纳米生物探针双标大鼠骨髓间充质干细胞的成活及生长

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.002

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (41): 6567-6572.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.002

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

纳米生物探针双标大鼠骨髓间充质干细胞的成活及生长

曹爱红^1，2，杨欣¹，郭子威¹，胡维¹

¹徐州医学院第二附属医院影像科，江苏省徐州市 221006；²江苏省分子影像与功能影像实验室，江苏省南京市 210009

修回日期:2014-09-08 出版日期:2014-10-01 发布日期:2014-10-01
通讯作者: 曹爱红，博士，副教授，徐州医学院第二附属医院影像科，江苏省徐州市 221006
作者简介:曹爱红，男，江苏省泰州市人，博士，副教授，主要从事分子影像与功能影像学方面的研究。
基金资助:
江苏徐州市科技计划项目(XM12B043)

Survival and growth of nano-bioprobe double-labeled rat bone marrow mesenchymal stem cells

Cao Ai-hong^{1, 2},Yang Xin¹, Guo Zi-wei¹, Hu Wei¹

¹Department of Radiology, the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China; ²Jiangsu Key Laboratory of Molecular Imaging and Functional Imaging, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China

Revised:2014-09-08 Online:2014-10-01 Published:2014-10-01
Contact: Cao Ai-hong, Department of Radiology, the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China; Jiangsu Key Laboratory of Molecular Imaging and Functional Imaging, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
About author:Cao Ai-hong, M.D., Associate professor, Department of Radiology, the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China; Jiangsu Key Laboratory of Molecular Imaging and Functional Imaging, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Science and Technology Plan Project of Xuzhou City, No. XM12B043

摘要/Abstract

摘要：

背景：超顺磁性氧化铁标记可以活体示踪干细胞在动物体内迁徙情况，荧光活性染料DiI对细胞活力和增殖分化影响较小，适合标记和示踪细胞。

目的：观察超顺磁性氧化铁及DiI双标骨髓间充质干细胞的效果和安全性。

方法：无菌条件下分离大鼠双下肢，低糖DMEM培养液冲出骨髓，运用全骨髓贴壁法体外分离骨髓间充质干细胞，利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。对分离纯化并传代培养的大鼠骨髓间充质干细胞标记超顺磁性氧化铁，细胞移植前进行DiI标记。

结果与结论：原代培养8-10 d后可分离得到骨髓间质干细胞，传代周期为三四天，超顺磁性氧化铁-DiI标记率近100%，普鲁士蓝染色显示蓝色铁颗粒位于骨髓间质干细胞胞质内，荧光显微镜下胞浆内示红色荧光，锥虫蓝拒染法检测标记和未标记活细胞数目均在95%左右，说明在含超顺磁性氧化铁-DiI的培养基中骨髓间充质干细胞可继续增殖，细胞形态无明显变化。以上结果显示超顺磁性氧化铁-DiI可安全有效地标记骨髓间质干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 纳米探针, 骨髓间充质干细胞, 细胞培养, 超顺磁性氧化铁, DiI

Abstract:

BACKGROUND: Superparamagnetic iron oxide (SPIO) labeling can trace the migration of stem cells in vivo, and the fluorescent DiI dye is suitable for marking and tracing cells because of its less influence on cell viability, proliferation and differentiation.

OBJECTIVE: To observe the effect and safety of SPIO and fluorescent DiI dye to double label bone marrow mesenchymal stem cells．

METHODS: The bilateral lower limbs of rats were isolated sterilely. Bone marrow was obtained by rinsing using low-glucose DMEM. Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated by the whole bone marrow adherence method and purified by differential attachment method. Purified cells were dual-labeled with SPIO particle and fluorescent DiI dye.

RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells could be separated at 8-10 days after primary culture and the subculturing cycle was 3-4 days. Rat bone marrow mesenchymal stem cells could be effectively labeled with SPIO-DiI and the labeling efficiency was almost 100%. Blue irons contained in intracytoplasmatic vesicles could be observed clearly with Prussian blue staining, and the fluorescence microscopy showed red fluorescence at cytoplasm. Survival and apoptosis percentages obtained by MTT analysis were similar among labeled and unlabeled bone marrow mesenchymal stem cells that were both about

95%．These findings indicate that the rat bone marrow mesenchymal stem cells could be efficiently labeled with SPIO-DiI to construct a nano-bioprobe, without significant changes in morphology, viability and proliferation.

