基因修饰干细胞治疗心肌梗死：临床前和临床应用中的相关问题

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.023

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞具有分化为心肌及血管的潜力，可使缺血部位心肌得以组织修复及血运重建。该特性使干细胞移植成为具有发展前景的治疗缺血性心脏病的新型疗法。但干细胞移植后的长期存活以及远期疗效问题仍是难题。基因修饰联合干细胞移植的出现为干细胞研究提供了新思路。
目的：就现阶段用于心脏再生治疗的干细胞种类、治疗性基因的选择、移植载体与移植途径的探索及基因修饰干细胞在心血管治疗领域的临床应用进行概述。
方法：应用计算机检索PubMed数据库中2006年1月至2013年12月关于干细胞的文章，在标题和摘要中以“stem cells; genetic therapy; myocardial infarction; regenerative medicine; tissue construction”为检索词进行检索。选择文章内容与干细胞有关者，同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。最终选择40篇文献进行综述。
结果与结论：干细胞联合基因修饰疗法可显著增强移植后的疗效，骨髓间充质干细胞是目前应用最广泛的种子细胞之一，通过腺病毒及腺相关病毒介导的抗凋亡、促血管生成、抗炎症等基因修饰后的干细胞疗效将显著提高。基因修饰干细胞移植有潜力应用于包括心肌梗死在内的多种临床疾病，但其长期安全性仍有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 基因治疗, 心肌梗死, 再生医学, 生物学特性

Abstract:

BACKGROUND: Stem cells possess the potential of differentiation into myocardium and vessels, which can be transplanted into myocardial ischemia parts for tissue repair and revascularization. Therefore, stem cell transplantation has emerged as a promising alternative therapeutic approach for the treatment of ischemic heart disease. However, the long-term survival and curative efficacy issue of stem cells remains a problem. The emergence of genetic modification in combination with stem cell transplantation for stem cell research provides a new way of thinking.
OBJECTIVE: To explore stem cell types for cardiac regeneration therapy, the selection of the therapeutic gene, the genes vectors and transplantation way and to overview the clinical application of gene-modified stem cells in the field of cardiovascular disease.
METHODS: A computer-based search of PubMed (2006-01/2013-12) was performed to collect articles about stem cells. The key words included “stem cells; genetic therapy; myocardial infarction; regenerative medicine; tissue construction”. Articles related to stem cells published recently or in high-impact journals were initially surveyed and finally 40 articles were included and summarized.
RESULTS AND CONCLUSION: The efficacy of stem cell transplantation may be significantly augmented by genetic modification. Bone marrow mesenchymal stem cells are one of the most widely used seed cells currently. The anti-apoptosis, pro-angiogenic, anti-inflammatory genes mediated by the adeno-associated virus and adenovirus were transfected into stem cells, so that the curative effect of stem cell transplantation will be significantly increased. Genetically modified stem cell transplantation has the potential application in a variety of clinical diseases, including myocardial infarction, but its long-term safety remains to be further studied.

全文链接：

Key words: stem cells, myocardial infarction, gene therapy, regenerative medicine

中图分类号:

R318

高青，李树仁 . 基因修饰干细胞治疗心肌梗死：临床前和临床应用中的相关问题[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5220-5224.

Gao Qing, Li Shu-ren. The preclinical and clinical application of genetically modified stem cells for the treatment of myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5220-5224.

图/表（结果） 1

2.1 常用于移植的干细胞类型干细胞属未分化的细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能。可通过一种或多种联合机制参与心脏修复的过程，包括分化为成熟心肌细胞、与宿主心肌细胞建立电-机械偶联或通过旁分泌活动产生生物活性分子等，而后者则被认为是改善左室功能的主要机制^[1]。目前用于移植的干细胞除了传统的的胚胎干细胞及成体干细胞以外，诱导多能干细胞的出现又为细胞移植类型提供了新的选择。　

