人肺鳞癌来源肺癌干细胞原代培养：数量及功能变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.016

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (32): 5172-5176.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.016

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人肺鳞癌来源肺癌干细胞原代培养：数量及功能变化

刘哲亮¹，邬娇²，王林纤³，陈跃军¹，吴冠宇¹，肖高明¹

中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，1胸外一科，2麻醉科，3检验科，湖南省长沙市 410013

出版日期:2015-08-06 发布日期:2015-08-06
通讯作者: 肖高明，博士生导师，主任医师，中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院胸外一科，湖南省长沙市 410013
作者简介:刘哲亮，男，1979 年生，湖南省祁东县人，汉族，2010 年中南大学湘雅医学院毕业，博士，主治医师，主要从事肺癌临床和肺癌干细胞基础研究。
基金资助:
湖南省自然科学基金资助项目(14JJ7092)；湖南省卫生厅科研计划项目(C2013-027)

Changes of lung cancer stem cells in patients with lung squamous carcinoma during primary culture

Liu Zhe-liang¹, Wu Jiao², Wang Lin-xian³, Chen Yue-jun¹, Wu Guan-yu¹, Xiao Gao-ming¹

1First Department of Thoracic Surgery, 2Department of Anesthesiology, 3Department of Laboratory, Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China

Online:2015-08-06 Published:2015-08-06
Contact: Xiao Gao-ming, Doctoral supervisor, Chief physician, First Department of Thoracic Surgery, Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China
About author:Liu Zhe-liang, M.D., Attending physician, First Department of Thoracic Surgery, Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hunan Province, No. 14JJ7092; the Science and Technology Research Plan of Hunan Provincial Health Department, No. C2013-027

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究显示可从肺癌细胞系中分离出肺癌干细胞，但对于从新鲜肺鳞癌标本中原代培养肺癌干细胞的报道较少。
目的：探索从新鲜肺鳞癌组织标本中分离肺鳞癌干细胞的可行方法，及其在原代培养过程中的数量和功能变化。
方法：借助胶原酶消化法、密度梯度离心法和Hoechst33342染料外排法初筛SP细胞，将初筛细胞置于条件培养基分离培养，后续应用流式细胞分析及分选技术，进一步分离纯化肺鳞癌干细胞。实验结合CD133和CD44鉴定目标细胞，计数第1代和第4代肺癌干细胞的CD133+、CD44+和CD133/CD44双阳性细胞数；检测第1代和第4代肺癌干细胞的单细胞克隆形成能力、平板集落形成能力和细胞球形成能力。
结果与结论：传代培养第4代肺癌干细胞的CD133+、CD44+和CD133/CD44双阳性细胞数明显增多，流式细胞检测结果显示，第4代和第1代的CD133+和CD133/CD44双阳性细胞表达率差异有显著性意义，第4代和第1代肺癌干细胞的CD44+细胞表达率差异无显著性意义。第4代细胞的单细胞克隆形成能力，平板集落形成能力和细胞球形成能力比均明显强于第1代肺癌干细胞。实验初步从肺鳞癌患者新鲜肺组织标本中分离培养并获取干细胞样肺鳞癌细胞，且在体外稳定快速扩增，为进一步研究肺鳞癌干细胞的异质性和耐药性奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肺癌干细胞, 原代培养, 细胞鉴定, 湖南省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that lung cancer stem cells can be isolated from the lung cancer cell lines, But there are few reports on in vitro isolation, culture and identification of lung cancer stem cells in patients with lung squamous carcinoma.
OBJECTIVE: To establish the feasible methods of harvesting lung cancer stem cells from fresh lung cancer tissues in patients with lung squamous carcinoma, and to investigate the alterations in cell number and function during primary culture.
METHODS: Side population cells were isolated by collagenase digestion, Ficoll density gradient centrifugation and Hoechst 33342 efflux properties. The isolated cells were isolated and cultured in conditioned medium. Flow cytometry method was used to detect lung cancer stem cells based on the cell surface markers CD133 and CD44, and the positive rates of CD133+, CD44+ and CD133+/CD44+ were recorded. The single cell clones assay, flat colony formation assay and the cell sphere formation assay were used to identify the stem-like characteristics of lung cancer stem cells between the first and fourth generations.
RESULTS AND CONCLUSION: The positive rates of CD133+, CD44+ and CD133+/CD44+ cells at the fourth generation were increased significantly, and the positive rates of CD133+ and CD133+/CD44+ cells at passage 4 were significantly higher than those at the first generation. The abilities of single cell clone formation, the flat colony formation and the cell sphere formation in the fourth-generation cells were greatly enhanced compared with the first-generation cells. Experimental findings showed that stem cell-like lung cancer cells were obtained from fresh lung cancer tissue in patients with lung squamous carcinoma, which stably and rapidly amplified in vitro, laying the foundation for the further study of the heterogeneity and drug resistance of lung cancer stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Lung Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Cells, Cultured

