穴位注射骨髓间充质干细胞后心肌梗死大鼠血管细胞黏附因子1及迟发抗原4的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前认为骨髓间充质干细胞归巢是由黏附分子和趋化因子介导的，该过程有骨髓内皮细胞、造血干细胞、骨髓造血微环境及其分泌或表达的分子共同参与，黏附分子可能在其中起到重要作用。

目的：以血管细胞黏附因子1和迟发抗原4为指标探讨穴位注射骨髓间充质干细胞向心肌迁移、趋化的机制。

方法：贴壁法培养骨髓间充质干细胞，以第3代为种子细胞，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹。60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、心肌注射骨髓间充质干细胞组(以下简称心肌组)，穴位注射骨髓间充质干细胞组(以下简称穴位组)，每组15只。采用结扎左冠状动脉前降支方法复制心肌梗死模型，穴位组造模成功72 h后于心俞、至阳、膻中每穴位注入骨髓间充质干细胞0.3 mL，心肌组造模成功72 h后二次开胸，左前降支供血区域及周边心肌分6点均匀地移植骨髓间充质干细胞1.2 mL，4周后颈动脉插管，多道生理记录仪检测血流动力学指标，ELISA法检测血清血管细胞黏附因子1及迟发抗原4表达水平。

结果与结论：心肌组、穴位组大鼠心功能得到改善，两组血清血管细胞黏附因子1及迟发抗原4较模型组升高，心肌组和穴位组比较差异无显著性意义。结果说明血管细胞黏附因子1/迟发抗原4轴可能是穴位注射干细胞趋化机制之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 穴位移植, 心肌梗死, 血管细胞黏附因子1, 迟发抗原4

Abstract:

BACKGROUND: Now, the bone marrow mesenchymal stem cell homing is thought to be mediated by adhesion molecules and chemokines, and this process involves bone marrow endothelial cells, hematopoietic stem cells, bone marrow microenvironment and its secreted or expressed molecules, in which, adhesion molecules may play an important role.

OBJECTIVE: To explore the migrating and chemotactic mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells via acupoint injection into myocardial cells by determining the expression of vascular cell adhesion molecule-1 and very late antigen-4.

METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured using adherent method, and the passage 3 cells were used as seed cells at a density of 1×10¹⁰/L. Sixty Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group, model group, myocardial injection group, and acupoint injection group, 15 rats in each group. The left coronary arteries of rats were ligated for establishing a model of myocardial infarction. At 72 hours after myocardial infarction, 0.3 mL bone mesenchymal stem cells were transplanted into the Xinyu, Zhiyang, Tanzhong acupoints, respectively, in the acupoint injection group; while in the myocardial injection group, secondary thoracotomy was done, and 1.2 mL bone marrow mesenchymal stem cells were equably transplanted into six sites in the feeding area of the left anterior descending artery and the surrounding myocardium. At 4 weeks after myocardial infarction, a multi-channel polygraph was adopted for detection of hemodynamic parameters, and the levels of serum vascular cell adhesion molecule-1 and very late antigen-4 were measured by ELISA.

RESULTS AND CONCLUSION: The heart function of rats in the myocardial injection and acupoint injection groups were improved, and compared with the model group, the levels of serum vascular cell adhesion molecule-1 and very late antigen-4 were significantly higher in the myocardial injection and acupoint injection groups. However, there was no significant difference between the myocardial injection and acupoint injection groups. These findings suggest that vascular cell adhesion molecule-1 and very late antigen-4 may be one of the chemotactic mechanisms of bone mesenchymal stem cells transplanted in myocardial infarction model rats by acupoint injection.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cell transplantation, myocardial infarction, vascular cell adhesion molecule-1

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

材料：

实验动物：①造模用清洁级雄性SD大鼠，体质量(250±10) g，由辽宁医学院实验动物中心提供。②细胞培养用清洁级SD大鼠，体质量(100±10) g，由解放军军事医学科学院提供。

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养、扩增：体质量(100±10) g的SD大鼠脱颈椎处死，体积分数为75%乙醇溶液浸泡3 min。在无菌条件下取出股骨，剪断股骨两端，用含培养液的5 mL注射器反复冲洗骨髓腔3次，收集骨髓细胞悬液，接种在培养瓶中，置二氧化碳培养箱中静置培养。第5天半量换液，以后每3 d全量换液1次。待细胞生长至90%融合时，加入0.125%胰蛋白酶，0.02% EDTA，37 ℃消化，按1∶2比例进行传代扩增培养。细胞培养至第3代后作为穴位注射的种子细胞。

大鼠心肌梗死模型建立：体质量(250±10) g的60只大鼠随机分为假手术组、模型组、心肌注射骨髓间充质干细胞组(以下简称心肌组)，穴位注射骨髓间充质干细胞组(以下简称穴位组)，每组15只。乌拉坦按1.0 g/kg进行腹腔注射麻醉，分离颈部肌肉，暴露气管，剪一小口，插入气管插管，接小动物呼吸机机械通气：通气量为80 mL/kg、通气频率为55-60次/min，吸呼比1∶2，压力4.0-5.0 kPa。胸骨左缘第3肋间0.5 cm处，纵向剪开长约1.5 cm皮肤组织，分离肌肉、血管，剪断第3肋骨，打开胸膜及心包，在左心耳与肺动脉圆锥之间以手术缝线结扎左冠状动脉前降支，观察心电图，若出现明显的ST段上抬，心脏表面相应区域颜色变暗提示造模成功。45 min后松结扎线，心电图ST段下降1/3以上、心脏表面变红表明心肌组织恢复再灌注，再灌注开始后，逐层缝合肋骨、肌肉和皮肤，关胸，撤机，缝合气管。

