骨髓造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在早期激素性股骨头坏死中的表现

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.003

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (11): 1652-1657.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.003

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骨髓造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在早期激素性股骨头坏死中的表现

赵振群¹，刘万林¹，龚瑜林²，白锐¹，王文选³

¹内蒙古医科大学第二附属医院，¹小儿骨科，³手足外科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030；²内蒙古医科大学附属医院风湿免疫科，内蒙古自治区呼和浩特市 010059

修回日期:2015-02-06 出版日期:2015-03-12 发布日期:2015-03-12
通讯作者: 刘万林，硕士，教授，硕士生导师，内蒙古医科大学第二附属医院小儿骨科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030
作者简介:赵振群，男，1984年生，内蒙古自治区赤峰市人，汉族，2011年内蒙古医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事小儿骨科临床工作与激素性股骨头坏死发病机理基础研究。并列第一作者：龚瑜林，女，1984年生，内蒙古自治区乌海市人，汉族，2011年内蒙古医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事风湿免疫性疾病的临床和基础研究。
基金资助:
内蒙古自治区自然科学基金项目(2011MS1101)

DNA oxidative damage to bone marrow hematopoietic cells and apoptosis of osteocytes in early avascular necrosis of the femoral head induced by glucocorticoids

Zhao Zhen-qun¹, Liu Wan-lin¹, Gong Yu-lin², Bai Rui¹, Wang Wen-xuan³

¹Department of Pediatric Orthopedics, ³Department of Hand and Foot Surgery, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ²Department of Rheumatology, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Revised:2015-02-06 Online:2015-03-12 Published:2015-03-12
Contact: Liu Wan-lin, Master, Professor, Master’s supervisor, Department of Pediatric Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Zhao Zhen-qun, Master, Attending physician, Department of Pediatric Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China Gong Yu-lin, Master, Attending physician, Department of Rheumatology, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China Zhao Zhen-qun and Gong Yu-lin contributed equally to this work.
Supported by:
the Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 2011MS1101

摘要/Abstract

摘要：

背景：激素导致股骨头缺血坏死是一个复杂的生物学过程，其发病机制仍不清楚，探明其病因学机制，仍然是该领域研究的重点。

目的：观察骨髓造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在早期激素性股骨头缺血坏死中的病理改变。

方法：4月龄日本大耳白兔40只，随机数字表法分为4组，每组10只。其中3组兔分别给予激素联合内毒素、单纯激素、单纯内毒素处理，另1组做空白对照。分别于最后一次给药后第2，4周处死实验动物，每次每组5只。光镜下计数各组兔股骨头空缺骨陷窝、电镜观察骨细胞形态变化、TUNEL法检测骨细胞凋亡、免疫组织化学法检测骨髓造血细胞DNA氧化损伤。

结果与结论：与其他3组比较，激素联合内毒素组第2，4周空缺骨陷窝率、骨髓造血细胞DNA氧化损伤率及第4周骨细胞凋亡率均显著增高(P < 0.01)；其他3组之间空缺骨陷窝率、骨髓造血细胞DNA氧化损伤率及骨细胞凋亡率各指标比较差异无显著性意义。激素联合内毒素组空缺骨陷窝率与细胞凋亡率呈正相关(r=0.793)。结果提示在激素性股骨头缺血坏死早期，骨髓造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡参与了激素性股骨头缺血坏死的病理变化过程，前者先于后者发生，骨细胞的死亡方式为凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 糖皮质激素, 股骨头, 骨坏死, 凋亡, DNA氧化损伤, 骨髓造血细胞, 骨细胞, 内蒙古自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Hormones-induced avascular necrosis of the femoral head is a complex biological process, and its pathogenesis remains unclear. To prove its etiologic mechanism is still the focus of research in this field.

OBJECTIVE: To discuss the pathological changes of hematopoietic cells and osteocytes in early avascular necrosis of the femoral head induced by glucocorticoids .

METHODS: Forty Japanese white rabbits, 4 months old, were randomly divided into glucocorticoids+ lipopolysaccharide group (combination group), glucocorticoids group, lipopolysaccharide group and blank control group, with 10 rabbits in each group. Five animals from each group were sacrificed at 2 and 4 weeks after the last dosing, respectively. Vacant bone lacunae were counted under optical microscope, morphology of osteocytes was observed under electron microscope, osteocyte apoptosis was assay by TUNEL, and DNA oxidative damage to hematopoietic cells was detected by immunohistochemistry.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the other three groups, the rates of vacant lacunae and DNA oxidative damage to hematopoietic cells in the combination group were significantly higher at 2 and 4 weeks after treatment as well as the apoptosis rate of osteocytes at 4 weeks after treatment (P < 0.01); while there were no statistical differences between the other three groups. In the combination group, the vacant rate of bone lacunae and apoptosis rate of osteocytes were positively correlated (r=0.793). These findings indicate that DNA oxidative damage to hematopoietic cells and apoptosis of osteocytes participate in the pathological changes of early avascular necrosis of the femoral head induced by glucocorticoids. The former is prior to the latter, and the death manner of osteocytes is apoptosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Femur Head Necrosis, Glucocorticoids, Apoptosis

中图分类号:

R318

赵振群，刘万林，龚瑜林，白锐，王文选. 骨髓造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在早期激素性股骨头坏死中的表现[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(11): 1652-1657.

