不同浓度葛根素对体外培养成骨细胞的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究报道中药葛根素具有减少骨吸收、促进骨形成的作用。

目的：进一步验证中药葛根素对体外培养成骨细胞增殖的影响。

方法：取新生大鼠的颅盖骨进行成骨细胞培养，取第3代细胞分别加入浓度为0，20，40，80 和100 µmol/L的葛根素+含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基培养48 h。应用MTT法、碱性磷酸酶试剂盒及茜素红染色方法观察葛根素对体外培养成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性及矿化结节形成的影响。

结果与结论：与空白对照组比较，中药葛根素40，80 µmol/L 浓度组具有刺激成骨细胞增殖的作用；成骨细胞碱性磷酸酶活性检测显示葛根素在40 µmol/L 和 80 µmol/L浓度呈现明显的促进分化作用；在不同浓度葛根素中培养 14 d 可以清晰的观察到矿化组织形成，40 µmol/L 和 80 µmol/L葛根素培养的细胞矿化结节形成数量显著多于对照组。结果证实葛根素对体外培养的成骨细胞有明显的促进增殖作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织构建, 骨细胞, 葛根素, 成骨细胞, 碱性磷酸酶, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: Studies have reported that puerarin can reduce bone resorption and promote bone formation.

OBJECTIVE: To further explore the effects of puerarin at different doses on the proliferation of osteoblasts cultured in vitro．

METHODS: Osteoblasts isolated from the cranium of newborn rats were cultured in vitro, and then passage 3 cells were cultured in DMEM medium with the presence of 0, 20, 40, 80 and 100 µmol/L puerarin+10% fetal bovine serum for 48 hours. The viability of osteoblasts, alkaline phosphatase activity and mineral node formation were determined using MTT, alkaline phosphatase kit and alizarin red staining, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: The viability of osteoblasts treated with puerarin at either 40 or 80 μmol/L was significantly higher than that of the control group. Alkaline phosphatase activity and the number of mineral modules were significantly increased in osteoblasts cultured with puerarin at 40 or 80 μmol/L when compared with the untreated cells. These findings demonstrate that puerarin is able to promote osteoblast proliferation in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: Drugs, Chinese Herbal, Osteoblasts, Alkaline Phosphatase, Cell Proliferation

中图分类号:

R318

林树忠，刘君. 不同浓度葛根素对体外培养成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(11): 1658-1662.

