血清骨桥蛋白及瘦素水平与股骨头坏死的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.20.001

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (20): 3117-3123.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.20.001

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血清骨桥蛋白及瘦素水平与股骨头坏死的相关性

闫志琨，赵玉峰，杨山，李会杰

河北医科大学第三医院，河北省骨科生物力学重点实验室，河北省石家庄市 050051

出版日期:2015-05-14 发布日期:2015-05-14
通讯作者: 李会杰，博士，主任医师，河北医科大学第三医院，河北省骨科生物力学重点实验室，河北省石家庄市 050051
作者简介:闫志琨，男，1984年生，山东省昌乐县人，汉族，河北医科大学在读硕士，主要从事股骨头坏死的诊断与治疗研究。
基金资助:
2014年河北省医学科学研究重点课题计划(ZD20140071)

Correlation of serum osteopontin and leptin levels with femoral head necrosis

Yan Zhi-kun, Zhao Yu-feng, Yang Shan, Li Hui-jie

Hebei Provincial Key Laboratory of Orthopedics and Biomechanics, Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China

Online:2015-05-14 Published:2015-05-14
Contact: Li Hui-jie, M.D., Chief physician, Hebei Provincial Key Laboratory of Orthopedics and Biomechanics, Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
About author:Yan Zhi-kun, Studying for master’s degree, Hebei Provincial Key Laboratory of Orthopedics and Biomechanics, Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
Supported by:
the Medical Science Research Project of Hebei Province in 2014, No. ZD20140071

摘要/Abstract

摘要：

背景：由于骨桥蛋白、瘦素均与骨代谢有着紧密的联系，因此股骨头坏死的发病可能与两者有关。
目的：分析股骨头坏死患者血清中骨桥蛋白及瘦素含量变化及相关性。
方法：选取31例股骨头坏死患者(ARCO分期Ⅱ期11例、Ⅲ期10例、Ⅳ期10例)及10例健康成年人(对照组)作为研究对象。采用酶联免疫吸附实验(ELISA) 测定血清中骨桥蛋白与瘦素水平。并进行统计学分析比较。
结果与结论：①股骨头坏死组血清骨桥蛋白水平明显高于对照组(P < 0.05)。②股骨头坏死组血清瘦素水平明显高于对照组(P < 0.05)。③股骨头坏死组和对照组的血清骨桥蛋白水平与瘦素水平相关均不显著。结果提示股骨头坏死患者血清骨桥蛋白与瘦素水平均升高，可能在其发病过程中发挥一定作用；股骨头坏死患者血清骨桥蛋白水平与瘦素水平相关不显著。

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 股骨头坏死, 血清, 骨桥蛋白, 瘦素, 骨代谢, 脂肪代谢

Abstract:

BACKGROUND: Both osteopontin and leptin are closely linked to bone metabolism, therefore, which may be related to the attack of femoral head necrosis.
OBJECTIVE: To study the correlation of serum osteopontin and leptin in the development of femoral head necrosis.
METHODS: Thirty-one patients with femoral head necrosis (case group, including 11 cases of ARCO II, 10 of ARCO III, 10 of ARCO IV) and 10 healthy adults (control group) were selected as the research objects. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the levels of osteopontin and leptin in serum followed by statistical analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: In the case group, the serum levels of osteopontin and leptin were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). But the serum levels of osteopontin and leptin showed no correlation between the two groups. These findings indicate that the serum levels of osteopontin and leptin are both elevated in patients with femoral head necrosis, which maybe play a role in the pathogenesis of femoral head necrosis, but there is no obvious correlation.

Key words: Femur Head Necrosis;, Osteopontin, Leptin, Metabolism

中图分类号:

R318

闫志琨，赵玉峰，杨山，李会杰. 血清骨桥蛋白及瘦素水平与股骨头坏死的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(20): 3117-3123.

Yan Zhi-kun, Zhao Yu-feng, Yang Shan, Li Hui-jie. Correlation of serum osteopontin and leptin levels with femoral head necrosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(20): 3117-3123.