全文链接：

Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, cells, cultured, iron, carbocyanines

中图分类号:

R394.2

曹爱红，杨欣，郭子威，胡维. 纳米生物探针双标大鼠骨髓间充质干细胞的成活及生长[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(41): 6567-6572.

Cao Ai-hong,Yang Xin, Guo Zi-wei, Hu Wei. Survival and growth of nano-bioprobe double-labeled rat bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(41): 6567-6572.

图/表（结果） 1

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞培养纯化及形态学观察 原代培养的细胞，48 h第1次换液见部分细胞贴壁，呈圆形或卵圆形，换液逐渐去除未贴壁细胞，全骨髓培养经过3-5 d、密度梯度离心法经过6-8 d的静止期，细胞逐渐伸出伪足，多数为成纤维样梭形或多边形细胞，大部分为单核，位于细胞中央，呈集落生长，细胞增殖迅速，集落相互靠近，慢慢融合，于培养9至10天(全骨髓培养法)、13-15 d(密度梯度离心法)渐渐铺满培养瓶。传代培养的细胞24 h完全贴壁，第1代的生长周期为五六天，随着传代次数增多，细胞形态越来越均匀，没有明显变化(图1)。传代后细胞四五天即可长满融合，以继续传代扩增。

2.2 流式细胞仪细胞表面标志测定 流式细胞仪结果显示实验分离培养的骨髓间充质干细胞均一性好，达99%以上CD29⁺、CD90⁺、CD45^-，说明传代贴壁生长的梭形细胞确为骨髓间充质干细胞。

2.3 骨髓间充质干细胞多能横向分化潜能鉴定

成脂肪诱导：诱导3 d后，细胞由成纤维细胞样逐渐收缩变短，成为立方形或多角形；连续培养7 d，镜下可见细胞内有微小脂滴出现，随着时间的延长，脂滴逐渐增大融合，培养2周时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞，油红O染色，可见细胞内大量红色脂滴。

成骨诱导：培养1周后，细胞形态明显改变，由成纤维细胞样变为多角形，类似神经元细胞，细胞周边出现长丝状突出，向周围延伸。培养2周以上，细胞基质矿化物逐渐出现，培养4周以上，可见明显钙化结节，von Kossa染色可见钙盐沉积区域呈黑色。

2.4 Fe₂O₃-PLL磁性纳米粒子的表征分析 将合成的产物经透射电镜观察，nano-Fe₂O₃-PLL呈球形，分布均匀。直径分布为10-20 nm，平均直径为16 nm，具有立方尖晶石的晶体结构。饱和磁化强度为60 emu/g。

2.5 SPIO-DiI双标记后细胞内铁及荧光染料检测 标记后的活细胞在倒置相差显微镜下已能见到胞浆内的棕黄色颗粒(图2A)，细胞爬片普鲁蓝染色后，大鼠骨髓间充质干细胞的几乎每个标记细胞浆内均可看到蓝色颗粒，标记率近100%(图2B)，而未标记细胞内无蓝色颗粒。荧光显微镜观察，可见到红色环状荧光，红色颗粒为细胞膜及细胞浆，中间未染色的为不着色的细胞核，几乎每个标记细胞均可看到红色荧光，标记率近100%(图2C)。

2.6 双标对骨髓间充质干细胞活力及增殖的影响 锥虫蓝染色计数显示移植前标记和未标记活细胞数目均在95%左右(表1)，说明在含SPIO-DiI的培养基中骨髓间充质干细胞可继续增殖，细胞形态无明显变化。