中图分类号:

R394.2

刘哲亮，邬娇，王林纤，陈跃军，吴冠宇，肖高明. 人肺鳞癌来源肺癌干细胞原代培养：数量及功能变化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(32): 5172-5176.

Liu Zhe-liang, Wu Jiao, Wang Lin-xian, Chen Yue-jun, Wu Guan-yu, Xiao Gao-ming. Changes of lung cancer stem cells in patients with lung squamous carcinoma during primary culture[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(32): 5172-5176.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2014年8月至2015年3月在中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院完成。

对象：选取肺鳞癌患者40例，男33例，女7例，年龄41-73岁，平均年龄(58.5±0.5)岁。病理分期以肺癌TNM分期(第7版)为依据，ⅠA期3例，ⅠB期5例，ⅡA期16例，ⅡB期13例，ⅢA期1例，ⅢB期2例。术中采集肺癌组织标本用于实验研究。

分离肺癌干细胞实验所用试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
RPMI 1640培养基、DMEM培养基、优质胎牛血清、青霉素/链霉素、Ⅱ型胶原酶、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子	美国Gibco公司
Hoechst33342和PI染料、Percoll密度梯度离心液	美国Sigma公司
人Fc受体封闭剂，小鼠抗人CD133-PE单克隆抗体及其同型对照抗体小鼠IgGI-PE	德国Miltenyi公司
小鼠抗人CD44-FITC单克隆抗体及其同型对照抗体小鼠IgGI-FITC	美国BD Bioseien公司
ACS Aria^TM Ⅱ型流式细胞分选仪	美国Becton and Dickinson公司
LSM510激光共聚焦显微镜	德国Zeiss公司
倒置相差显微镜Eelipse TE30和荧光显微镜EclipseE60	日本Nikon公司

方法：

肺癌组织处理：手术切除的新鲜肺癌组织，经快速病理检测证实为鳞癌，60 min内行细胞分离实验。用含 100 U/mL氨苄青霉素、100 g/L硫酸链霉素的DMEM反复冲洗并剔除坏死组织，用无菌剪刀反复剪切成约1 mm³大小的组织块。用含有400 U/mL Ⅱ型胶原酶的DMEM无血清培养基在体积分数为5%的CO₂培养箱中37 ℃振荡孵育消化4 h，通过100 μm细胞滤器。用70%/40%的Percoll密度梯度离心液(相对密度为1.077)重悬，于25 ℃以2 500 r/min离心20 min得单细胞悬液。

Hoechst33342染料外排法初筛SP细胞：将上述得到的单个细胞用DMEM(添加体积分数为2%胎牛血清、 10 mmol/L的HEPES缓冲液)调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，加入10 mg/L的PI染料，于37 ℃振荡孵育30 min，预冷的Hank’s溶液洗涤细胞，4 ℃低温离心后得单细胞悬液，流式细胞仪分选有活力细胞；再加入5 mg/L的Hoechst33342染料，于37 ℃振荡孵育90 min，预冷的Hank’s溶液洗涤细胞，4 ℃低温离心后得单细胞悬液，流式细胞仪分选SP细胞用于后续实验。