Lin Shu-zhong, Liu Jun. Effects of different doses of puerarin on osteoblasts in vitro [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(11): 1658-1662.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] Kneser U, Schaefer DJ, Polykandriotis E,et al. Tissue engineering of bone: the reconstructive surgeon's point of view. J Cell Mol Med.2006;10:7-19.
[2] Smith LA, Liu XH, Ma PX. Nano-fibrous scaffolds for tissue engineering. Soft Matter. 2008;4:2144-2149.
[3] Wu HQ, Guo HN, Wang HQ, et al. Protective effect and mechanism of puerarin on learning-memory disorder after global cerebral ischemiareperfusion injury in rats. Chin J Integr Med.2009;15:54-59.
[4] Zhou F,Wang L,Liu PP,et al.Puerarin protects brain tissue against cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting the inflammatory response.Neural Regen Res. 2014;9(23): 2074-2080.
[5] Liu XJ,Mei ZG,Qian JP,et al.Puerarin partly counteracts the inflammatory response after cerebral ischemia/reperfusion via activating the cholinergic anti-inflammatory pathway.Neural Regen Res. 2013;8(34): 3203-3215.
[6] Wang XX, Wu J, Chiba H, et al. Puerariae radix prevents bone loss in ovariectomized mice.J Bone Miner Metab. 2003; 21:268-275.
[7] Blarir HC, Jordan SE, Peterson TG, et al. Variable effects of ty-rosine kinase inhibitor on avian osteoclastic activity and reduction of bone loss in ovariectiomized rats. J Cell Biochem. 1996;61:629-637.
[8] Langer R,Vacanti JP.Tissue engineering. Science.1993;260: 920-926.
[9] Habibovic P, Yuan H, van der Valk CM, et al. 3D microenvironment as essential element for osteoinduction by biomaterials. Biomaterials.2005;26:3565-3575.
[10] Viereck V, Gründker C, Blaschke S, et al. Phytoestrogen genistein stimulates the production of osteoprotegerin by human trabecular osteoblasts. J Cell Biochem 2002;84: 725-735.
[11] Liu XJ, Mei ZG, Qian JP,et al. Puerarin partly counteracts the inflammatory response after cerebral ischemia/reperfusion via activating the cholinergic anti-inflammatory pathway. Neural Regene Res.2013;8(34): 3203-3215.
[12] 黄彤,金邦荃,孙桂菊,等.葛根素对去卵巢大鼠骨密度和骨强度的改善[J].现代预防医学,2010,37(20):3894-3896
[13] 李海,金花,黄海玲,等.葛根素对去卵巢大鼠和铅中毒大鼠骨组织的影响[J].现代预防医学,2011,38(18):3742-3744.
[14] 詹秀琴,钱康琦,孙玉明.葛根素对MC3T3-E1细胞TGF-β1 Smad信号通路的作用[J].中成药,2013,35(6):1121-1124.
[15] 王海珍,负云飞,苗志勃.葛根素对大鼠成骨细胞增殖影响的体外实验研究[J].中医药导报,2013,19(3):77-79.
[16] 钱康琦,孙玉明,詹秀琴.蛋白免疫印迹杂交法研究葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad2/3蛋白表达的影响[J].长春中医药大学学报,2013,29(1):18-20.
[17] Liang J, Chen H, Pan W, et al.Puerarin inhibitrs caspasa-3 expression in osteoblasts of diabetic rats.Medicine RePort. 2012;5(6):1419-1422.
[18] 吴琳琳,王彦,郑雅心,等.葛根素对人牙周膜干细胞成骨分化的作用[J].中国美容医学,2013,22(10):1067-1071.
[19] 梁恒,邝志强,王攀攀,等.葛根素通过BMp-2调节去卵巢大鼠骨代谢[J].广州医学院学报,2012,40(3):1-4.
[20] 袁斯远,孔蓓蓓,盛彤,等.葛根素干预小鼠成骨细胞分化相关特征性蛋白mRNA的表达[J].中国组织工程研究, 2014,18(42): 6733-6736
[21] Notoya M, Tsukamoto Y, Nishimura H, et al. Quercetin, a flavonoid, inhibits the proliferation, differentiation, and mineralization of osteoblasts in vitro.Eur J Pharmacol. 2004; 485:89-96.
[22] Garcia T,Roman S,Jackson A,et al.Behavior of osteoblast, adipocyte, and myoblast markers in genome-wide expression analysis of mouse calvaria primary osteoblasts in vitro. Bone. 2002;31:205-211.
[23] Whyte MP. Hypophosphatasia and the role of alkaline phosphatase in skeletal mineralization. Endocr Rev. 1994;15: 439-461.
[24] 王昌,唐旭磊,陈克明,等,葛根素在体外对成骨细胞增殖和分化的影响[J].中国组织工程研究,2012,16(33):6102-6106.
[25] Maenoa S, Nikia Y, Matsumotoa H, et al.The effect of calcium ion concentration on osteoblast viability, proliferation and differentiation in monolayer and 3D culture. Biomaterials. 2005; 26:4847-4855.

引言

由创伤、炎症、肿瘤的外科治疗所导致的骨缺损特别是长段骨缺损，是除了由骨折所致的骨不连外，骨缺损引起功能丧失并影响生活质量的主要原因。

较小的骨缺损(通常指8 mm以下)，对于一个健康的非吸烟者来说，有可能自行愈合；但骨缺损过大，或者是在较小的骨头上的骨缺损，很难完全愈合，这就需要手术的干预，主要方法有4种：①骨移植。②人工骨。③组织工程骨。④骨搬运技术。其中骨移植是治疗骨缺损的主要方法^[1]。

