大鼠颌骨来源骨髓间充质干细胞中Cbfα1/p56亚型的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.003

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (23): 3622-3626.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.003

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大鼠颌骨来源骨髓间充质干细胞中Cbfα1/p56亚型的表达

周建华¹，许艳彬²，邱建忠¹，陈正岗¹，江宏兵²，王莉莉³

青岛大学附属青岛市市立医院，¹口腔医学中心，³中心实验室，山东省青岛市 266011；²南京医科大学附属江苏省口腔医院，江苏省南京市 210029

修回日期:2014-03-14 出版日期:2014-06-04 发布日期:2014-06-04
通讯作者: 王莉莉，博士，青岛大学附属青岛市市立医院中心实验室，山东省青岛市 266011
作者简介:周建华，男，1978年生，四川省资阳市人，汉族，2007年南京医科大学毕业，硕士，讲师，主要从事颌骨的修复与重建研究。
基金资助:
青岛市科技局项目支撑计划(KJZD-12-33-nsh)

Expression of Cbfα1/p56 subtype in bone marrow mesenchymal stem cells from rat mandible

Zhou Jian-hua¹, Xu Yan-bin², Qiu Jian-zhong¹, Chen Zheng-gang¹, Jiang Hong-bing², Wang Li-li³

¹Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao University, Qingdao 266011, Shandong Province, China; ²Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital of Jiangsu Province, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; ³Department of Central Laboratories, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao University, Qingdao 266011, Shandong Province, China

Revised:2014-03-14 Online:2014-06-04 Published:2014-06-04
Contact: Wang Li-li, M.D., Department of Central Laboratories, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao University, Qingdao 266011, Shandong Province, China
About author:Zhou Jian-hua, Master, Lecturer, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao University, Qingdao 266011, Shandong Province, China
Supported by:
the Supporting Project of Qingdao Science and Technology Bureau, No. KJZD-12-33-nsh

摘要/Abstract

摘要：

背景：与来源于中胚层间充质的躯干四肢骨不同，颌骨来源于颅神经嵴外胚间充质，具有独特的膜内成骨机制。核心结合因子Cbfα1是骨分化的关键性转录因子，但其p56亚型在颌骨组织中的作用尚不明确。

目的：研究Cbfα1/p56亚型在大鼠颌骨来源骨髓间充质干细胞中的表达及意义。

方法：原代培养大鼠颌骨和髂骨来源的骨髓间充质干细胞，采用ELISA法检测骨髓间充质干细胞中的碱性磷酸酶活性，荧光定量PCR法检测骨髓间充质干细胞中Cbfα1/p56和p57亚型的mRNA相对表达量。

结果与结论：成功培养出大鼠颌骨和髂骨来源的骨髓间充质干细胞，颌骨来源骨髓间充质干细胞的增殖能力及碱性磷酸酶活性明显高于髂骨；在培养第6天，颌骨来源骨髓间充质干细胞的Cbfα1/p56亚型mRNA相对表达量高于髂骨来源骨髓间充质干细胞(P < 0.05)，而Cbfα1/p57亚型在各培养时间点的mRNA 相对表达量两组间差异均无显著性意义(P > 0.05)。结果提示Cbfα1/p56亚型对颌骨来源骨髓间充质干细胞的早期成骨分化具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 核心结合因子α1, 亚型, p56, p57, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, 颌骨, 髂骨

Abstract:

BACKGROUND: Unlike the ilium derived from the paraxial mesoderm, the mandible from cranial neural crest has a unique mechanism. Core binding factor α1 (Cbfα1) is a key transcription factor for skeletogenic process. However, the role of Cbfα1/p56 subtype in mandible tissue is yet not clear.

OBJECTIVE: To research the expression of Cbfα1/p56 subtype in bone marrow mesenchymal cells from rat mandible in vitro.

METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from rat mandible and ilium were in vitro isolated and purified by primary culture. The characteristics of bone marrow mesenchymal cells were compared through the methods of enzyme linked immunosorbent assay and real-time PCR, including growth curve, alkaline phosphatase activity and relative mRNA expression of Cbfα1 subtypes.

RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal cells from rat mandible and ilium were successfully obtained. Bone marrow mesenchymal cells from the mandible proliferated more rapidly, alkaline phosphatase activity of which was higher than iliac cells. The relative mRNA expression of Cbfα1/p56 subtype in bone marrow mesenchymal cells from the mandible was more than that in iliac cells at 6 days of culture (P < 0.05), while the expression of Cbfα1/p57 in each time showed no statistical significance (P > 0.05). The results showed that Cbfα1/p56 is very significant in the early osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal cells from the mandible.

全文链接：

Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, ilium, mandible, core binding factor alpha 1 subunit

中图分类号:

R394.2

周建华，许艳彬，邱建忠，陈正岗，江宏兵，王莉莉. 大鼠颌骨来源骨髓间充质干细胞中Cbfα1/p56亚型的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3622-3626.