图/表（结果） 6

2.1 参与者数量变化按意向性处理分析，所有股骨头坏死组与正常对照组的参与者都完成该试验，没有脱落。
2.2 两组基线资料分析股骨头坏死患者与正常对照的临床资料见表1；两组分组流程见图1。

2.3 股骨头坏死患者与正常对照血清骨桥蛋白及瘦素水平见表2。两组间血清骨桥蛋白及瘦素水平比较采用t 检验，结果显示：①股骨头坏死组血清骨桥蛋白水平高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。②股骨头坏死组血清瘦素水平高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 ARCO分期不同的股骨头坏死与对照组血清骨桥蛋白及瘦素水平的差异比较见表3。各组比较采用多个均数比较的方差分析(ARCO Ⅱ期、ARCO Ⅲ期、ARCO Ⅳ期分别规定为实验1组、2组、3组)，结合结果发现：①股骨头坏死ARCO各期组患者血清骨桥蛋白水平均明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；ARCO Ⅱ期与ARCO Ⅳ期组间的血清骨桥蛋白水平差异有显著性意义(P < 0.05)；ARCO Ⅱ期与ARCO Ⅲ期组，ARCO Ⅲ期与ARCO Ⅳ期的血清骨桥蛋白水平差异无显著性意义 (P > 0.05)。②股骨头坏死ARCO各期组血清瘦素水平高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；3组间血清瘦素水平差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 股骨头坏死患者与正常对照血清骨桥蛋白与瘦素水平相关性分析结果两组受试对象血清骨桥蛋白与瘦素水平关系见图2，3。血清骨桥蛋白与瘦素水平在股骨头坏死组相关不显著(r=0.281，P > 0.05)，在对照组相关不显著(r=-0.122，P > 0.05)。

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引言

股骨头缺血性坏死是由很多种不同病因造成的常见骨科疾病，表现为股骨头的血运遭到破坏后，引起软骨下骨变性、坏死，进而发生股骨头的结构改变，最终导致髋关节功能障碍^[1]。该病的发病机制尚不明确，有研究表明，骨代谢及脂肪代谢与股骨头缺血性坏死密切相关^[2]。
造成股骨头缺血性坏死的原因有很多，但最常见的有两类，分别是：①创伤性因素：如创伤致使的股骨颈骨折等。②非创伤性因素：如酗酒、使用大量的激素、高血脂、动脉硬化等。它的发病机制比较复杂，一些学者还为其提出了学说：如脂类代谢紊乱学说^[3]、骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化学说等等[4-5]。虽然不同病因的股骨头缺血性坏死的发病机制还未阐明，但至今已有许多研究发现，骨代谢和脂肪代谢与它的发生、发展过程有着紧密的联系^[1]，并且股骨头缺血及缺血后股骨头有活力成分的死亡和修复反应都是其共同的病理变化^[6]。
骨桥蛋白是一种高度糖基化及磷酸化的分泌型蛋白，它的生物学功能有诱导细胞黏附和迁移、免疫反应、骨骼钙化等，在抗炎、损伤修复，以及血管重塑的过程中骨桥蛋白都发挥着一定的作用^[7-8]。在骨基质矿化时，成骨细胞中还是DNA水平的OPN-R就开始增高，骨重建过程中，骨质线和骨膜板中均有较高浓度的骨桥蛋白，这说明骨桥蛋白在成骨细胞的黏附过程和矿化的中止过程中有着重要意义^[9]，同时骨质疏松病变的起始过程它也有参与[10]。
瘦素是ob基因编码的一种167个氨基酸组成的分泌型蛋白质，它可引起脂代谢紊乱^[1]，而脂类代谢紊乱是导致股骨头坏死的重要机制。
股骨头坏死的发病与骨桥蛋白及瘦素有无关系尚缺少研究，本实验拟探究血清骨桥蛋白及瘦素与股骨头坏死发病的相关性。