Zhao Zhen-qun, Liu Wan-lin, Gong Yu-lin, Bai Rui, Wang Wen-xuan. DNA oxidative damage to bone marrow hematopoietic cells and apoptosis of osteocytes in early avascular necrosis of the femoral head induced by glucocorticoids[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(11): 1652-1657.

图/表（结果） 3

2.1 空缺骨陷窝率 第2周及第4周时，激素联合内毒素组空缺骨陷窝率均明显高于其他3组，该3组之间差异无显著性意义(图1)。

第2周时，激素联合内毒素组与其他3组相比差异有显著性意义(经方差分析，F=46.775，P=0.000 1；经LSD检验，均P=0.000)；单纯激素组与单纯内毒素组相比(P=0.477)，单纯激素组与空白组相比(P=0.243)，单纯内毒素组与空白组比较(P=0.634)，差异均无显著性意义(P > 0.05)。

第4周时，激素联合内毒素组与其他3组相比差异有显著性意义(经方差分析，F=83.915，P=0.000 1；经LSD检验，均P=0.001)；单纯激素组与单纯内毒素组相比(P=0.584)，单纯激素组与空白组相比(P=0.597)，单纯内毒素组与空白组比较(P=1.000)，差异均无显著性意义(P > 0.05)。见表1。

2.2 骨细胞凋亡率 第2周时，4组间骨细胞凋亡率差异无显著性(F=0.281，P=0.838)；第4周时，激素联合内毒素组骨细胞凋亡率均明显高于其他3组(P < 0.01)，该3组间差异无显著性意义(图2)。

第4周时，激素联合内毒素组与其他3组相比差异有显著性意义(经方差分析，F=140.299，P=0.000 01；经LSD检验，均P=0.000 5)；单纯激素组与单纯内毒素组相比(P=0.745)，单纯激素组与空白组相比(P=0.828)，单纯内毒素组与空白组比较(P=0.913)，差异均无显著性意义(P > 0.05)。见表1。

2.3 骨髓造血细胞DNA氧化损伤率 第2，4周时，激素联合内毒素组骨髓造血细胞DNA氧化损伤率明显高于其他3组(P < 0.01)，该3组间差异无显著性意义(图3)。

第2周时，激素联合内毒素组与其他3组比较差异有显著性意义(经方差分析，F=38.178，P=0.000；经LSD检验，均P=0.000 01)。单纯激素组与单纯内毒素组相比，P=0.874，单纯激素组与空白组相比，P=1.000，单纯内毒素组与空白组比较，P=0.758。第4周时，激素联合内毒素组与其他3组相比差异有显著性意义(经方差分析，F= 189.563，P=0.000，经LSD检验，均P=0.000 1，单纯激素组与单纯内毒素组相比(P=0.820)，单纯激素组与空白组相比(P=1.000)，单纯内毒素组与空白组比较(P=0.975) 差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4 空缺骨陷窝与骨细胞凋亡之间关系 第4周时，激素联合内毒素组空缺骨陷窝率与骨细胞凋亡率呈明显正相关，r=0.793 (P < 0.01)，回归方程为Y(∧)=2.200X-39.033，其中骨细胞凋亡率为自变量x，空缺骨陷窝率为因变量y，提示早期激素性股骨头坏死与细胞凋亡相关(图4)。其余各时间点各组内空缺骨陷窝率与骨细胞凋亡率无相关关系。

2.5 电镜改变 第2周时，激素联合内毒素组中股骨头切片表现为骨细胞细胞核固缩，染色质边集、出现线粒体空泡、可见突起形成，胞质内有大量溶酶体及分泌颗粒，同时有骨髓内出血

第4周时，激素联合内毒素组中股骨头切片表现为细胞膜完整，细胞核固缩，染色质边集，细胞器消失，凋亡小体出现。第4周时，空白组骨细胞细胞膜完整，细胞核内染色质分布均匀，细胞器清晰可见(图5)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：2012年12月于内蒙古医科大学分子病理实验室(内蒙古自治区重点实验室)完成。

材料：

实验动物：4月龄健康日本大耳白兔40只，雌雄不限，体质量(2.72±0.35) kg，标准饮食，单笼喂养。由北京富豪动物养殖中心提供，合格证编号：20120137。