2.1.1 骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞因其具有体外扩增能力强、免疫原性低、分泌生物活性物质多等优点而被广泛应用于基础及临床研究。2012年国际循证医学协作组完成关于骨髓细胞治疗急性心肌梗死的荟萃分析^[2]，结果发现：干细胞可提高左室射血分数，减少梗死面积并改善左室重构且获益可长期持续。该结果肯定了骨髓细胞在心肌修复中的作用，然而临床移植的效果可能受很多因素的影响，比如患者年龄偏大、骨髓中成体干细胞含量较低，缺氧条件下细胞存活受限，细胞迁移及定植率较低等。此外，应用骨髓间充质干细胞的安全性问题尚值得考虑。因此，采用各种预处理方法诱导其向心肌细胞定向分化将尤为必要。

2.1.2 骨骼肌干细胞与骨髓间充质干细胞一样，骨骼肌干细胞具有很多优点，包括安全性高、易于获取、不涉及伦理及宗教问题、易于在体外扩增并向肌源性分化且不用担心致瘤性的问题。此外其抗缺血特性及低免疫原性，为其在临床试验中的广泛开展提供可能，然而，其分化的心肌细胞却不能与宿主细胞间通过缝隙连接形成电-机械偶联，最终导致心律失常的发生。另外SEISMIC研究^[3]发现，骨骼肌干细胞移植4周后，心脏收缩功能并未明显提高。因此，骨骼肌干细胞的临床应用前景还有待考证。

2.1.3 心肌干细胞人们已经从多种动物及人体内分离出心肌干细胞，并且发现在人类心脏组织中存在血管源性(ckit⁺/KDR⁺)及肌源性(ckit⁺)两类心肌干细胞^[4]。多项动物研究发现移植后的心肌干细胞不仅能向肌源性血管分化，还可释放多种有益的旁分泌因子，如诱导内皮细胞迁移及保护心肌细胞的可溶性vCAM-1 ^[5]。鉴于动物实验获得的可喜成果，心肌干细胞Ⅰ期临床试验也在陆续开展，其中较为引人关注的有SCIPIO研究^[6]和CADUCEUS研究^[7]，二者均证实心肌干细胞移植治疗心肌梗死是安全可行的。并且SCIPIO研究的最终结果显示：急性心肌梗死患者在接受经冠状动脉移植心肌干细胞后，心肌梗死面积减少、心功能得以改善，2年随访结束时，患者也未出现严重不良反应。然而该结果还有待进一步大规模、多中心的Ⅱ期及Ⅲ期临床试验的验证。

2.1.4 胚胎干细胞胚胎干细胞是从哺乳动物的囊胚内细胞群中分化出来的一种原始、高度未分化细胞，具有无限的自我更新能力。研究发现，由人胚胎干细胞分化来的心肌细胞在功能上与人类心肌细胞极为相似^[8]，移植胚胎干细胞及其分化的心肌细胞均可使梗死的心肌再生并使左室收缩功能改善^[9]。另外胚胎干细胞还展现出较成体干细胞更为显著的旁分泌作用^[10]。这些旁分泌因子除了可减少宿主心肌细胞的凋亡，还可通过激活内源性ckt⁺Flk1⁺的内皮祖细胞来提高心脏的血管再生能力^[11]。然而不幸的是胚胎干细胞移植入心脏后表现出潜在的致瘤性^[12]。此外，应用过程中涉及到的道德、伦理以及免疫问题也是限制其在临床广泛开展的重要因素。

2.1.5 诱导多能干细胞自Takahashi等^[13]首次报道了通过反转录转染的方式将干细胞相关基因导入小鼠体细胞，进而得到分化全能性的诱导多能干细胞后，无疑给干细胞领域注入了一股新鲜的血液。诱导多能干细胞在形态、培养条件及分化特点等方面与胚胎干细胞极为相似，且因具有取材方便，无免疫排斥反应及不存在道德及伦理问题而颇受关注。有研究证明，由诱导多能干细胞分化的心肌细胞可表现出自发收缩活动并表达心肌特异性蛋白标记物及转录因子^[14-15]。然而，它和胚胎干细胞一样也表现出一定的致瘤性^[16]。因此，优化移植细胞、实施基因重编，采用心肌细胞来源的诱导多能干细胞等尝试极为必要。在急性心肌梗死动物模型中，移植成纤维源性的诱导多能干细胞后心肌表现出极大地再生能力^[17]。同样心肌源性诱导多能干细胞不仅大量的存活，而且在移植2-4周后也未发现肿瘤形成。最近有研究证实采用反转录病毒转导的方法将4种转录因子对骨骼肌干细胞进行重排后可产生诱导多能干细胞^[18]，这些诱导多能干细胞在理想的培养条件下可分化为心肌细胞。有研究者将诱导多能干细胞、衍生的心肌细胞以及骨骼肌干细胞分别移植到急性心肌梗死的心脏内，结果发现，移植有诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的小鼠心功能改善最为明显，且未发现有肿瘤形成^[16]。