材料方法

设计：临床病例-对照研究。
时间及地点：于2014年2至8月在河北医科大学第三医院骨病科和实验中心完成。
对象：
股骨头坏死组：选取同期河北医科大学第三医院骨病科住院的股骨头坏死患者。
诊断标准：根据ARCO分期标准进行诊断[11]。
纳入标准：①符合ARCO分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 期的患者。②汉族。
排除标准：既往有高血压、冠心病、糖尿病等慢性病史。
最终纳入的股骨头坏死患者31例，其中男17例，女14例，中位年龄49.1岁，ARCOⅡ期11例，Ⅲ期10例，Ⅳ期10例。
对照组：利用随机化的方法从河北医科大学第三医院门诊体检中抽取健康者10人作为对照。排除最近使用过激素或降脂药物者。
两组受试对象民族均为汉族，没有任何血缘关系，既往未患高血压、冠心病、糖尿病等慢性疾病。本实验获得了河北医科大学第三医院伦理委员会批准，并且所有受试者都签署了知情同意书。
材料：

检测血清骨桥蛋白和瘦素水平的主要试剂及实验仪器：
试剂及仪器	来源
血清骨桥蛋白ELISA试剂盒、血清瘦素ELISA试剂盒	上海蓝基生物科技有限公司
TDL-5-A 型离心机	上海安亭公司
MDF-382E 型超低温保存箱	日本三洋公司
BCD 型电冰箱	海尔公司
HH-501型超级循环水箱	成都赛可隆机械设备有限公司
ANTHOS HTLL酶标仪	河北医科大学第三医院