实验方法：

实验分组及处理：随机数字表法将动物随机分成4组，每组10只。分别于最后一次注射后第2，4周将动物空气栓塞法处死，每次每组5只，在相对无菌的条件下取双侧股骨头。

标本制作：股骨头一部分以 5%戊二醛溶液固定(制备电镜切片用)，另外一部分以体积分数10%甲醛溶液固定(制备免疫组化检测切片用)，固定时间为24 h，均以15%乙二胺四乙酸(EDTA)微波脱钙1周。

苏木精-伊红染色：常规石蜡包埋，切片。二甲苯脱蜡2次，5 min/次；体积分数95%乙醇、95%乙醇、80%乙醇梯度脱水，1 min/次；蒸馏水冲洗；苏木精液染色10 min；稍水洗30 s；促蓝液返蓝30 s；流水冲洗15 min；蒸馏水过洗 2 s；0.5%曙红液染色3 min；二甲苯透明；中性树胶封固。

透射电子显微镜标本制备：取5%戊二醛固定的股骨头组织，于股骨头软骨下0.2-0.3 cm切取1 mm×1 mm×1 mm大小骨块，5%硝酸脱钙2-3 h，1%四氧化锇后固定1 h，梯度乙醇脱水，EPON 812(环氧树脂)包埋，包埋剂与无水乙醇分别以1∶1，2∶1，3∶1浓度混合逐层置换无水乙醇，包埋，37 ℃恒温箱24 h浸透，60 ℃烤箱聚合48 h，瑞典LKB2800型超薄切片机制备50 nm超薄切片，染色(醋酸双氧铀、柠檬酸铅双染色)。

TUNEL法检测骨细胞凋亡：标本预处理：将制备好的石蜡组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗2次，5 min/次。用无水乙醇洗2次，3 min/次。用体积分数95%和75%乙醇各洗1次，3 min/次。用PBS洗5 min加入蛋白酶K溶液 (20 mg/L)，于室温水解15 min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，2 min/次，色缸中加入含体积分数2%过氧化氢的PBS，于室温反应5 min。用PBS洗2次，5 min/次。用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1-5 min。用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加TdT酶反应液54 μL，置湿盒中于37 ℃反应1 h。将切片置于染色缸中，加入已预热到37 ℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37 ℃保温30 min，每10 min将载玻片轻轻提起和放下1次，使液体轻微搅动。

组织切片用PBS洗3次，5 min/次，后直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30 min。用PBS洗4次，5 min/次。在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05%DAB溶液，室温显色6 min。用蒸馏水洗4次，前3次1 min/次，最后1次5 min。于室温用甲基绿进行复染10 min。用蒸馏水洗3次，前2次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30 s。依同样方法再用100%正丁醇洗3次。用二甲苯脱水3次，2 min/次，封固、干燥后，OLYMPUS显微镜下观察并记录实验结果。

单克隆抗体N45.1免疫组织化学法检测：氧化性DNA 损伤在生物体细胞老化、死亡的发生过程中起重要作用，自由基一直被认为是引起DNA损伤的主要因素之一。羟自由基和超氧阴离子能直接与DNA分子反应，导致DNA链断裂、碱基修饰和DNA蛋白交联等氧化性DNA损伤，其中最主要的致突变性损伤反应是C-8上鸟嘌呤与胸腺嘧啶碱基颠换性突变，产生8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)，单克隆抗体N45.1能够与8-羟基脱氧鸟苷特异性结合。

切片置于体积分数0.3%H₂O₂中37 ℃下孵育30 min；0.1%胰蛋白酶消化15 min；加入单克隆抗体N45.1一滴，37 ℃下孵育2 h；DAB显色5 min；苏木精-伊红复染。

空缺骨陷窝率计算：在100倍放大倍率下，随机选5个视野，每个视野计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，求出空缺骨陷窝占骨陷窝的百分数，即为空缺骨陷窝率。正常成年家兔股骨头软骨下区空缺骨陷窝率为8%-12%，同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过此数目即提示骨坏死^[13]。

骨细胞凋亡率计算：TUNEL染色阳性细胞着色定于胞核内，呈棕褐色或棕黄色，少数胞浆内出现阳性颗粒。在100 倍放大倍率下，随机选5个视野，每个视野计数50个骨细胞，分别数出凋亡骨细胞数，求出凋亡骨细胞占骨细胞的百分数，即为骨细胞凋亡率。

骨髓造血细胞DNA氧化损伤率计算：骨髓造血细胞包括造血干细胞、髓样干细胞、淋巴样干细胞及其分化的细胞。在100倍放大倍率下，随机选5个视野，每个视野计数50个骨髓造血细胞，分别数出DNA氧化损伤骨髓造血细胞数，求出DNA氧化损伤骨髓造血细胞数占骨髓造血细胞的百分数，即骨髓造血细胞DNA氧化损伤率。

