肾上腺髓质素对缺氧培养骨髓间充质干细胞表达凋亡相关蛋白的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.002

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (32): 5092-5096.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.002

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肾上腺髓质素对缺氧培养骨髓间充质干细胞表达凋亡相关蛋白的影响

姚月娴¹，王隽苼²，苏津自²，江金峰²，蔡文钦²

¹福建省立医院北院，福建省老年医院心内科，福建省福州市 350003；
²福建医科大学附属第一医院心内科，高血压研究所，福建省福州市 350005

出版日期:2015-08-06 发布日期:2015-08-06
通讯作者: 蔡文钦，硕士，主治医师，福建医科大学附属第一医院心内科，高血压研究所，福建省福州市 350005
作者简介:姚月娴，女，1983年生，福建省泉州市人，汉族，2010年福建医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事组织工程干细胞及老年心血管疾病研究。
基金资助:
the Youth Fund of Fujian Provincial Department of Health, No. 2011-1-15, 2011-1-32; the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2014J01433

Adrenomedullin effect on expression of apoptosis-related protein in bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxia

Yao Yue-xian, Wang Jun-sheng, Su Jin-zi, Jiang Jin-feng, Cai Wen-qin

¹North Branch, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou 350003, Fujian Province, China;
²Department of Cardiology, Fujian Institute of Hypertension Research, First Affiliated Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian Province, China

Online:2015-08-06 Published:2015-08-06
Contact: Cai Wen-qin, Master, Attending physician, Department of Cardiology, Fujian Institute of Hypertension Research, First Affiliated Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian Province, China
About author:Yao Yue-xian, Master, Attending physician, North Branch, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
Supported by:
the Youth Fund of Fujian Provincial Department of Health, No. 2011-1-15, 2011-1-32; the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2014J01433

摘要/Abstract

摘要：

背景：肾上腺髓质素基因转染能增强骨髓间充质干细胞在缺血、缺氧环境下的抗凋亡能力，但其机制尚未完全明确。
目的：观察肾上腺髓质素对骨髓间充质干细胞缺血、缺氧时Bax、Bcl-2和Caspase-3等凋亡相关调节蛋白表达的影响。
方法：贴壁法分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，缺氧、无血清培养0，3，6，9，12 h后用Western blot测定Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达以确定最佳缺氧时间。采用缺氧6 h为时间点，根据缺氧、无血清培养前是否进行肾上腺髓质素预处理分为对照组(未加入肾上腺髓质素)及肾上腺髓质素不同质量浓度组(1，10，100 μg/L)，然后采用Western blot测定Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达。
结果与结论：①无血清培养条件下缺氧0，3，6，9，12 h后骨髓间充质干细胞 Bax、Bcl-2表达均增加(P < 0.05)，缺氧6 h时Bax/Bcl-2比值、caspase-3蛋白达到最小(P < 0.05)。②缺氧6 h时，与1，10 μg/L肾上腺髓质素组相比，100 μg/L肾上腺髓质素组表达Bax蛋白、Caspase-3蛋白最低，Bax/Bcl-2比值最低，而表达Bcl-2蛋白最高(P < 0.05)。结果表明肾上腺髓质素能降低无血清、缺氧条件下骨髓间充质干细胞Bax/Bcl-2比值、Caspase-3蛋白表达，该效应存在剂量依赖性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 肾上腺髓质素, 骨髓间充质干细胞, 凋亡蛋白, 缺氧培养, 福建省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Adrenomedullin gene transfection can strength the anti-apoptotic ability of bone marrow mesenchymal stem cells under ischemia and hypoxia, but its mechanism is not yet clear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of adrenomedullin on the expression of apoptosis-related proteins, Bax, Bcl-2 and Caspase-3, in bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxia and ischemia.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells of Sprague-Dawley rats were isolated, cultured and purified, and then cultured in serum-free medium under hypoxic condition for 0, 3, 6, 9, 12 hours. Then, western blot assay was employed to detect the expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 so as to determine the optimal hypoxia time that was determined at 6 hours of hypoxia. Depending on whether adrenomedullin pretreatment was done, the cells were divided into control group (with no adrenomedullin pretreatment before hypoxia and ischemia) and adrenomedullin groups with different concentrations (1, 10, 100 μg/L). Afterwards, the expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 was detected by using western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After cultured in serum-free medium under hypoxia for 0, 3, 6, 9, 12 hours, the expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in bone marrow mesenchymal stem cells were increased (P < 0.05);
at 6 hours of hypoxia, the Bax/Bcl-2 ratio and Caspase-3 expression reached the minimum value (P < 0.05). (2) At 6 hours of hypoxia, the expression of Bax and Caspase-3 protein as well as Bax/Bcl-2 ratio became the lowest in the
100 μg/L group compared with the 1 and 10 μg/L groups, but the expression of Bcl-2 protein reached the peak (P < 0.05). These findings indicate that adrenomedullin can reduce the expression of Bax/Bcl-2 ratio and Caspase-3 protein in bone marrow mesenchymal stem cells cultured in serum-free medium under hypoxic conditions, which is in a dose-dependent manner.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Adrenomedullin, Apoptosis Regulatory Proteins

中图分类号:

R394.2

姚月娴，王隽苼，苏津自，江金峰，蔡文钦. 肾上腺髓质素对缺氧培养骨髓间充质干细胞表达凋亡相关蛋白的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(32): 5092-5096.