方法：
标本采集：空腹抽取两组受试对象的外周静脉血4 mL，离心分离血清后保存于-80 ℃冰箱备用。
血清骨桥蛋白的检测：采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清骨桥蛋白。试剂盒批内变异CV%：< 9，批间变异CV%：< 10，回收率：94%-103%。
操作步骤：①取出试剂盒，于室温(20-25 ℃)放置 30 min。②取出酶标板，按照标准品的次序分别加入 50 μL的标准品溶液于空白微孔中。③空白孔中加入50 μL样品，空白对照加入50 μL PBS(pH 7.0-7.2)。④在各孔中加入100 μL的酶标记溶液(不含空白对照孔)。⑤将酶标板用封板膜密封后，37 ℃孵育反应1 h(在孵育箱中保持稳定的温度与湿度)。⑥充分清洗酶标板5次，保持各孔有充足的水压(浓缩洗涤液以1∶100的比例于蒸馏水稀释)。⑦酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。⑧各孔加入显色剂A 50 μL。⑨各孔加入显色剂B 50 μL。⑩37 ℃下避光反应10-15 min。若颜色浅可适当延长勿超过30 min。各孔加入50 μL终止液，终止反应。用酶标仪检测A值，将A值换算成浓度(单位为μg/L)。
血清瘦素的检测：采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清瘦素。试剂盒批内变异CV%：< 10，批间变异CV%：< 10，回收率：92%-101%。
操作步骤：①取出试剂盒，于室温(20-25 ℃)放置 30 min。②取出酶标板，按照标准品的次序分别加入100 μL的标准品溶液于空白微孔中。③空白孔中加入100 μL样品，空白对照加入100 μL PBS(pH 7.0-7.2)。④在各孔中加入 50 μL的酶标记溶液(不含空白对照孔)。⑤将酶标板用封板膜密封后，37 ℃孵育反应1 h(在孵育箱中保持稳定的温度与湿度)。⑥充分清洗酶标板5次，保持各孔有充足的水压(浓缩洗涤液以1∶100的比例于蒸馏水稀释)。⑦酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。⑧各孔加入显色剂A 50 μL。⑨各孔加入显色剂B 50 μL。⑩37 ℃下避光反应10-15 min。若颜色浅可适当延长勿超过30 min。?各孔加入50 μL终止液，终止反应。?用酶标仪检测A值，将A值换算成浓度(单位为μg/L)。
主要观察指标：①股骨头坏死患者与正常对照血清中骨桥蛋白和瘦素水平。②股骨头坏死患者与正常对照血清骨桥蛋白与瘦素水平相关性分析。
统计学分析：采用SPSS 13.0统计学软件进行分析比较。以x±s表示结果，采用方差分析+两两t 检验进行组间比较。以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨桥蛋白可由人体中骨细胞、成骨细胞及破骨细胞等多种细胞分泌，它也存在于正常体液里，如血清等。软骨内化骨、膜内化骨区域都含有丰富的骨桥蛋白[12]。
骨吸收时，骨桥蛋白对于破骨细胞与骨基质的黏附起到了促进作用^[13]，同时它还诱导着破骨细胞的破骨过程，所以骨桥蛋白对于骨质疏松症的发病机制来说，是一个重要的环节。Uernura等^[14]证实破骨细胞的活性可以通过骨桥蛋白与整合素avβ3间的相互作用来调节，其被骨桥蛋白诱导后，可以表达抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K及金属蛋白酶9(明胶酶B)，进而降解骨质。Ihara(2001)等^[15]也观察到骨内骨桥蛋白基因被敲除后，破骨细胞数量显著减少的同时，也明显减弱了甲状旁腺激素诱导的骨吸收作用。一些研究还认为，骨桥蛋白可以介导机械应力^[16]，进而引起骨代谢的变化。它可以增强破骨细胞的的移动和聚集，对其有趋化作用。成骨细胞在受到骨吸收刺激因子(如肿瘤坏死因子、白细胞介素等)作用后，会分泌骨桥蛋白，而破骨细胞通过分泌的骨桥蛋白与其表面的整合素avβ3相互作用，黏附到骨组织上，从而发挥溶骨作用^[17]。