自体骨移植是目前治疗骨缺损的“金标准”，也是较为常用治疗骨缺损的方法。自体骨移植通常是取自髂骨或者腓骨，带或者不带血运。自体骨移植有明显的优点，如无排斥反应、无污染、材料成本低、可以完全吸收、能诱导骨重建。但也有一定的缺点，如取骨的量较少、需要额外的取骨手术部位、增加了麻醉及外科治疗的时间、并发症相对较高、取骨部位可能有长达半年或更长时间的疼痛或不适感。

同种异体骨移植取自尸体骨，骨组织经过处理后已灭活，具有来源较自体骨丰富，免疫原性低，可提供结构支撑等优点；与自体骨比较，同种异体骨不能诱导骨愈合，同时也存在引起免疫反应、血源性疾病传播的可能性；异体骨移植则不受形状与数量的限制，可达到即时的骨量要求，其骨愈合过程与传统的长段自体移植骨基本类似。但是异体骨经各种灭菌处理，缺乏自身成骨作用，骨愈合过程缓慢且多存在不同程度的排斥反应，因此效果欠佳，目前已较少应用^[2]。

随着生物材料学的兴起，以生物材料来制作移植替代物的组织工程学正在不断地发展，因此组织工程骨修复骨缺损也成为当前的研究热点。组织工程骨是利用组织工程的手段，构建、培育活的骨组织，以修复或重建骨的结构。目前该技术仍处于研究阶段，尽管目前已取得较大进展，但离广泛生产及大量临床应用还存在一定的距离。

组织工程学的基本原理是将种子细胞在体外培养扩增后，接种于预先设计的负载生物活性因子的生物材料支架上，构成细胞-支架复合体，植入机体相应的病损部位。种子细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成具有正常生理结构与功能的新生组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的。

葛根素是从豆科植物野葛的根中所提取得到的一种异黄酮类化合物，具有活血化瘀、改善微循环、扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量等作用，是中医应用最早和重要的草药之一^[3-5]。

过去的几十年中，葛根素在中国用于治疗高血压、心绞痛^[6]。因其对骨质疏松有预防作用，近几年引起研究者的广泛关注^[7]。

有研究报道，葛根素具有减少骨吸收、促进骨形成的作用，而在刺激子宫组织增生不良反应方面远较雌激素轻。有研究人员通过体外培养成骨细胞，发现葛根素能促进成骨细胞的增殖、分化，提高碱性磷酸酶活性，增强骨保护素、mRNA的表达；对碱性磷酸酶活性也有较好的刺激作用，这可能提示葛根素具有提高成骨细胞骨形成的功能。因此，实验进行了葛根素对成骨细胞影响的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

材料方法

设计：分组对照细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年6月至2014年1月在西安交通大学医学院完成。

材料：

实验动物：取新生SD大鼠2只，雌雄各1只，体质量100 g左右，由西安交通大学医学院提供。在25 ℃标准环境房间中，用啮齿类动物饲料饲养。实验按照学校动物伦理委员会条例执行，并且与国家实验动物指导方针一致。

实验方法：

成骨细胞的分离和培养：取新生SD大鼠的颅骨，彻底剥离骨膜等软组织，置入含DMEM培养液的培养皿中修剪成1 mm×1 mm×1 mm的骨片^[5]。用适量0.1% Ⅱ型胶原酶与1 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液在37 ℃环境下振荡消化60 min，再加入等体积的胎牛血清终止消化，消化过程重复3次。收集消化液，在1 000 r/min条件下离心10 min使细胞沉淀。沉淀细胞放置于含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基和青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L的培养瓶中，放入37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱内培养。每两三天换液1次。待细胞长满后进行传代，使用第3代细胞进行实验。

用含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基将葛根素配制为：0，20，40，80和100 µmol/L，进行以后的实验。

细胞增殖实验：成骨细胞接种于96孔培养板中，孔中分别加入浓度为0，20，40，80和100 µmol/L的葛根素+含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基，在37 ℃，体积分数5% CO₂条件下培养；以未加葛根素培养的为空白对照。48 h后每孔加入5 g/L MTT 10 μL继续孵育4 h，取出，吸弃培养基后，加入100 μL二甲基亚枫，10 min后在酶标仪上测570 nm吸光度。