2.2 治疗性基因的选择通过特定基因修饰细胞的方法可弥补单纯干细胞移植疗效的不足。目前基因转染干细胞移植治疗缺血性心脏病研究的目的基因大致分抗凋亡、促血管新生、促归巢及抗炎四大类。

2.2.1 延长寿命及增强抗凋亡能力的基因移植的干细胞在梗死心肌恶劣的微环境下较低的生存力是干细胞治疗用于临床的一大障碍^[19]。为此，人们尝试用抗凋亡作用基因如Pim-1、Akt及 Bcl-2等来对干细胞进行移植前修饰。研究表明，将Pim-1修饰的细胞移植到体内后细胞存活量显著增加且心功能明显改善^[20]。移植糖原合成酶激酶-3b(GSK-3b)修饰的骨髓间充质干细胞不仅能提高移植细胞生存力还可促使其向心肌表型分化^[21]。另外，采用组织性激肽释放酶基因修饰后的间充质干细胞可抵御缺氧诱导的凋亡及凋亡控制因子caspase-3的激活，并增加抗凋亡基因Akt的磷酸化^[22]。可见经抗凋亡基因修饰后的干细胞更能充分发挥其治疗作用。

2.2.2 促进血管生成的基因与血管生成有关的基因包括血管内皮生长因子、血管生成素1、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子等。其中血管内皮生长因子除了能促进血管生成，还能激活心肌内源性修复机制，减少梗死部位的炎症反应^[23]；血管生成素1不仅能促进血管生成还可以提高其移植细胞生存率。肝细胞生长因子是多种组织及细胞的生长因子，除促血管生成外，还可提高骨髓间充质干细胞的存活、改善组织重构。同样胰岛素样生长因子除了能促进毛细血管生长还有促进骨髓间充质干细胞向梗死部位迁移的作用。Shh基因可调控血管径加粗、变长和分叉，并可促进众多血管生成因子的分泌，Durrani等^[24]已在动物实验中验证了其血管再生作用，另外Shh基因还具有减少心肌细胞凋亡，促进骨髓来源内皮祖细胞迁移等作用。相信Shh基因会引起更多研究者的重视。

2.2.3 促进靶向归巢的基因无论采用何种移植方式，干细胞能否有效地归巢，将直接影响最终疗效。心肌梗死发生后，受损心肌组织将释放大量的细胞因子诱导干细胞向心脏归巢，如SDF-1、MCP-3、GDF-15、bFGF、GRO-1等^[25]。然而这些因子的释放时间极为短暂，其中最受关注的SDF-1释放仅能持续1周，而MCP-3则不足10 d^[26]。因此人们设想是否可在移植前对干细胞进行促归巢相关基因修饰进而提高其移植效率。不久，Pasha等^[27]证实，采用SDF-1修饰的骨髓间充质干细胞，不仅能促进干细胞迁移，还可改善细胞存活、促进血管生成。此外，将趋化因子SDF-1的受体CXCR4修饰的骨髓间充质干细胞静脉移植至缺血再灌注大鼠模型中，发现归巢的细胞数目明显增加、心功能得以改善，心室重构程度也减低^[28]。

2.2.4 抗炎基因免疫炎症反应是心肌受损后，机体自发启动的保护性修复机制。然而过度激活的炎症反应将导致心肌的进一步损伤。炎症反应发生时常伴有大量炎性因子的释放，如肿瘤坏死因子α、C-反应蛋白、白细胞介素1β及白细胞介素6等，其中尤以肿瘤坏死因子α最为引人关注。传统的抗炎药物治疗均未取得理想的疗效，而将肿瘤坏死因子的受体(TNFR)基因修饰的间充质干细胞移植到缺血的心肌组织中，心肌细胞凋亡却明显减少，心功能也较前改善^[29]。