Yao Yue-xian, Wang Jun-sheng, Su Jin-zi, Jiang Jin-feng, Cai Wen-qin. Adrenomedullin effect on expression of apoptosis-related protein in bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(32): 5092-5096.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：实验于2012年1月至2014年10月在福建医科大学附属第一医院高血压研究所完成。

材料：

肾上腺髓质素干预后缺氧骨髓间充质干细胞凋亡相关蛋白表达实验所用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
胎牛血清	美国Gibco公司
L-DMEM 培养基、胰蛋白酶	美国Hyclone公司
抗Bax多克隆抗体、抗Bcl-2多克隆抗体、 Caspase-3多克隆抗体	美国CST公司
羊抗鼠二抗	碧云天公司
肾上腺髓质素	美国Sigma公司
细胞培养箱	美国Revco公司
倒置显微镜	日本Olympus 公司
混合气体	中国福州中铭气体公司

实验动物：雄性清洁级SD大鼠12只，体质量60-90 g，购自福建医科大学动物实验中心，许可证号：SYXK(闽) 2004-0007。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准^[9]。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定^[10]：将体质量60-90 g SD大鼠用100 g/L水合氯醛过度麻醉致死，无菌条件下获取股骨和胫骨，用10 mL注射器吸取含有体积分数10%胎牛血清的L-DMEM冲出骨髓，离心(1 000 r/min，10 min)，弃上清，用含体积分数20%胎牛血清的L-DMEM培养基3 mL重悬细胞，移至培养瓶中，置37 ℃体积分数5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养。24 h后首次更换培养基，以后每两三天换液1次，待细胞长至90%时，用2.5 g/L胰酶消化，以1︰3传代，继续培养，取第2代或第3代骨髓间充质干细胞进行以下实验。

细胞缺氧、无血清培养：①细胞长满至50%-60%时加入等量的无血清L-DMEM培养基。72 h后弃上清液，重新加入无血清L-DMEM，于体积分数95%N₂、体积分数5%CO₂饱和湿度37 ℃缺氧培养箱中孵育0，3，6，9，12 h。②细胞无血清同步化24 h后分别加入等体积无血清培养基(对照组)以及1，10，100 μg/L肾上腺髓质素，采用与上述相同的缺氧条件，缺氧培养6 h。

Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达：缺氧处理后，用RIPA裂解液裂解细胞200 μL/孔，冰上裂解20 min，辅以细胞刮均匀刮下细胞，边刮边裂解，20 min后用枪头吸取裂解液转移至EP管中，做好标记，BCA试剂盒蛋白定量后，进行一抗及二抗孵育，SDS-PAGE系统电泳转膜后加入一抗，包括Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、Caspase-3(1∶500)、β-actin(1∶4 000)，二抗为HRP标记抗体(1∶5 000)。加ECL发光液、曝光、显影。

主要观察指标：①不同缺氧时间对骨髓间充质干细胞表达凋亡相关蛋白的影响。②缺氧培养6 h，不同剂量肾上腺髓质素对骨髓间充质干细胞表达凋亡相关蛋白的影响。

统计学分析：采用SPSS 13.0软件包进行统计分析。计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用One-Way ANOVA分析，LSD法进行均数的多重比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

细胞凋亡过程涉及到一系列的分子调控机制，凋亡的发生与多种凋亡相关基因有关^[14-21]。Bcl-2家族是在细胞凋亡中有重要作用的一类蛋白质，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用，其中最有代表性的抑制凋亡基因是bcl-2和促进凋亡基因bax，并且bax是bcl-2发挥活性的主要调控因子，两者相互拮抗，当细胞受到促凋亡因素刺激时，Bax/Bcl-2比率将决定细胞的存亡，如Bcl-2蛋白表达减少或Bax蛋白表达增加时，促进细胞凋亡，而Bcl-2蛋白表达增加或Bax蛋白表达减少时，则抑制细胞凋亡^[22-23]。关于Bax/Bcl-2的具体作用机制目前尚未完全明确^[24]，能够诱导促凋亡物质细胞色素C的释放，进而影响Caspase-3的激活而引起细胞凋亡。本实验结果显示，无血清培养条件下缺氧0，3，6，9，12 h后骨髓间充质干细胞Bax、Bcl-2表达均增加(P < 0.05)，缺氧6 h时Bax/Bcl-2比值蛋白达到最小(P < 0.05)。缺氧6 h时，与1，10 μg/L肾上腺髓质素组相比，100 μg/L肾上腺髓质素组表达Bax蛋白最低，Bax/Bcl-2比值最低，而表达Bcl-2蛋白最高(P < 0.05)。 Caspase家族是介导细胞凋亡的一大类调节基因，其中Caspase-3是caspase家族级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用。研究表明Caspase-3缺陷小鼠出生后1-3周即死亡，表现出神经系统发育的极度异常。Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，激活的Caspase-3一方面通过水解特异性细胞蛋白直接导致凋亡，另一方面通过破坏DNA修复蛋白，如多聚ADP-核糖聚合酶，抑制DNA修复，协助凋亡的完成^[25-26]。本实验结果显示无血清培养条件下缺氧0，3，6，9，12 h后骨髓间充质干细胞表达Caspase蛋白达到最小(P < 0.05)。缺氧 6 h时，与1，10 μg/L肾上腺髓质素组相比，100 μg/L肾上腺髓质素组表达Caspase蛋白最低(P < 0.05)。综上所述，肾上腺髓质素可通过改善缺氧损伤后细胞活性，抑制细胞的凋亡，拮抗缺氧导致的Bcl-2/Bax表达比值降低，进而抑制Caspase-3的激活，从而保护缺氧对细胞的损伤，降低细胞凋亡比例，该效应在缺氧6 h达高峰，肾上腺髓质素基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗缺氧缺血损伤等心血管疾病可能具有较好的应用前景。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

肾上腺髓质素对缺氧培养骨髓间充质干细胞表达凋亡相关蛋白的影响

Adrenomedullin effect on expression of apoptosis-related protein in bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxia

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