细胞分化实验：将成骨细胞接种于24孔培养板中，用含不同浓度葛根素溶液的培养基在37 ℃，体积分数5% CO₂条件下培养；以未加葛根素培养的为空白对照。48 h后细胞用PBS冲洗2次后，细胞经0.1%的Tri-ton X100，高频声波分裂，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min后用碱性磷酸酶试剂盒测试碱性磷酸酶活性。

细胞矿化功能测定：将细胞加入24孔培养板，加入含体积分数10%胎牛血清的培养基培养。24 h后换入葛根素浓度为0，20，40，80和100 µmol/L的含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基培养；以未加葛根素培养的为空白对照。2 d换液1次。培养14 d后在4 ℃下用体积分数95%乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗后用0.1%茜素红溶液染色30 min。在低倍镜下对各孔作矿化结节计数(矿化结节数/视野)。

主要观察指标：①葛根素对成骨细胞增殖的影响。②葛根素对成骨细胞分化的影响。③葛根素对矿化结节数的影响。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，P < 0.05 为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

讨论

骨缺损给医学和社会经济学带来了挑战。目前自体骨移植是治疗骨缺损的“金标准”，但是存在来源有限、供区损伤和疼痛的缺点。组织工程是骨再生的有效手段。这种新的治疗技术应用成骨诱导因子、骨种子细胞、生物相容性可降解性支架或三者的复合物诱导骨再生^[8]。

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化，是由具备多向分化潜能的间充质细胞分化而来，只有分化完全、成熟的成骨细胞才具有矿化能力，形成新骨。

成骨诱导因子能够促进组织工程骨的成骨能力。许多因素如激素、细胞因子与药物等，能够通过影响成骨细胞分化，进而影响新骨的形成。碱性磷酸酶是骨形成所必需的酶，是成骨细胞分化成熟和功能的早期标志，是最常见的评价骨形成的指标。成骨诱导性因子可调控骨种子细胞的增殖和分化，而且可以诱导骨前体细胞从宿主进入支架材料并向成骨细胞分化^[9]。

过去几年，异黄酮等天然雌激素样物质，因其对骨质疏松有潜在的预防和治疗作用而受到关注。研究显示，低浓度异黄酮促进成骨细胞和骨祖细胞的生长，而高浓度异黄酮抑制成骨细胞和骨祖细胞的生长，并且对成骨细胞和骨祖细胞分泌细胞因子产生影响^[10]。

黄延玲等^[11]发现葛根素对卵巢摘除大鼠的骨吸收具有抑制作用、对骨密度具有增加作用。黄彤等^[12]报道葛根素对去卵巢大鼠的骨密度和骨强度有较好的改善作用。李海等^[13]应用葛根素干预去卵巢大鼠和铅中毒大鼠发现葛根素能够明显提高骨组织骨钙、磷的含量以及使骨量增加，骨小梁变粗，变密等。

葛根素能够通过影响成骨细胞分化相关特征性蛋白mRNA表达，促进成骨细胞的成熟，可能是葛根素抗骨质疏松的重要的细胞分子机制之一。葛根素可通过细胞内转化生长因子β1 Smad信号通路促进骨形成，也可能通过雌激素受体介导促进成骨细胞增殖及骨形成，当浓度在 10^-10 mol/L至10^-7 mol/L浓度范围内时，葛根素对成骨细胞促增殖作用最强^[14-15]。

钱康琦等^[16]进一步发现，葛根素通过转化生长因子β1及Smad2/3信号转导途径促进成骨细胞增殖与分化，对骨量保持具有正向意义，能够增强成骨细胞分化的敏感性；葛根素亦可通过调控此信号通路影响成骨细胞的增殖和分化，揭示成骨细胞增殖分化的分子机制，为其促进骨质疏松的治疗提供了新的依据。此外，葛根素还可通过降低成骨细胞中Caspase-3的表达，而起到治疗糖尿病性骨质疏松症的作用^[11]。

