养上清液中含有骨髓间充质干细胞分泌出的多种细胞因子，肺部炎症细胞的功能会被这些细胞因子抑制，从而能够有效减轻炎症反应的程度，改善其肺部功能^[39-40]。支气管哮喘的肺部炎症反应与T淋巴细胞介导的免疫活动之间存在着紧密的联系，哮喘的发病机制涉及到抗原的摄取、递呈，并且能够共同参与T淋巴细胞的分化及相关炎症因子的释放。研究结果显示：支气管哮喘可能与白细胞介素17等细胞因子之间存在紧密联系。已有的研究结果显示：白细胞介素17水平在支气管哮喘气道组织中表达是上调的，而白细胞介素17又能够成功诱导中性粒细胞的聚集和活化，从而在支气管哮喘中发挥重要的作用。此外，骨髓间充质干细胞必须在炎症环境中才能够充分发挥和参与免疫抑制作用，它能够被不同的细胞因子诱发产生不同的免疫刺激，从而能够有效的通过骨髓间充质干细胞进行改善，但是这些均需要进一步研究和分析。本研究中尚存在一些不足，实验中并没有能够监测到注入腹腔的骨髓间充质干细胞培养上清液采用何种方式达到肺部炎症部位等，同时，受到研究时间以及样本容量等因素的限制，还存在一些缺陷和不足，还需要在今后的研究中予以不断完善。

综上所述，支气管哮喘小鼠腹腔内注入骨髓间充质干细胞培养上清液效果理想，能够减轻肺部炎性病理反应严重程度，降低肺泡灌洗液以及血清淋巴细胞相关的炎症指标水平，该方法能够作为一种新的治疗手段为治疗支气管哮喘提供思路和方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程