参考文献

[1] Weissleder R.Molecular imaging: exploring the next frontier.Radiology. 1999;212(3):609-614.
[2] Arbab AS, Bashaw LA, Miller BR,et al.Intracytoplasmic tagging of cells with ferumoxides and transfection agent for cellular magnetic resonance imaging after cell transplantation: methods and techniques.Transplantation. 2003;76(7): 1123-1130.
[3] Beyer Nardi N, da Silva Meirelles L.Mesenchymal stem cells: isolation, in vitro expansion and characterization.Handb Exp Pharmacol. 2006;(174):249-282.
[4] Koide Y, Morikawa S, Mabuchi Y,et al.Two distinct stem cell lineages in murine bone marrow.Stem Cells. 2007;25(5): 1213-1221.
[5] Baksh D, Song L, Tuan RS.Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.J Cell Mol Med. 2004;8(3):301-316.
[6] Minguell JJ, Erices A, Conget P.Mesenchymal stem cells.Exp Biol Med (Maywood). 2001;226(6):507-520.
[7] Oswald J, Boxberger S, Jørgensen B,et al.Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells. 2004;22(3):377-384.
[8] Barry FP, Murphy JM.Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization.Int J Biochem Cell Biol. 2004;36(4):568-584.
[9] Minguell JJ, Erices A.Mesenchymal stem cells and the treatment of cardiac disease.Exp Biol Med (Maywood). 2006; 231(1):39-49.
[10] Liang F, Wang YF, Nan X, et al.In vitro differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into blood vessel endothelial cells.Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2005;27(6):665-669.
[11] Gang EJ, Jeong JA, Han S,et al. In vitro endothelial potential of human UC blood-derived mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 2006;8(3):215-227.
[12] Alviano F, Fossati V, Marchionni C,et al.Term Amniotic membrane is a high throughput source for multipotent Mesenchymal Stem Cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro.BMC Dev Biol. 2007;7:11.
[13] Lansdorp PM, Dragowska W, Mayani H.Ontogeny-related changes in proliferative potential of human hematopoietic cells.J Exp Med. 1993;178(3):787-791.
[14] Krupnick AS, Balsara KR, Kreisel D,et al.Fetal liver as a source of autologous progenitor cells for perinatal tissue engineering.Tissue Eng. 2004;10(5-6):723-735.
[15] Hao HN, Zhao J, Thomas RL,et al.Fetal human hematopoietic stem cells can differentiate sequentially into neural stem cells and then astrocytes in vitro.J Hematother Stem Cell Res. 2003; 12(1):23-32.
[16] Campagnoli C, Roberts IA, Kumar S,et al.Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow.Blood. 2001;98(8):2396-2402.
[17] 赵明,任彩萍.胚胎干细胞诱导分化的研究进展[M].生命科学, 2005,17(1):19-24.
[18] Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.Nature. 2002;418(6893):41-49.
[19] 何朝荣,张群林,黄从新.兔骨髓间充质干细胞体外成内皮细胞能力的研究[J].中华老年多器官疾病杂志,2003,2(4) :287-291.
[20] 崔磊,于海莹,尹烁,等.诱导大鼠骨髓内皮祖细胞成内皮细胞的体外增殖规律的观察[J].中华实验外科杂志,2004,21(6):652-653.
[21] 肖海波,梅举,张宝仁,等.大鼠骨髓基质干细胞体外诱导向内皮分化的实验研究[J].上海医学,2005 ,28(3):227-229.
[22] Strauer BE, Brehm M, Zeus T,et al.Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans.Circulation. 2002; 106(15):1913-1918.
[23] Englund U, Fricker-Gates RA, Lundberg C,et al.Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections.Exp Neurol. 2002;173(1):1-21.
[24] Terada N, Hamazaki T, Oka M,et al.Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature. 2002;416(6880):542-545.
[25] Fraser JK, Schreiber R, Strem B,et al. Plasticity of human adipose stem cells toward endothelial cells and cardiomyocytes.Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2006;3 Suppl 1:S33-37.
[26] Fuchs S, Baffour R, Zhou YF,et al.Transendocardial delivery of autologous bone marrow enhances collateral perfusion and regional function in pigs with chronic experimental myocardial ischemia.J Am Coll Cardiol. 2001;37(6):1726-1732.
[27] 孔炜伟,滕皋军.体外培养人胎肝细胞与永生化L-02肝细胞的生物学性状比较[J].中华放射学杂志,2004,38(2):119-123.
[28] 王悍,滕皋军,缪竞陶,等.酸性成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子在肝干细胞分化成熟中的作用[J].中华放射学杂志, 2004, 38(2):124-128.
[29] Bengel FM, Schachinger V, Dimmeler S.Cell-based therapies and imaging in cardiology.Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2005; 32 Suppl 2:S404-416.
[30] Hill JM, Dick AJ, Raman VK,et al. Serial cardiac magnetic resonance imaging of injected mesenchymal stem cells. Circulation. 2003;108(8):1009-1014.
[31] Wickline SA, Lanza GM.Nanotechnology for molecular imaging and targeted therapy.Circulation. 2003;107(8): 1092-1095.
[32] Kamihata H, Matsubara H, Nishiue T,et al.Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and cytokines. Circulation. 2001;104(9):1046-1052.
[33] Hamano K, Nishida M, Hirata K,et al.Local implantation of autologous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease: clinical trial and preliminary results.Jpn Circ J. 2001;65(9):845-847.
[34] Wang JS, Shum-Tim D, Galipeau J,et al.Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: feasibility and potential clinical advantages.J Thorac Cardiovasc Surg. 2000;120(5):999-1005.
[35] Ju S, Teng GJ, Lu H,et al.In vivo MR tracking of mesenchymal stem cells in rat liver after intrasplenic transplantation. Radiology. 2007;245(1):206-215.
[36] Sun JH, Teng GJ, Ju SH, et al.MR tracking of magnetically labeled mesenchymal stem cells in rat kidneys with acute renal failure.Cell Transplant. 2008;17(3):279-290.
[37] Wang DS, Dake MD, Park JM, et al.Molecular imaging: a primer for interventionalists and imagers.J Vasc Interv Radiol. 2006;17(9):1405-1423.
[38] 居胜红,滕皋军,毛曦,等.脐血间充质干细胞磁探针标记和MR成像研究[J].中华放射学杂志,2005,39(1):101-106.
[39] Hauger O, Frost EE, van Heeswijk R,et al.MR evaluation of the glomerular homing of magnetically labeled mesenchymal stem cells in a rat model of nephropathy.Radiology. 2006; 238(1):200-210.
[40] Gao F, Kar S, Zhang J,et al.MRI of intravenously injected bone marrow cells homing to the site of injured arteries.NMR Biomed. 2007;20(7):673-681.