主要观察指标：股骨头标本苏木精-伊红染色观察，计算空缺骨陷窝率，骨细胞凋亡率，骨髓造血细胞DNA氧化损伤率。

统计学分析：数据均以x(_)±s表示，用SPSS 13.0软件进行统计分析。

4组间空缺骨陷窝率、骨髓造血细胞DNA氧化损伤率、骨细胞凋亡率的统计检验采用方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD检验。空缺骨陷窝率与细胞凋亡率相关分析采用线性相关，-1≤r≤+1表示两个变量呈直线相关关系，r为正数表示正相关，r为负数表示负相关。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

作者前期研究结果表明，对家兔静脉注射大肠杆菌内毒素模拟出系统的前凝血状况后再应用大剂量激素，可诱导出典型的激素性股骨头缺血坏死的动物模型^[14]，但为观察单纯激素或单纯大肠杆菌内毒素是否对骨细胞凋亡及骨髓造血细胞氧化损伤产生干扰，故将实验动物分成激素联合内毒素组、单纯激素组、单纯内毒素组、空白组。实验结果显示，各时间点单纯激素或单纯大肠杆菌内毒素并未引起骨细胞凋亡及骨髓造血细胞氧化损伤。Mutijima等^[15]发现过量激素的应用能够影响骨髓中成骨细胞和破骨细胞形成机制而减少骨的成形率和骨的密度，同时可以诱导成熟的成骨细胞和骨细胞的凋亡增加，并且在外伤性、特发性、酒精性股骨头坏死中上述两类细胞的凋亡也有增高。在单纯激素对骨细胞凋亡的影响方面，本实验结果与之不同，可能与激素剂量、实验检测时间点、在体内与体外环境不一致相关。

激素性股骨头缺血坏死发病机制仍不清楚，理论学说分散，对于骨细胞的死亡方式是坏死还是凋亡尚存在争议。细胞凋亡作为一种主动的细胞死亡的方式，在许多方面与坏死有显著的差别。近年，国内外许多学者认为激素性股骨头缺血坏死与骨细胞和成骨细胞的凋亡关系密切^[16-18]。

Calder等^[19]认为，某些药物及其代谢产物可以对股骨头中的骨细胞及成骨细胞就毒副作用并导致细胞凋亡。激素性或酒精性股骨头坏死患者的股骨头中存在广泛的骨细胞及成骨细胞凋亡，而非细胞坏死，细胞凋亡与内皮细胞氧化氮自由基合成酶/诱生型一氧化氮合成酶表达异常相关。细胞坏死与细胞凋亡有本质区别，但又有联系，细胞凋亡在一定情况下可以转化为细胞坏死^[20]。本实验结果表明，在第4周时，激素联合内毒素组中骨细胞凋亡明显增加，证实了骨细胞的死亡方式为凋亡，与近期国内外研究结果相同。

激素可以导致机体发生氧化应激，产生大量的氧自由基。氧自由基化学性质活泼，破坏机体的正常氧化/还原状态，造成生物大分子的氧化损伤，干扰正常的生命活动，形成严重的氧化应激状态，而机体氧化损伤的后果之一就是诱导细胞凋亡。机体氧化应激时，亦可引起脂质、蛋白质和DNA发生过氧化，可引起DNA单链破坏及断裂^[21]。DNA氧化性损伤在生物体细胞老化、死亡的发生过程中起重要作用，自由基一直被认为是引起DNA损伤的主要因素之一^[22]。骨髓造血细胞作为股骨头骨组织的重要组成部分，其病理改变势必影响股骨头缺血坏死的发生发展，本研究发现，骨髓造血细胞DNA氧化损伤发生于骨细胞凋亡之前，是激素性股骨头缺血坏死的早期分子事件。

综上，实验结果发现在激素性股骨头缺血坏死早期，骨髓造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡参与了激素性股骨头缺血坏死的病理变化过程，前者先于后者发生，并且骨细胞的死亡方式为凋亡。

实验尚存在以下不足：应增加样本含量，实验时间点间隔应进一步缩短，以明确骨髓造血细胞DNA氧化损伤及骨细胞凋亡的系列变化；骨髓造血细胞发生DNA氧化损伤后对股骨头内微循环的影响需进一步明确。如何减少或消除骨细胞凋亡与骨髓造血细胞发生的诱导因素可能为激素性股骨头缺血坏死的防治关键。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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骨髓造血细胞DNA氧化损伤与骨细胞凋亡在早期激素性股骨头坏死中的表现

DNA oxidative damage to bone marrow hematopoietic cells and apoptosis of osteocytes in early avascular necrosis of the femoral head induced by glucocorticoids

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