荧光磁性纳米粒子标记三维培养系统中的脂肪间充质干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.008

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (1): 44-48.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.008

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荧光磁性纳米粒子标记三维培养系统中的脂肪间充质干细胞

吕品雷¹，苏约翰¹，崔大祥²，汪铮¹

1上海交通大学医学院附属仁济医院消化疾病研究所，上海市 200001
2上海交通大学微纳科学技术研究院纳米生物工程研究室，上海市 200240

修回日期:2014-11-29 出版日期:2015-01-01 发布日期:2015-01-01
通讯作者: 汪铮，博士，副研究员，上海交通大学医学院附属仁济医院消化疾病研究所，上海市 200001；崔大祥，博士后，教授，上海交通大学微纳科学技术研究院纳米生物工程研究室，上海市 200240
作者简介:吕品雷，男，1989年生，江苏省涟水县人，汉族，上海交通大学医学院在读硕士，主要从事干细胞相关研究。并列第一作者：苏约翰，男，1985年生，上海市人，汉族，2011年华东理工大学毕业，硕士，主要从事干细胞相关研究。
基金资助:
上海市科委浦江人才计划项目(09PJ140730)；国家自然科学基金项目(30971468)

Fluorescent supermagnetic nanoparticles-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells in the three-dimensional culture system

Lv Pin-lei¹, Su Yue-han¹, Cui Da-xiang², Wang Zheng¹

1Institute of Digestive Diseases, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200001, China
2Department of Bio-Nano Science and Engineering, Institute of Micro-Nano Science and Technology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

Revised:2014-11-29 Online:2015-01-01 Published:2015-01-01
Contact: Wang Zheng, M.D., Associate researcher, Institute of Digestive Diseases, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200001, China；Cui Da-xiang, M.D., Professor, Department of Bio-Nano Science and Engineering, Institute of Micro-Nano Science and Technology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
About author:Lv Pin-lei, Studying for master’s degree, Institute of Digestive Diseases, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200001, China; Su Yue-han, Master, Institute of Digestive Diseases, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200001, China Lv Pin-lei and Su Yue-han contributed equally to this work.
Supported by:
the Pujiang Talent Project of Shanghai Science and Technology Commission, No. 09PJ140730; the National Natural Science Foundation of China, No. 30971468

摘要/Abstract

摘要：

背景：荧光磁性纳米粒子具有量子点和磁粒子的双重特质，生物相容性好，能够被胞吞入细胞质高效地标记细胞。
目的：验证荧光磁性纳米粒子标记人脂肪间充质干细胞的可行性。
方法：抽脂术抽取健康人脂肪组织，采用Ⅰ型胶原酶消化法分离，贴壁培养纯化人脂肪间充质干细胞。取第6代脂肪间充质干细胞与荧光磁性纳米粒子孵育过夜，采用普鲁士蓝染色、激光共聚焦显微镜检测体外标记细胞情况，荧光成像系统观察荧光磁性纳米粒子标记的干细胞体内示踪效果。
结果与结论：普鲁士蓝染色显示荧光磁性纳米粒子以蓝色颗粒的形式分散于脂肪间充质细胞胞质中。激光共聚焦显微镜观察显示人脂肪间充质干细胞的细胞核被Hoechest33258染成蓝色，细胞质被标记成绿色；荧光成像结果表明标记的人脂肪间充质干细胞具有很好的成像效果。结果提示荧光磁性纳米粒子可以作为示踪剂在体外标记人脂肪间充质干细胞，为脂肪间充质干细胞的移植转化研究提供新方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 荧光磁性纳米粒子, 人脂肪间充质干细胞, 荧光成像, 示踪剂, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Fluorescent magnetic nanoparticles with the properties of quantum dots and magnetic particles have good biocompatibility, and can label cells effectively through endocytosis.
OBJECTIVE: To validate the feasibility of fluorescent magnetic nanoparticles in labeling human adipose-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Healthy human adipose tissue was extracted and adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated in vitro by type I collagenase digestion. Passage 6 cells were incubated with the fluorescent magnetic nanoparticles overnight. Prussian blue staining and laser scanning confocal microscope were used to observe labeled adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro after co-culturing with fluorescent magnetic nanoparticles. The tracing effect of labeled adipose-derived mesenchymal stem cells in vivo was detected by fluorescence imaging system.
RESULTS AND CONCLUSION: Prussian blue staining showed that the fluorescent magnetic nanoparticles dispersed in the cytoplasm of adipose-derived mesenchymal stem cells in the form of blue particles. Under the laser scanning confocal microscope, the nuclei of adipose-derived mesenchymal stem cells were dyed blue by Hoechest33258, and the cytoplasm was dyed green. The fluorescence imaging results showed that labeled human adipose-derived mesenchymal stem cells had good imaging results. Therefore, as an efficient tracer, the fluorescent magnetic nanoparticles can label human adipose-derived stem cells in vitro and provide a new method for transplantation and transformation of adipose-derived mesenchymal stem cells.