引言

干细胞是一类具有自我更新能力、多系分化和高度增殖的细胞，近年来干细胞研究领域取得的突破性进展，诞生了一个全新的领域：干细胞器官组织工程和再生医学^[1-8]。由于其广阔的应用前景，受到越来越多的关注，而干细胞移植治疗疾病又是其中的重点，其中成体干细胞的可塑性为组织的脏器修复带来了新的希望。细胞移植后存在一个迫切需要解决的问题：如何辨别供体、受体细胞，怎样观察供体细胞在受体中的生存情况？Weissleder^[1]于1999年提出分子影像学概念：利用影像学手段在细胞和分子水平对生物学过程进行活体定性及测量，其中活体示踪细胞即为分子影像学重要任务之一。MR由于成像时间窗长，可观察细胞的动态迁徙过程，利用MR对比剂超顺磁性氧化铁(superpara-magnetic iron oxide，SPIO)体外标记细胞后移植，进行MR的体内成像示踪研究日益受到重视，在活体细胞的无创示踪中前景看好。Arbab等^[2-16]认为巨噬细胞吞噬死亡的标记细胞或铁颗粒后，其中的铁质会很快代谢，95%以上的磁共振局部信号降低源于巨噬细胞吞噬死亡的标记细胞或铁颗粒，但标记干细胞在体内死亡、裂解，释放出的氧化铁颗粒能否造成非特异性显像尚无定论。由于氧化铁不能够跟随细胞的分裂而自体复制，所以MR在监测移植后干细胞的增殖和分化方面存在一定不足。Soriano等于1992年首先发现荧光染料DiI可用于标记干细胞，且对标记细胞无毒性，在荧光显微镜下可从受体组织中辨认出移植细胞，为移植细胞的生存状况提供了良好的形态学依据，现已广泛应用于悬浮培养细胞标记。DiI是一种亲脂性羰花青染料，以类似于磷脂的方式与脂蛋白结合嵌进生物质膜内，并在膜内做定向扩散运动从而标记整个细胞，其特点是特异性强，灵度高。早期DiI标记细胞操作复杂，标记有效时间短，现在换代为荧光更强、示踪长期稳定的CM-DiI(ehlommethyl-benzamidodialkylcarbo-cyanine)，CM-DiI标记细胞有效率高达95%以上，体外及体内移植后可维持2个月。虽然荧光标记物对细胞活力和增殖分化影响较小，但随着荧光衰减和细胞分裂而标记强度下降，同时存在假阳性的问题。更为重要的是，荧光染料标记均需在体外状态下进行病理学切片分析，不能活体示踪干细胞在体内的迁徙、增殖情况。本实验应用超顺磁性氧化铁及DiI标记体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，检测标记率，并观察骨髓间充质干细胞存活和生长状况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2010年3月至2012年9月在江苏省分子影像与功能影像实验室完成。