近来研究发现，普遍存在于人和哺乳动物细胞内缺氧诱导因子1α可在缺氧条件下稳定表达。缺氧诱导因子1是具有转录活性的核蛋白，具有广泛的靶基因谱，能够控制下游100多种基因的表达^[30]，包括VEGF、EPO、GLUT-1、e-MET等，这些基因表达后参与红细胞及血管生成，参与核苷、氨基酸、糖的代谢和细胞存活、凋亡等活动，维持组织、细胞在缺氧条件下内环境的稳定^[31]。

2.3 基因修饰的载体选择及移植途径的探索

2.3.1 基因修饰载体的选择基因治疗中载体的选择是影响目的基因能否发挥治疗作用的关键。常用的表达载体包括病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体的应用更为广泛。

病毒载体：随着对病毒生物学性质的深入了解，病毒因高效的转染率而成为基因转导中的常用载体。目前病毒载体的种类较为丰富，包括反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等，其中反转录及慢病毒载体可将目的基因整合到靶细胞的基因组中而长期表达，但整合作用会影响内源基因和转基因的表达，而且应用慢病毒时有潜在感染HIV-1的危险。腺病毒因免疫原性、致癌性及携带基因能力有限、目的基因表达时间相对短暂等缺点而不宜在临床应用。然而腺相关病毒不与靶细胞染色体整合，并且能够在短时间内高效的表达目的基因。因此，腺相关病毒被视为最有前途的基因转移载体之一。

非病毒载体：尽管与病毒载体相比非病毒载体转导效率较低，但因其不具有免疫原性、致癌性等缺点，对人体而言则相对安全。在非病毒转染方法中，电穿孔、微量电穿孔及核转染是目前最有效的转染方法。除了大量基于脂质体及微囊泡的基因传递系统，纳米微粒在基因转染中的作用也越来越受关注^[32]。另一重要进展是利用转座子为中介将DNA传递至细胞，与病毒载体相比转座子载体功能更多、安全性更高、可控性更高。其中，piggyBac转座子已成为干细胞转染中最为活跃的载体^[33]。近期，piggyBac转座子已被用于构建小鼠及人类的诱导多能干细胞^[34]，转座子已成为哺乳动物细胞转染较为适宜的载体。

2.3.2 基因途径的选择有效的干细胞移植途经应该是将足够数量的细胞移植至心脏靶区，并保证细胞较高的定植率及存活率。因此移植途径的选择是决定临床疗效的重要因素。常用干细胞移植途径包括经静脉、经冠状动脉、经心外膜、经心内膜和经冠状窦注射等^[35-36]。静脉移植虽易于操作、创伤小，但细胞常因不能有效的归巢而影响移植效率。经开胸行心外膜或心内膜心肌内注射的方法创伤虽大，却能保证损伤的心肌局部足量的细胞。临床上最常用的方法是经导管冠脉内注射，该方法可最大程度的使细胞定植于损伤心肌，但却存在微血栓形成及细胞滞留率低的问题。与冠脉内注射一样，经冠状窦途径注射也可保证移植细胞准确定植于靶区，该方法正被应用于临床试验中^[37]。近几年，新兴技术组织工程贴片法正在试用中^[38]，但因存在众多不确定因素而尚未应用于临床。

2.4 基因治疗联合干细胞移植在心血管疾病中应用除了在心肌梗死及缺血性心脏病中的广泛应用，基因修饰干细胞移植治疗还在高血压、心律失常、扩张性心肌病及心功能不全等疾病领域展现出极大的发展空间。内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因是一种能够抑制损伤血管增生并使血管发生再内皮化进而预防血管再狭窄的基因，有研究证实，将内皮一氧化氮合酶基因导入动物后，发现它能降低血压、减少交感神经系统的活性、改善胰岛素抵抗，进而防止肾性高血压的进展^[39]。GATA-4是一种调控抗凋亡因子适应性以及与心脏肥大有关的基因，因此GATA-4可以逆转梗死左室的重构，为心脏衰竭的治疗提供新的方向^[40]。相信随着基因治疗联合干细胞移植技术的蓬勃开展，必将使更多临床疾病的治疗获益。