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Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Biological Markers

中图分类号:

R394.2

吕品雷，苏约翰，崔大祥，汪铮 . 荧光磁性纳米粒子标记三维培养系统中的脂肪间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(1): 44-48.

Lv Pin-lei, Su Yue-han, Cui Da-xiang, Wang Zheng. Fluorescent supermagnetic nanoparticles-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells in the three-dimensional culture system [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(1): 44-48.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：干细胞体内示踪观察。

时间及地点：于2014年5至10月在上海交通大学医学院附属仁济医院消化疾病研究所干细胞实验室和上海交通大学微纳科学技术研究院纳米生物工程研究室完成。

材料：

实验动物：清洁级3-5周龄裸鼠5只，体质量约20 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。

实验方法：

脂肪间充质干细胞获取及传代培养：①注射器抽取正常供者无菌脂肪10 mL，PBS冲洗，1 000 r/min离心10 min，取上层脂肪组织至50 mL离心管剪碎，加入35 mL 0.2%的Ⅰ型胶原酶，置于37 ℃水浴摇床振荡消化1 h至无明显组织块为止。②用200目滤网过滤，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，将余下部分用HBSS冲洗，1 500 r/min离心5 min。③细胞计数，以2×10⁵/cm²密度接种在活化的骨髓细胞外基质来源的细胞外基质培养系统(简称XCBM-ECM干细胞培养系统)预处理培养瓶中。每3 d换液，细胞融合至90%时，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化，按1︰3进行传代。
脂肪间充质干细胞分化能力鉴定：
成脂分化及鉴定：取第6代细胞，以2×10⁴/cm²的浓度接种于6孔板，待细胞90%融合后，换成成脂条件培养液(脂肪细胞集落形成单位条件培养基：DMEM-LG+体积分数为10%胎牛血清+1 µmol/L 地塞米松+60 µmol/L吲哚美辛+500 µmol/L异丁基甲基黄嘌呤+5 mg/L胰岛素)，每3 d换液，诱导2周后油红O染色，观察脂肪间充质干细胞的成脂能力。

成骨分化及鉴定：取第6代细胞，以3×10³/cm²的浓度接种于6孔板，待细胞融合90%后，换成成骨条件培养液(成骨细胞集落形成单位条件培养基：DMEM-LG+体积分数为10%胎牛血清+ 100 nmol/L地塞米松+0.2 mmol/L 抗坏血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸酯)，每3 d换液，诱导3周后茜素红S染色，观察脂肪间充质干细胞的成骨能力。

流式细胞仪检测细胞表面标志物：取第6代细胞，经0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，2 000 r/min离心5 min，加少量生理盐水重悬细胞，流式管中分别加入10 μL鼠抗人单克隆抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD166、HLA-ABC、HLA-DR，室温避光反应30 min，以加小鼠IgG作为阴性对照。生理盐水洗涤2次后，少量生理盐水重悬细胞，上机检测分析。

荧光磁性纳米粒子体外标记脂肪间充质干细胞：人脂肪间充质干细胞爬片后加入荧光磁性纳米粒子孵育约6 h，缓慢冲洗细胞，2.5%戊二醛固定30 min，蒸馏水清洗3次，1 mmol/L Hoechest33258孵育5 min，共聚焦显微镜下观察体外标记效果。
体外标记的脂肪间充质干细胞活体移植及示踪效果：将标记过荧光磁性纳米粒子的人脂肪间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，2 000 r/min离心5 min，生理盐水洗涤3次，重悬并细胞计数，调整细胞浓度为4×10⁹ L^-¹，经裸鼠尾静脉注射0.5 mL人脂肪干细胞悬液，于第3天麻醉处死实验鼠。依次取出实验鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏及脑组织，生理盐水轻洗1次，用吸水纸吸干各脏器表面水分，然后将各脏器放置在透明塑料托盘上，置于成像仪中观察标记的干细胞迁移状况。