通过免疫电镜可以发现，骨桥蛋白存在于生长的骨组织的矿化边缘，在钙化的软骨、动脉粥样斑块的钙化处等地方都可以发现骨桥蛋白。而在生理性与病理性的钙化组织中同样会出现骨桥蛋白，这说明其与矿化有着紧密的联系。并且目前已经发现钙化组织中的骨桥蛋白对于骨细胞的黏附、破骨细胞的功能、基质矿化功能均有调节作用^[18]。还有研究表明：骨重建过程中，由成骨细胞产生的骨桥蛋白储存于骨基质中^[19]，主要在骨形成早期表达，它与骨基质连接在一起的同时，可作用于编织骨向板层骨的转化过程。成骨细胞的分化和矿化组织的重建可被骨桥蛋白诱导和促进。
近年来，一些学者认为在类风湿关节炎、骨关节炎等多种关节疾病的发生发展过程中，骨桥蛋白也起着一定的作用[20]。类风湿关节炎患者的滑膜组织中有骨桥蛋白表达[21]，其主要分布在侵入关节软骨的血管翳上。骨关节炎患者的一些组织和体液中也发现了骨桥蛋白的表达，如关节软骨、滑膜、滑液等[22-24]。骨关节炎是一种退行性的关节疾病，它的病理改变主要是软骨细胞的代谢异常和退行性变^[25]。
一些研究表明，骨桥蛋白可以促进滑膜增生^[26-28]，进而破坏软骨，在骨关节炎的发病机理中发挥着关键作用。通过加强T 细胞的CD40L的表达，骨桥蛋白可以使T、B细胞的作用增强，从而促使B细胞的进一步增殖，调节体液免疫应答_^[29]。它可以通过上调基质金属蛋白酶13和减少组织中的蛋白多糖的方式，造成软骨的退行性变，同时软骨细胞的凋亡也可以被其诱导，进而破坏关节软骨^[30-31]。骨桥蛋白的表达水平会随着骨关节炎病情的逐渐加重而随之升高[32-36]。Yamaga等[37]研究发现外侧胫骨平台的损伤程度越重，以及关节疼痛程度越高，骨桥蛋白的表达水平也会增高，从而可以将骨桥蛋白作为反映关节软骨稳态和关节疼痛程度的一种指标。Jiang等[38]从基因学的研究表明，骨关节炎易感性及疾病的严重程度与骨桥蛋白基因-443C/T、-66T/G多态性体现为正相关的关系，骨关节炎的影像学程度越严重，凝血酶裂解的骨桥蛋白表达量越多，这说明对于骨关节炎易感性及严重程度，一定的骨桥蛋白基因多态性可作为它的分子标记。可见，在关节炎发展的多个阶段骨桥蛋白都担任着调节作用[39]。
在血管重塑，以及抗炎和损伤修复的过程中，骨桥蛋白也发挥着一定的作用，这引起了人们越来越多的关注^[40-41]。有学者发现骨桥蛋白参与了血管损伤部位新生内膜的形成，并在动脉粥样硬化、动脉钙化发生发展过程中担任着关键的角色^[42]。做为血管细胞的主要黏附及趋化因子，骨桥蛋白可以通过抑制动脉钙化参与血管重塑^[43]。
血管平滑肌细胞的异常增殖与迁移被认为是造成血管重塑的细胞学基础。血管平滑肌细胞在增殖时可以表达大量的骨桥蛋白^[44]，而骨桥蛋白也可以促进血管平滑肌细胞由血管中膜向内膜迁移^[45-46]。血管重塑时，血管外膜成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化和迁移，骨桥蛋白也起着一定的作用^[47]。一些研究还发现，骨桥蛋白还调节着血管重塑过程中的信号传递^[48-51]。有研究表明，骨桥蛋白含量过高，不但可以促进破骨，而且还会加速动脉粥样硬化的形成^[52]，这使得它可能成为骨质疏松与动脉硬化二者之间联系的枢纽。因此，可以认为，在骨代谢和血管重塑过程中，骨桥蛋白都发挥着重要的作用，但关于它的作用机制仍有待于进一步研究讨论。
瘦素主要产生于白色脂肪组织，也可被棕色脂肪，胃黏膜，骨骼肌，骨、软骨组织等分泌。当瘦素或其受体出现异常将会导致诸如肥胖、骨质疏松等相应的病理反应。
一些研究认为，瘦素对骨量有激发作用[53-56]。它通过介导体内脂量和骨量之间的相互均衡，在体脂储备、能量平衡以及骨代谢的联系中起着纽带作用[57]。也有学者推测骨质疏松和骨关节炎的发病机制中瘦素也起到了一定的作用。瘦素通过中枢和外周两方面来影响骨代谢[58]，从一个角度来讲，抑制下丘脑对骨形成，从另外一个角度来讲，通过提升成骨细胞骨保护素mRNA的表达，对破骨细胞的生成和分化起着间接抑制作用。
瘦素可以通过中枢性神经系统调控骨形成。有研究证实，在中枢神经系统中，瘦素是骨形成的抑制因子[59]。将瘦素注射在瘦素缺陷小鼠脑室内，对于骨量的改变起着完全逆转的作用[60]。由于瘦素的血浆浓度在脑室内几乎不受影响，从而说明通过中枢神经系统，瘦素可以调控骨形成。在野生型小鼠脑室内注射瘦素可致使骨量遗失，更进一步说明瘦素通过中枢性神经系统调节骨量是生理性的。根据以上研究可以引申出，假如骨重建的过程可以通过瘦素介导的下丘脑或神经中枢来调控，那么瘦素通过中枢性神经系统也可以调节骨质疏松等代谢性骨病。