参考文献

[1] Fedak PW. Paracrine effects of cell transplantation: modifying ventricular remodeling in the failing heart. Semin Thorac Cardiovasc Surg. 2008;20(2):87-93.
[2] Clifford DM, Fisher SA, Brunskill SJ,et al. Stem cell treatment for acute myocardial infarction. Cochrane Database Syst Rev. 2012;2:CD006536.
[3] Duckers HJ, Houtgraaf J, Hehrlein C,et al. Final results of a phase IIa, randomised, open-label trial to evaluate the percutaneous intramyocardial transplantation of autologous skeletal myoblasts in congestive heart failure patients: the SEISMIC trial. EuroIntervention. 2011;6(7):805-812.
[4] D'Amario D, Fiorini C, Campbell PM,et al. Functionally competent cardiac stem cells can be isolated from endomyocardial biopsies of patients with advanced cardiomyopathies.Circ Res. 2011;108(7):857-861.
[5] Matsuura K, Honda A, Nagai T, et al. Transplantation of cardiac progenitor cells ameliorates cardiac dysfunction after myocardial infarction in mice.J Clin Invest. 2009;119(8):2204-2217.
[6] Bolli R, Chugh AR, D'Amario D,et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.Lancet. 2011;378(9806): 1847-1857.
[7] Makkar RR, Smith RR, Cheng K,et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 2012;379(9819):895-904.
[8] Asp J, Steel D, Jonsson M,et al. Cardiomyocyte clusters derived from human embryonic stem cells share similarities with human heart tissue. J Mol Cell Biol. 2010;2(5):276-283.
[9] Christoforou N, Oskouei BN, Esteso P,et al. Implantation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac progenitor cells preserves function of infarcted murine hearts. PLoS One. 2010;5(7):e11536.
[10] Crisostomo PR, Abarbanell AM, Wang M,et al. Embryonic stem cells attenuate myocardial dysfunction and inflammation after surgical global ischemia via paracrine actions.Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008;295(4):H1726-1735.
[11] Fatma S, Selby DE, Singla RD,et al. Factors Released from Embryonic Stem Cells Stimulate c-kit-FLK-1(+ve) Progenitor Cells and Enhance Neovascularization.Antioxid Redox Signal. 2010;13(12):1857-1865.
[12] Aldahmash A, Atteya M, Elsafadi M,et al.Teratoma formation in immunocompetent mice after syngeneic and allogeneic implantation of germline capable mouse embryonic stem cells.Asian Pac J Cancer Prev. 2013;14(10):5705-5711.
[13] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell. 2006;126(4):663-676.
[14] Gai H, Leung EL, Costantino PD,et al. Generation and characterization of functional cardiomyocytes using induced pluripotent stem cells derived from human fibroblasts.Cell Biol Int. 2009;33(11):1184-1193.
[15] Zhang J, Wilson GF, Soerens AG,et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.Circ Res. 2009;104(4):e30-41.
[16] Ahmed RP, Ashraf M, Buccini S,et al. Cardiac tumorigenic potential of induced pluripotent stem cells in an immunocompetent host with myocardial infarction.Regen Med. 2011;6(2):171-178.
[17] Nelson TJ, Martinez-Fernandez A, Yamada S,et al. Repair of acute myocardial infarction by human stemness factors induced pluripotent stem cells.Circulation. 2009;120(5): 408-416.
[18] Ahmed RP, Haider HK, Buccini S,et al. Reprogramming of skeletal myoblasts for induction of pluripotency for tumor-free cardiomyogenesis in the infarcted heart.Circ Res. 2011; 109(1): 60-70.
[19] Lu G, Haider HK, Jiang S,et al. Sca-1+ stem cell survival and engraftment in the infarcted heart: dual role for preconditioning-induced connexin-43.Circulation. 2009;119 (19):2587-2596.
[20] Quijada P, Toko H, Fischer KM, et al. Preservation of myocardial structure is enhanced by pim-1 engineering of bone marrow cells.Circ Res. 2012;111(1):77-86.