干细胞穴位注射方法：弃培养液，用PBS轻洗3次，加入0.125%胰蛋白酶，0.02% EDTA，37 ℃，消化3 min，待75%的细胞逐渐变为圆形并脱离瓶底悬浮时，加入含血清的新鲜培养液终止胰蛋白酶作用。用弯头吸管轻轻吹打细胞，收集细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用新鲜培养液重新悬浮细胞，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹。

穴位注射：穴位组大鼠造模后72 h予穴位注射骨髓间充质干细胞，选择心俞(第5胸椎下两旁肋间，双侧)、至阳(第7胸椎棘突下凹陷中)、膻中(两乳之间，前正中线上，平第4、第5肋间)4个穴位注射，每个穴位注入0.3 mL细胞悬液。

心肌注射：心肌组大鼠造模72 h后二次开胸，直视下在冠状动脉左前降支供血区域及周边心肌用微量注射器分六点均匀地移植1×10¹⁰ L^-¹骨髓间充质干细胞1.2 mL，局部呈丘样隆起为移植成功。

血流动力学测定：大鼠饲养4周后检测血流动力学。乌拉坦按1.0 kg/kg进行腹腔注射麻醉。分离右颈总动脉，插入已准备好的左室导管，用丝线轻轻结扎动壁于导管上，将导管插向左室腔，当显示器上波形由血压波变成下沿达0 mm Hg附近具有明显舒张期而峰顶平坦的波形时，再送入0.2-0.3 cm，固定导管于胸锁乳突肌上，缝合皮肤。大鼠清醒后置于一个四壁光滑塑料容器中不加限制。心室导管接压力换能器，将信号输入多道生理记录仪。

大鼠血清血管细胞黏附因子1和迟发抗原4水平检测：心功能测定结束后，真空采血管收集血液，3 000 r/min离心5 min获得血清。检测方法采用ELISA法，按说明书提供的步骤，于酶标仪测定各孔吸光度值，绘制标准曲线，得到各样本待测抗体浓度。

主要观察指标：各组动物心功能、血清血管细胞黏附因子1和迟发抗原4水平。

统计学分析：计量资料以x(_)±s的形式表示，正态分布资料，且方差满足齐性，以Dunnett-t 检验对多组与一组数据差别进行比较。如果数据经转换后仍不能满足方差分析条件，则以秩和检验进行分析。以P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

干细胞归巢是指自体或移植的干细胞定向趋向性迁移，穿过血管内皮细胞，移至靶器官定植过程。骨髓间充质干细胞具有归巢能力，并且能优先向缺血损伤组织迁移^[6]。结扎实验大鼠左前降支冠状动脉复制心肌梗死模型，梗死心肌局部注射采用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞，病理切片结果显示心肌内存在大量PKH26标记的骨髓间充质干细胞^[7]。在静脉移植途径、左心室内移植途径也能发现心肌内迁移的干细胞，这种趋化作用机制尚不明确，目前认为骨髓间充质干细胞归巢是由黏附分子和趋化因子介导的，该过程有骨髓内皮细胞、造血干细胞、骨髓造血微环境及其分泌或表达的分子共同参与，黏附分子可能在其中起到重要作用。黏附分子是指由细胞产生的，介导细胞与细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触、识别、结合、激活和移行等分子。细胞黏附分子有多种类型，如钙黏素家族、选择素家族、免疫球蛋白超家族、整合素家族等。血管细胞黏附因子1属于免疫球蛋白超家族，是一类不依赖Ca²⁺的细胞黏附分子。这类分子的胞外区有一个或多个免疫球蛋白样结构域，具有抗体分子的特征，每个Ig样结构域含有90-110个氨基酸残基，其间有二硫键相连接。骨髓间充质干细胞穿过血管内皮到达靶器官，黏附于血管内皮是首要过程。血管细胞黏附因子1与迟发抗原4在紧密黏附中起重要作用，血管细胞黏附因子1和迟发抗原4结合素相互作用是骨髓间充质干细胞和心脏微血管内皮细胞主要黏附分子。骨髓间充质干细胞本身即表达血管细胞黏附因子1^[8]，这种表达远高于肺脏^[9]，心肌损害增加内皮血管细胞黏附因子1表达^[10]。经迟发抗原4抗体处理过的间质干细胞与血管内皮的黏附明显减少^[11]，培养的间质干细胞与血管细胞黏附因子1混合培养后，黏附血管内皮的能力则完全消失^[12]。提示骨髓间充质干细胞黏附到内皮上主要依赖于血管细胞黏附因子1和迟发抗原4。实验通过穴位移植骨髓间充质干细胞，能够在靶器官上观察到标记过的种子细胞，提示干细胞已经归巢到靶器官^[4-5]，其他研究者也表现了骨髓间充质干细胞能够从皮下迁移到宿主组织^[13-14]。在本实验中，心肌梗死模型动物穴位注射干细胞和心肌注射干细胞后心功能均能得到改善，血清血管细胞黏附因子1和迟发抗原4表达明显增加，提示血管细胞黏附因子1/迟发抗原4轴可能是干细胞趋化的重要因素。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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