吴琳琳等^[18]发现，葛根素能够促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化，在适当的浓度作用下，葛根素可有效地促进人牙周膜干细胞向成骨细胞分化，为其应用于口腔临床防治牙槽骨吸收提供了理论基础。此外，葛根素还可以提高实验动物体内的雌二醇水平和成骨细胞的增殖分化^[19]。

袁斯远等^[20]选用成骨细胞为研究对象，葛根素对其进行干预，并以雌二醇为阳性对照，观察葛根素对成骨细胞分化指标的影响，通过检测碱性磷酸酶、骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨钙素的 mRNA表达情况，从细胞分子水平研究葛根素对体外成骨细胞分化的影响。

在先期检测葛根素对成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性的实验研究中，检测了10^-7mol/L至10^-5mol/L葛根素对小鼠成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性，其中以10^-6mol/L葛根素作用最强。

另外，也有类似报道，葛根素在较低浓度(10^-5- 10^-8mol/L)下刺激骨形成的作用明显；在高浓度下，如10^-3-10^-4mol/L促进骨形成的作用不显著，甚至抑制之。而且在有效刺激骨形成的葛根素浓度中10^-6mol/L是最显著的。

骨组织的生成过程包括骨祖细胞的增殖和分化，以及最终形成矿化的细胞外基质。多数细胞因子、激素和生长因子通过调控成骨细胞的增殖和分化以控制骨的形成^[21]。

颅盖骨来源的成骨细胞已经研究了许多年，可限定成骨细胞的表型。主要优点为其来源于新生细胞，至少部分保留了胚胎细胞的分化表型^[22]。

本实验通过对成骨细胞应用一系列浓度葛根素，观察葛根素影响成骨的作用。结果显示，葛根素在特定的浓度下可明显促进成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性和矿化结节形成，说明葛根素可促进骨组织生长。

实验的第一步，通过MTT分析观察到葛根素可明显促进成骨细胞增殖，然而在100 μmol/L浓度时明显减少，说明高浓度葛根素具有细胞毒性。

碱性磷酸酶作为骨形成所必需的酶，是识别和评价成骨细胞分化程度的一个早期指标，是成骨细胞分化成熟和功能的标志，其表达随着细胞分化的发展而增强。它在骨的矿化作用中起重要作用，它的表达与成骨细胞的分化有关^[23]。其活性反映了成骨细胞的活性，因而是最常见的评价骨形成的指标。

碱性磷酸酶可催化分解有机磷酸释放无机磷，增加局部无机磷酸的浓度，促进矿化，所以碱性磷酸酶活性升高可为细胞间质含量改变做好准备，并且是启动矿化的必备条件。袁斯远等^[20]的实验结果显示，葛根素和雌二醇能够延长碱性磷酸酶mRNA表达时间，并能增加碱性磷酸酶其表达量。

王昌等^[24]的实验表明葛根素不仅能够刺激成骨细胞增殖，还对碱性磷酸酶活性有较好刺激作用。说明葛根素可以提高成骨细胞骨形成的功能。在细胞水平上观察到了葛根素对成骨细胞的直接作用，从而为葛根素临床防治骨质疏松症提供了理论和实验依据。

本实验中，成骨细胞培养的早期可检测到其碱性磷酸酶活性。在葛根素浓度为40 μmol/L和80 μmol/L时，成骨细胞的增长与碱性磷酸酶的活性呈正相关性。而20 μmol/L 浓度组的碱性磷酸酶活性与对照组无差异，100 μmol/L 组的酶活性低于对照组。因此，在限定的浓度下，葛根素可显著的影响碱性磷酸酶活性，使其合成增加，并刺激成骨细胞活性。

矿化作用是骨形成必不可少的过程，其发生在胶原基质成熟的晚期^[25]。实验中葛根素在40 μmol/L和80 μmol/L浓度时可促进矿化结节形成，证明葛根素在体外通过增加生长因子和基质蛋白的合成和分泌促进成骨分化。

综上所述，葛根素可作为成骨细胞生长因子，通过细胞增殖、碱性磷酸酶增量调节和矿化作用，促进成骨细胞生长。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：