细胞培养：上述分选的SP细胞用DMEM培养基(添加体积分数为2%胎牛血清，20 μg/L表皮生长因子，20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)，在含体积分数为5%的CO₂培养箱中37 ℃培养，每3 d换新鲜培养基1次。当细胞生长到80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化后传代。培养的前4代细胞在传代时每次都保留部分细胞冻存于液氮中，备用于后续实验。

流式细胞仪分选及纯化肺癌干细胞：首先取第1代对数生长期的肺癌细胞，收集消化后的单个细胞，体积分数为10%胎牛血清/PBS洗涤2次，调整细胞浓度为3×10¹⁰ L^-¹，加入Fc受体封闭剂，4 ℃避光反应10 min。取两份上述经Fc受体封闭细胞分别加入CD133-PE和CD44-FITC抗体，另取一份上述经Fc受体封闭细胞同时加入CD133-PE和CD44-FITC抗体，将上述3份细胞在冰盒里避光孵育30 min，最后用体积分数为10%胎牛血清/PBS洗涤2次。用1 mL含体积分数为10%胎牛血清的PBS悬浮细胞，过40 μm的无菌筛网，放置冰上待分析分选。在同样的条件下标记同型对照抗体细胞组。应用FACSAriaⅡ流式细胞仪分析分选CD133⁺、CD44⁺及CD133/CD44双阳性细胞。取传代培养的第4代细胞，按上述检测方案，再次应用FACSAriaⅡ流式细胞仪分析分选CD133⁺、CD44⁺及CD133/CD44双阳性细胞，并将从第4代细胞中分选纯化的CD133/CD44双阳性细胞用于传代培养建立肺癌干细胞系。后续对比第1代和第4代细胞CD133⁺、CD44⁺及CD133/CD44双阳性细胞的阳性率。

肺癌干细胞功能检测实验：为减少系统误差，只选取16例ⅡA期患者的肺癌标本为研究对象。各实验均对第1代和第4代肺癌干细胞进行检测，并对比上述2代细胞的功能变化，采用的DMEM培养基中均添加体积分数为10%胎牛血清，20 μg/L表皮生长因子，20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子。

单细胞克隆形成实验：用流式细胞仪将单个细胞直接分选到96孔板中，每孔1个细胞用200 μL的DMEM培养基培养，每种细胞设120个复孔。分选后用倒置显微镜观察，标记只含有1个细胞的孔。以后每3 d换液1次，定期观察各孔中形成细胞克隆的特性，观测结果分为有或无单细胞克隆形成。于培养第10天统计有单细胞克隆形成的标记孔个数。

平板集落形成实验：调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1接种到6孔板中，每孔用2 mL的DMEM培养基培养，每种细胞设3个复孔。以后每隔3 d换液1次，并定期用倒置显微镜观察培养细胞形成集落状况。培养到第7天，当大部分集落增长的细胞数目大于100个时，于100倍显微镜随机观测15个视野并拍照计数集落个数。

细胞球形成实验：将细胞培养于超低黏附的96孔培养板中，每孔100个细胞，用200 μL的DMEM培养基培养。每隔2 d半量换液。半量换液时，待细胞球沉到底部，汲取表层旧的培养基，再加入等量新的培养基混匀。定期用倒置显微镜观察各孔中呈悬浮生长的细胞球并记录照相。每大于50个细胞的细胞团计数为1个细胞球。培养第7天于100倍显微镜随机观测15个视野并拍照计数。