主要观察指标：荧光磁性纳米粒子标记的人脂肪间充质干细胞在实验动物体内各器官中的归巢情况。

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讨论

人体内的间充质干细胞存在于各种组织当中，如骨髓、脂肪、脐带、脐血、胎盘等，其中骨髓来源的间充质干细胞由于取材困难，同时大量扩增的难题至今尚未完全解决^[12-14]；脐带、脐血、胎盘来源的间充质干细胞取材容易，来源充足，但是目前研究初步发现前几代的细胞免疫原性较低，人胚胎干细胞未分化状态细胞免疫原性较低，细胞分化以后免疫原性提升的现象来看，体内移植后细胞免疫原性改变还难以预知，有待深入研究，何况这类干细胞在目前的培养体系下，细胞干性难以维持超过5代。一般组织中存在的间充质干细胞量较少，且随着年龄增长，干细胞的干性和分化能力也会减弱，所以需要在体外分离纯化并扩增，但最终结果往往不如人意^[15-16]。因此从取材角度，最容易分离获取的是脂肪间充质干细胞。课题组的前述研究已经建立了脂肪间充质干细胞的良好扩增体系，经过长期扩增，能够维持干细胞的“干性”^[17]，这是在脂肪间充质干细胞领域的重大突破，目前可以从5 g脂肪中扩增出上亿的脂肪间充质干细胞(数据尚未发表)。脂肪间充质干细胞具有很强的自我增殖能力，在不同诱导液存在下可以向不同类型的细胞分化，如成骨细胞、成脂肪细胞、成软骨细胞等。这些干细胞经过CFU试验表明严格按照干细胞对称分裂方式，可以形成临床级应用的干细胞。

脂肪组织来源于自身腹部、腿部、臀部等皮下脂肪富足的部位，取材相对容易，创面小，根据本实验室的技术，只需要取5-10 mL就可满足需求。由于取之于自体，用之于自体，没有明显的伦理问题^[18]，避免了免疫排斥反应，便于移植后长期存活并发挥作用。实验利用酶消化贴壁培养法从脂肪组织中分离获取脂肪间充质干细胞，随着换液和传代，杂细胞逐渐被弃。脂肪间充质干细胞从最初的克隆性生长状态转变成为形态较为均一的梭形细胞。这些细胞扩增速度快，平均每2 d传代。经检测发现扩增15代后的脂肪间充质干细胞仍具有正常的染色体组型，第15代脂肪间充质干细胞仍具有旺盛的增殖能力，干细胞免疫标记特点无异常改变^[17]，特别是CFU实验，可以明确看到细胞分化呈现出非常完全的特点，即细胞具有稳定的形成成纤维细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨组织块的能力。通过比较以往其他类分化功能逐渐丧失的CFU特点，发现实验所分离的CFU细胞分化形成的终末细胞，占接种细胞的100%比例。这就提示了一个新的观点，即干细胞如果维持了未分化特点，它在分化的过程中就不会增殖，而是全部分化。而干细胞要是在培养过程中出现分化的现象，这些分化的细胞再定向分化，就会出现增殖现象。课题组对此正在进一步从机制上深入研究。有可能发现干性维持和分化、增殖之间的信号联系。

对于细胞在体内的归巢研究，目前使用较多的细胞标记有BrdU标记、DAPI标记和CM-Dil标记等。传统的标记示踪方法操作略显复杂，不利于检测的顺利进行。崔大祥课题组合成的荧光磁性纳米粒子作为一种很好的干细胞示踪剂，操作方法简单，标记效率高，生物相容性好，不影响细胞的形态与功能^[8]。通过研究发现，该类示踪剂能够很好的和脂肪来源的间充质干细胞结合，并保持细胞活性和细胞功能。实验结果显示分离扩增的具有“干性”特点的脂肪来源间充质干细胞在动物体内的多脏器均有分布，特别是在脑组织中的分布。目前正在进一步观察其他类的细胞在动物体内的分布，有一点肯定的是成纤维细胞静脉输注后在动物脑内极少分布(未发表数据)。根据以往在临床上开展的研究，发现静脉途径输入的细胞可以对神经系统疾病产生明显的疗效。但是当时无法解释细胞和脑内血脑屏障的关系。通过本实验可以发现脂肪来源的间充质干细胞有突破血脑屏障的作用。根据国际上目前研究最新成果，韩国(未发表)数据表明脐血来源的干细胞也有突破血脑屏障的作用。这就提示脂肪来源的间充质干细胞在“干性”维持的情况下，未来可以用于治疗脑卒中等各种脑部组织疾病。课题组的基础研究结果有可能可以解释许多临床现象。

综上所述，利用荧光磁性纳米粒子作为干细胞示踪剂，在体外标记脂肪间充质干细胞并观察在体内的分布情况，效果明显，为脂肪间充质干细胞在组织工程修复重建、干细胞治疗和基因治疗载体等方面提供了很好的标记方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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Fluorescent supermagnetic nanoparticles-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells in the three-dimensional culture system

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