材料：

实验动物：选用东南大学医学院动物实验中心提供的健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量120 g左右，清洁级。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离、培养：①用颈椎脱臼法处死SD大鼠，放入体积分数为70%乙醇的烧杯中，使其体毛完全浸湿5 min。②将大鼠放在超净工作台消毒托盘内，移入超净工作台，固定于已预先消毒的自制手术台。用镊子夹其腹中部皮肤，沿中间作一切口，剪开腹壁各层，注意不要剪破肠管；剪开双下肢皮肤，分离皮下组织和肌肉，暴露双侧股骨和胫骨，小心分离股骨上的肌肉，然后分别剪开股骨和胫骨两端关节面，尽量保留骨松质，露出骨髓腔，用手术剪跨关节完整剪下，将分离出的股骨和胫骨用DMEM培养液冲洗去除残余血液。③放在盛有PBS的平皿中，再次去除肌肉，并用PBS冲洗3次。④移至另一皿中，将股骨中间剪断，用注射器吸取低糖DMEM培养液(含肝素1 mL/L)反复冲洗骨髓腔，以冲出骨髓。⑤用注射器反复冲打骨髓液，依次通过7号和4号针头，制成单细胞悬液，分别按以下两种方法进行培养。⑥全骨髓培养法：将单细胞悬液离心(1 500 r/ min，10 min)，弃上清。加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养基，吹打散细胞。计数细胞并以1×10¹⁰ L^-¹的细胞浓度接种在培养瓶中，置37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养。⑦密度梯度离心法：将骨髓细胞悬液沿管壁缓慢注入预先加有等体积60%Percoll淋巴细胞分离液的离心管中，2 000 r/min，15 min。小心吸取界面层细胞，用DMEM培养液洗2次。将所得细胞加入DMEM完全培养基，吹打细胞，计数细胞并以1×10¹⁰ L^-¹的细胞浓度接种在50 mL培养瓶中，置37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养。

大鼠骨髓间充质干细胞的传代和纯化：利用差异贴壁培养法纯化细胞。第1次于接种后48 h换培养液，以后每3 d更换培养液，以除去不贴壁的细胞。直至细胞长满至80%-90%，进行传代。去除培养液，加骨髓间充质干细胞消化液(0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA液)至刚好盖过瓶底，在倒置显微镜下观察至细胞间间隙增大，细胞变圆并开始脱落，加入等量完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底，将细胞吹打下来，转移至离心管，1 500 r/min离心5 min，去上清，加入培养基，吹打散细胞，按1∶3传代。原代细胞消化时间为3-5 min，传代细胞为1-3 min。传代培养过程中每3 d换液，直至贴壁细胞彼此融合、铺满瓶底，再重复上述操作，传代培养记为第2代，余类推。用倒置相差显微镜对培养中细胞进行动态观察并照相。

骨髓间充质干细胞多向分化潜能鉴定：

成脂肪诱导：诱导2周后，油红O染色鉴定诱导成脂肪。

成骨诱导：诱导2周后，von Kossa染色鉴定诱导成骨。

nano-Fe₂O₃-PLL的合成：nano-Fe₂O₃-PLL水基磁性液体由东南大学生物科学与医学工程学院顾宁教授研究组提供。采用湿化学共沉淀制备及表面包被技术，制备nano-Fe₂O₃-PLL水基磁流体。

SPIO-DiI双标记骨髓间充质干细胞构建纳米生物探针及鉴定：将nano-Fe₂O₃-PLL加入第3代骨髓间充质干细胞培养液中进行标记，铁终质量浓度为20 mg/L，在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内孵育24 h，除去培养液后磷酸缓冲液反复冲洗，少量细胞进行细胞爬片普鲁士蓝染色；细胞移植前将DiI加入超顺磁性氧化铁标记的第3代骨髓间充质干细胞，于不含胎牛血清的低糖DMEM培养液中进行标记，染料浓度为1 mL/L，在4 ℃冰箱中孵育15 min，37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内孵育2 h。除去培养液后磷酸缓冲液反复冲洗，少量细胞进行细胞爬片，激光共聚焦显微镜下观察证实细胞浆内红色荧光染料标记，荧光显微镜检测DiI的标记率。