主要观察指标：①流式细胞仪分选及计数结果。②单细胞克隆、平板集落及细胞球形成能力。

统计学分析：所有数据采用SPSS 11.5软件包进行分析。计量资料以x(_)±s表示，各组间数据的比较采用两样本成组t 检验，检验水准为α=0.05。

讨论

实验初步探讨了肺鳞癌组织来源的肺癌干细胞的原代细胞培养及建系方法。从新鲜肺癌组织中分离肺癌干细胞的重点在于减少非目标细胞的污染，难点在于提高目标细胞的纯度并尽量做到能够稳定传代培养。采用密度梯度离心法和Hoechst33342染料外排法初筛SP细胞^[9]，将初筛细胞置于条件培养基中，进行肺癌干细胞的分离培养。培养基中含有促进细胞分裂生长的因子表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子。细胞在此培养条件下能够不断传代增殖，在促进细胞增殖的同时能够保持细胞未分化状态。在这种培养基中，只有肿瘤干细胞能够进行生长增殖，这是一个筛选分离的过程，从而更大限度的富集了肿瘤干细胞。采用单细胞克隆形成实验，平板集落形成实验和细胞球形成实验对肺癌干细胞在培养过程中的富集特征进行鉴定，实验结果显示肺癌干细胞的上述功能在培养过程中都显著增强。采用CD133和CD44作为鉴定肺鳞癌来源肺癌干细胞的分子标记。CD133是一种细胞表面的糖蛋白，由5个跨膜结构域和两个大的糖基化的胞外环构成，它被单独或与其他指标相结合用于肺癌干细胞的鉴定分离^[10]。CD133及其糖基化抗原决定簇AC133已被用于正常人体造血干细胞、神经干细胞、肺癌、脑癌、结肠癌和胰腺癌干细胞的分选^[11-17]。有学者从小细胞肺癌和非小细胞肺癌患者的肺癌组织的单细胞悬液里分离得到CD133⁺细胞，这类细胞具有高致瘤性和自我更新能力^[18]。在小细胞肺癌和非小细胞肺癌组织中都发现CD133⁺肺癌干细胞，这表明CD133可作为肺癌干细胞广义的表面标志物。然而，CD133亚型和CD133糖基化的存在，会增加CD133和AC133的检测难度^[10]。CD44是细胞表面的一种跨膜糖蛋白，它同调控细胞黏附、增殖、生长、转移及活动度的蛋白关系密切^[19]，与恶性肿瘤的发生、发展关系密切。研究表明CD44在肺鳞癌中的表达率为89.5%^[20]。Leung等^[21]首先检测肺癌细胞株表达5种干细胞标志物(CD34、CD44、CD133、BMI1和OCT4)的情况，然后对CD44⁺细胞进行体外及裸鼠体内致癌实验，使用细胞株 H1299，结果发现CD44⁺细胞表达干细胞标志物OCT4/POU5F1、NSNOG、SOX2，而 CD44^-细胞则不表达上述标志物，新分选的CD44⁺细胞对顺铂更加耐药。Leung等^[21]还发现 CD44⁺细胞比CD44^-细胞更易形成肿瘤球。通过检测141例肺癌组织标本，50.4%的肺癌患者表达CD44⁺，而未见到CD34、CD133的表达，这说明CD44可能是肺鳞癌干细胞的标志物。本实验结合肺癌干细胞广义的表面标志物CD133和肺鳞癌干细胞标志物CD44，目的在于尽量提高肺鳞癌干细胞分选和鉴定的准确性。目前肿瘤干细胞模型已经获得广泛认可，肺癌干细胞与肿瘤侵袭、转移性进展、抵抗治疗和癌症复发密切相关^[22]。这些干细胞的获取途径包括：原发肿瘤的原代培养、人类肿瘤异种移植的小鼠或借助细胞标志物建立细胞系^[23]。由于肺癌的组织学亚型不同，导致肺癌干细胞的异质性存在差异^[24]，从而难以确定肺癌特异性干细胞标志物^[25]，这将阻碍将肺癌干细胞理念应用于肺癌的治疗策略^[26-27]。本实验初步从肺鳞癌患者新鲜肺组织标本中分离培养并获取干细胞样肺鳞癌细胞，且在体外稳定快速扩增，这将为进一步研究肺鳞癌干细胞的异质性和耐药性奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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