瘦素对于成骨细胞发育及骨矿化的过程也起着关键作用[61]，它可以增多处于矿化阶段的成骨细胞中矿化小结的数量。将瘦素直接加入体外培养的成骨细胞中，可以看到对于胶原合成和细胞增殖、分化及矿化，瘦素能起到促进和刺激作用[62]，并且通过降低细胞凋亡，推动着成骨细胞转化为骨细胞。
通过抑制破骨细胞的生成，瘦素可能会影响骨重建的过程。Burguera等[63]研究发现瘦素在促进人间质细胞合成分泌护骨素骨保护素的同时，还抑制其分泌RANKL (ligand of receptor activator of NF-кB ligand)。破骨细胞的生成可以通过RANKL与RANK (receptor activator of NF-кB ligand)的结合来实现，而作为RANKL诱饵受体的骨保护素，可阻碍二者的结合。因此，不难发现，瘦素减少人外周血单核细胞中RANK表达的同时，可以增加骨保护素的蛋白和mRNA的表达[64]，并通过促进RANKL与骨保护素结合的方式抑制了破骨细胞的形成，进而抑制了骨吸收。有研究发现，瘦素还可以抑制骨丢失[65]，因为人单核细胞中白细胞介素1可以增高骨转换率，而瘦素可以促使合成与分泌白细胞介素1拮抗剂。
由此推论，骨代谢可能受到瘦素的影响，这使人们进一步认识了骨质疏松等代谢性骨病的病因，但其调节机制还需深人研究。
有关研究表明，酗酒和使用糖皮质激素均可导致脂肪肝和高脂血症，因为二者都可造成脂质代谢的紊乱，并且高脂血症还可以造成骨内微血管脂肪栓塞。脂栓学说认为，增多的脂肪物质在周围循环中聚集成脂肪球[66]，容易引起股骨头软骨下微血管的栓塞。脂栓学说得到了Janes追踪研究结果的支持[67]，该研究同时还提出高脂血症可以引起骨坏死的脂肪栓塞。还有研究发现长期使用皮质激素最终可致使股骨头坏死[68]，因为它会造成血液流变和血脂发生显著变化，从而增高了全血黏度和总胆固醇。酒精性股骨头坏死的发病机制可能是由于骨髓间充质干细胞分化能力改变及脂肪代谢紊乱也被某些研究学者提出[69]。
血小板高聚、高凝、低纤溶等都可以出现在股骨头缺血性坏死患者的血液变化中。而高脂血症对血液凝溶系统会造成影响，它会增加血液的黏滞性，使血液处于高凝低纤溶状态，降低股骨头的血液供应，进而产生股骨头坏死。股骨头缺血性坏死的发生、发展过程与血脂变化的关系被该研究从临床方面很好的证明了[70]。
Meunier等[71]研究发现激素可以通过增高破骨细胞的数量和活性，进而增加骨吸收，于此同时它对于成骨细胞来说也有抑制作用，可以减少蛋白和胶原。骨质疏松的发病机制之一就是激素，软骨下骨小梁在激素作用下会出现微细骨折，塌陷，从而压迫微血管而导致骨坏死。有关实验结果也说明骨坏死可由激素引起股骨头骨代谢变化造成[72]。
骨坏死和骨修复做为股骨头缺血性坏死的主要病理变化，与股骨头的血运有着紧密的联系。通过骨扫描， D’ Ambrosia发现了一个现象，在股骨头坏死早期其血运表现为减少，而在中晚期却会出血运部分恢复，并会形成新骨[73]。
本研究结果中股骨头坏死组的血清骨桥蛋白水平与瘦素水平显著高于正常对照组，根据ARCO分期将坏死组分为Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期，每个分期的坏死组中血清骨桥蛋白水平与瘦素水平也比正常对照组明显增高，但也不排除其他因素影响的可能。股骨头缺血性坏死患者会出现高脂血症，其血清瘦素和血脂水平明显高于正常人，而且血清瘦素与血脂水平在非创伤性股骨头坏死患者中表现为正相关的研究结论也支持了本研究结果[74]。
综上，可以说明血清中的骨桥蛋白和瘦素与股骨头坏死相关，它们在股骨头坏死的发病中起着一定的作用，可能是股骨头坏死的治疗靶点。但股骨头缺血性坏死是一个复杂的、多因素多途径共同作用的结果，其发病机制仍需进一步的深入研究。

血清骨桥蛋白及瘦素水平与股骨头坏死的相关性

Correlation of serum osteopontin and leptin levels with femoral head necrosis

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