取少量细胞采用锥虫蓝拒染法观察标记细胞活率：取细胞悬液和0.4%锥虫蓝染液(9∶1)混合后4 min计数，计算活细胞率：活细胞率(%)=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。

主要观察指标：①大鼠骨髓间充质干细胞形态、表面标志、多向分化能力鉴定。②大鼠骨髓间充质干细胞用nano-Fe₂O₃-PLL、DiI标记后的标记率。③SPIO-DiI双标后大鼠骨髓间充质干细胞活力及增殖能力变化。

全文链接：

讨论

1976年，Friedenstein证实骨髓中除含有造血干细胞外，还含有梭形的集落形成成纤维祖细胞或成纤维集落细胞形成单位(fibroblast colony2forming unit，CFU-F)，这些细胞在体内处于休眠状态，而在体外适当条件的刺激下可以进入细胞周期^[17-22]。培养的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20-30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞被称为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞被认为是存在于骨髓中的多能干/祖细胞，经连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，而且可保持正常的核型和端粒酶活性，但并不能自发分化。在体外特定的条件下，能够被诱导分化为中胚层、外胚层以及内胚层组织和细胞，可以分化为软骨细胞、脂细胞、肌细胞、神经细胞、胰岛细胞等。正是由于骨髓间充质干细胞的这种强大的分化潜能及具有易于分离培养扩增、遗传背景稳定、体内植入反应较弱等特性使其在组织工程、细胞替代治疗、基因治疗等领域得到日益广泛的应用，骨髓间充质干细胞在骨髓中含量稀少，只有少于0.05%的骨髓干细胞表现出骨髓间充质干细胞的特性^[21-23]，因此对其进行分离纯化和扩增就显得尤为重要。研究发现骨髓间充质干细胞不表达如Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原、碱性磷酸酶或骨桥蛋白等与分化相关的细胞标志；也不表达脂多糖受体CD14、CD34、白细胞表面抗原CD45、vW因子和HLA-DR等造血干细胞的表面抗原标志；但表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，因此骨髓间充质干细胞具有多种标志，具有非单一性的特点，目前对骨髓间充质干细胞主要是通过形态学特征和多种表面标志相结合来进行鉴定^[24]。本实验采取全骨髓贴壁培养和密度梯度离心两种方法对大鼠骨髓间充质干细胞进行分离培养和扩增，所培养细胞的形态均呈梭形，成纤维样细胞，呈集落生长，与文献报道一致^[22-26]。两种方法均可分离培养出较纯化的骨髓间充质干细胞，全骨髓贴壁培养简单易行，原代培养周期较短，但不如密度梯度离心法培养的细胞纯化；而后者操作较复杂，需要细胞分离液，另外，细胞分离液对细胞是否存在潜在的危害，尚未可知。结果显示，全骨髓培养方法分离得到的细胞具有以下特点：①细胞体积小，核大，染色质细而分散，核仁明显等间充质干细胞的形态学特怔。②细胞增生旺盛，纯度高，超过99%为CD29⁺、CD90⁺、CD45^-^[27-33]。作者认为这种方法不仅提高了骨髓间充质干细胞的分离率和增生能力，而且还使分离时间缩短、污染机会减少。

本实验中采用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM作为培养液，根据骨髓间充质干细胞贴壁生长特性去除未贴壁细胞，随着骨髓间充质干细胞传代扩增，逐渐去除其他少量贴壁的造血细胞和成纤维细胞，并通过反复传代，骨髓间充质干细胞呈优势生长，细胞形态趋于一致，骨髓间充质干细胞得以纯化。骨髓间充质干细胞在体外培养诱导后可以形成钙盐，证明其可以向成骨细胞分化；在体外培养诱导后也可以形成胞质内脂滴，证明其可以向脂肪细胞分化。骨髓间充质干细胞具有多能横向分化潜能，是比较适宜的干细胞来源。