[21] Cho J, Zhai P, Maejima Y,et al. Myocardial injection with GSK-3β-overexpressing bone marrow-derived mesenchymal stem cells attenuates cardiac dysfunction after myocardial infarction.Circ Res. 2011;108(4):478-489.
[22] Gao L, Bledsoe G, Yin H,et al. Tissue kallikrein-modified mesenchymal stem cells provide enhanced protection against ischemic cardiac injury after myocardial infarction.Circ J. 2013; 77(8):2134-2144.
[23] Zisa D, Shabbir A, Suzuki G,et al.Vascular endothelial growth factor (VEGF) as a key therapeutic trophic factor in bone marrow mesenchymal stem cell-mediated cardiac repair. Biochem Biophys Res Commun. 2009;390(3):834-838.
[24] Durrani S, Haider KH, Ahmed RP,et al. Cytoprotective and proangiogenic activity of ex-vivo netrin-1 transgene overexpression protects the heart against ischemia/reperfusion injury.Stem Cells Dev. 2012;21(10): 1769-1778.
[25] Hoover-Plow J, Gong Y.Challenges for heart disease stem cell therapy.Vasc Health Risk Manag. 2012;8:99-113.
[26] Schenk S, Mal N, Finan A,et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor.Stem Cells. 2007;25(1):245-251.
[27] Pasha Z, Wang Y, Sheikh R,et al. Preconditioning enhances cell survival and differentiation of stem cells during transplantation in infarcted myocardium.Cardiovasc Res. 2008;77(1):134-142.
[28] Cheng Z, Ou L, Zhou X,et al. Targeted migration of mesenchymal stem cells modified with CXCR4 gene to infarcted myocardium improves cardiac performance.Mol Ther. 2008;16(3):571-579.
[29] Bao C, Guo J, Lin G,et al. TNFR gene-modified mesenchymal stem cells attenuate inflammation and cardiac dysfunction following MI.Scand Cardiovasc J. 2008;42(1):56-62.
[30] Tal R.The role of hypoxia and hypoxia-inducible factor-1alpha in preeclampsia pathogenesis. Biol Reprod. 2012;87(6):134.
[31] Hinkel R, Lebherz C, Fydanaki M,et al. Angiogenetic potential of Ad2/Hif-1α/VP16 after regional application in a preclinical pig model of chronic ischemia.Curr Vasc Pharmacol. 2013; 11(1):29-37.
[32] Park JS, Na K, Woo DG,et al. Non-viral gene delivery of DNA polyplexed with nanoparticles transfected into human mesenchymal stem cells.Biomaterials. 2010;31(1):124-132.
[33] Saridey SK, Liu L, Doherty JE,et al. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.Mol Ther. 2009;17(12):2115-2120.
[34] Woltjen K, Michael IP, Mohseni P,et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 2009;458(7239):766-770.
[35] Campbell NG, Suzuki K.Cell delivery routes for stem cell therapy to the heart: current and future approaches.J Cardiovasc Transl Res. 2012;5(5):713-726.
[36] Dib N, Khawaja H, Varner S,et al. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery.J Cardiovasc Transl Res. 2011;4(2):177-181.
[37] Tuma J, Fernández-Viña R, Carrasco A,et al. Safety and feasibility of percutaneous retrograde coronary sinus delivery of autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients with chronic refractory angina.J Transl Med. 2011;9:183.
[38] Fujimoto KL, Tobita K, Guan J,et al. Placement of an elastic biodegradable cardiac patch on a subacute infarcted heart leads to cellularization with early developmental cardiomyocyte characteristics.J Card Fail. 2012;18(7): 585-595.
[39] Gava AL, Peotta VA, Cabral AM,et al. Overexpression of eNOS prevents the development of renovascular hypertension in mice.Can J Physiol Pharmacol. 2008;86(7): 458-464.
[40] Guida V, Lepri F, Vijzelaar R,et al. Multiplex ligation-dependent probe amplification analysis of GATA4 gene copy number variations in patients with isolated congenital heart disease. Dis Markers. 2010;28(5):287-292.