骨髓间充质干细胞移植后采用非侵入性方法来活体实时监测骨髓间充质干细胞在动物体内的分布、迁移和生长代谢无疑是评估移植骨髓间充质干细胞安全性和疗效的重要手段，而分子影像学的发展为此提供了可能。在多种分子影像学方法中，MR由于其成像时间窗长，可观察细胞的动态迁徙过程，且空间、时间分辨率高，对比度好，在活体细胞示踪中前景看好^[34]。近年来，超高场MRI系统发展十分迅速。全身3T系统已用于临床。4T系统已得到FDA无明显危险的许可。在7T系统上，己对数百例健康志愿者完成无事故和无明显安全危险纪录的测试。在9.4T系统上，对成年兔及其后代未观察到不良的生物效应。超高场强磁共振的临床应用，完成了从形态学到功能学和分子影像学的结合，与最先进的生物制剂结合，可以使医学影像进入到基因分子成像的领域，可以说是医学影像技术的一次重大革命。为推动国内分子影像学的发展，本实验室于2008年国内首家引进了7Tmicro-MR。

在应用MR进行细胞群示踪前，同样需要细胞体外标记示踪剂。各类MR示踪剂中，以超顺磁性氧化铁类最受关注，是目前较理想的磁共振示踪剂。其特点是粒径小，穿透力强，且弛豫率为同等条件下Gd³⁺的7-10倍，在极低浓度(nmol级)即可在MR上形成对比，且超顺磁性氧化铁具有生物可降解性，能被细胞代谢后进入正常血浆铁池，与红细胞血红蛋白结合或用于其他代谢过程，因此是一种比较安全的示踪剂。本实验采用的磁粒子Fe₂O₃-PLL由带正电荷的转染剂(transfection agents)多聚赖氨酸(PLL)包裹氧化铁纳米颗粒制作而成，它比非纳米化的颗粒更易进入细胞内，且对细胞生物学特性的影响小；也更易于被带负电荷的细胞摄取。本实验室已采用此磁粒子成功标记并应用MR示踪了大鼠骨髓间充质干细胞及人脐血间充质干细胞^[35-40]。从安全性考虑，本实验在实际标记时采用了低质量浓度25 mg/L，对大鼠骨髓间充质干细胞的标记率几乎为100%，普鲁士蓝染色显示Fe₂O₃-PLL颗粒均位于骨髓间充质干细胞胞质内。

早期DiI标记细胞操作复杂，标记有效时间短，现在换代为荧光更强、示踪长期稳定的CM-Dil(ehlommethyl –benzamidodialkylcarbo-cyanine)，CM-DiI标记细胞有效率高达95%以上，体外及体内移植后可维持2个月。羰花青染料能够完美的染色细胞膜，且胞膜的着色高度稳定，在脂质双分子层中有强荧光。而当它们存在于水相时基本不发或只有微弱的荧光，几乎没有染料能细胞之间迁移。本实验中几乎每个标记细胞均可看到红色荧光，标记率近100%。荧光燃料DiI对标记细胞无毒性，在荧光显微镜下可从受体组织中辨认出移植细胞，为移植细胞的生存状况提供了良好的形态学依据。虽然大部分荧光标记物对细胞活力和增殖分化影响较小，但存在许多不足之处：随着荧光衰减和细胞分裂而标记强度下降，不适宜检测一两个月以上的干细胞；同时存在假阳性的问题；更为重要的是，上述传统的标记方法均需体外状态下进行病理学切片分析，无法活体示踪干细胞在体内的迁徙、增殖情况。故实验采用超顺磁性氧化铁及DiI双标骨髓间充质干细胞，通过荧光显像与MR显像相互验证，以弥补超顺磁性氧化铁单独标记细胞在细胞移植后活体示踪的不足，二者相互补充可以对移植干细胞的动态变化、迁移进行精确描述。

本实验标记前后细胞锥虫蓝染色计数显示移植前标记和未标记活细胞数目均在95%左右，在含超顺磁性氧化铁及DiI的培养基中骨髓间充质干细胞可继续增殖，细胞形态无明显变化，可见标记对细胞活力及增殖无明显影响，因此，此种标记方法是安全有效的。

纳米生物探针双标大鼠骨髓间充质干细胞的成活及生长

Survival and growth of nano-bioprobe double-labeled rat bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 1

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.