Zhou Jian-hua, Xu Yan-bin, Qiu Jian-zhong, Chen Zheng-gang, Jiang Hong-bing, Wang Li-li. Expression of Cbfα1/p56 subtype in bone marrow mesenchymal stem cells from rat mandible[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3622-3626.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

设计：动物实验和体外细胞实验。

时间及地点：实验于2012年5月至2013年6月在青岛大学附属青岛市市立医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：1月龄雄性SD大鼠10只，体质量(150± 10) g，用作原代细胞培养，由青岛大学附属青岛市市立医院动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

实验方法：

骨髓间充质干细胞原代培养：将大鼠处死，体积分数为75%乙醇浸泡，无菌条件下取出双侧下颌骨和髂骨，去净骨膜；PBS清洗3次，暴露骨髓腔，培养基反复冲出骨髓细胞，悬液以1 000 r/min离心3 min，去上清，含体积分数为20%胎牛血清高糖DMEM培养基重悬后细胞计数，接种于细胞培养瓶内培养。接种后72 h首次换液，以后每4 d换液1次。倒置相差显微镜观察细胞生长情况。待细胞相互融合覆盖瓶底达85%以上进行传代^[5-8]。

骨髓间充质干细胞生长曲线绘制：消化、计数原代细胞，以每孔1.0×10³/cm²个细胞接种于6孔培养板中。接种时间记为0 h；从接种时间算起，每隔24 h随机计数3孔细胞数，计算平均值。为提高准确率，对每孔细胞计数3次取均值。如此操作至第14天。以培养时间为横坐标、细胞平均数为纵坐标，绘制培养细胞的生长曲线。

ELISA法检测骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性：取首次传代的骨髓间充质干细胞消化后以1.0×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于96孔板，每孔100 μL，实验组24 h后更换成骨诱导培养液(体积分数为10%胎牛血清高糖DMEM，10^-⁸ mol/L地塞米松，100 μmol/L抗坏血酸和10 mmol/L β-磷酸甘油钠)；对照组采用普通培养液培养，分别于第3，6，9天检测各组的碱性磷酸酶活性。采用大鼠骨特异性碱性磷酸酶ELISA检测试剂盒，操作步骤按说明书进行， 450 nm波长依序测量各孔的吸光度值。

颌骨和髂骨来源骨髓间充质干细胞总RNA提取和反转录：大鼠颌骨和髂骨来源骨髓间充质干细胞首次传代后分别培养3，6，9 d后，采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，提取步骤按试剂盒说明进行。紫外核酸分光光度计检测吸光度值，并计算RNA浓度，取1 μg RNA，按照RT-PCR试剂盒步骤进行反转录得到cDNA模板。

Cbfα1各亚型在骨髓间充质干细胞中的表达差异：采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR试剂盒和Applied Biosystems 7300 Real-time PCR仪检测骨髓间充质干细胞Cbfα1/p56和Cbfα1/p57亚型mRNA相对表达量。以β-actin为内参，PCR扩增应用的引物序列见表1，由上海生工有限公司合成。扩增体系为：SYBR Taq Mix10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，正向引物和反向引物各0.2 mmol/L，cDNA模板20 ng，加灭菌双蒸水至25 μL；扩增条件为：95 ℃ 30 s，40个循环包括：95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s。每个样品均重复3次，根据相应Ct值结果，采用下面的定量公式来分析相关基因拷贝数的变化^[9]：倍数变化= 2^-^ΔΔCt，ΔΔCt=(待测基因Ct值-待测基因β-action Ct值)-(标准基因Ct值-标准基因β-action Ct值)。

主要观察指标：①倒置显微镜下每日观察颌骨和髂骨来源骨髓间充质干细胞形态、生长及贴附情况。②ELISA测定颌骨和髂骨来源骨髓间充质干细胞中的碱性磷酸酶含量。③荧光定量PCR法检测Cbfα1/p56、p57亚型在颌骨和髂骨来源骨髓间充质干细胞相对表达量。

统计学分析：结果用x(_)±s表示。实验所得数据均用SPSS 17.0统计软件进行分析，组间比较采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

骨髓间充质干细胞具有多分化潜能，可以分化为成骨细胞、脂细胞、软骨细胞和肌原细胞等，是细胞工程及组织工程中常用的种子细胞^[10-14]。与来源中胚层间充质的躯干四肢骨不同，颌骨来源于颅神经嵴源外胚间充质，具有独特的膜内成骨机制。因此，比较颌骨与躯干四肢骨来源骨髓间充质干细胞的生物学特性及基因表达差异性对研究颌骨的再生修复机制具有重要作用。

地塞米松、β-磷酸甘油钠和抗坏血酸是成骨分化和体外成骨的必要条件^[15-17]。本实验加入成骨诱导培养液成功诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，这与国内外相关研究结果一致。研究证实地塞米松可以促进成骨细胞的分化成熟，提高碱性磷酸酶活性、骨钙素及Ⅰ型胶原的表达^[18]。但是地塞米松具有双重诱导作用，剂量大于10^-⁶ mol/L可能激活细胞表面的糖皮质激素受体，抑制骨钙素的表达，导致向脂肪细胞分化，因此本实验将10^-⁸ mol/L地塞米松加入成骨诱导培养液，充分发挥其成骨诱导的作用。β-磷酸甘油钠被碱性磷酸酶分解后能为成骨细胞提供钙化所需的磷酸离子，增加碱性磷酸酶在成骨细胞中的表达，促进生理性钙盐的沉积和钙化^[19-20]。抗坏血酸能促进细胞合成胶原，形成钙化。

碱性磷酸酶是成骨细胞分化和功能成熟的早期标志，测定碱性磷酸酶活性的变化可以了解骨髓间充质干细胞成骨分化的成熟程度和细胞矿化的能力^[21-22]。本研究发现，成骨诱导后第9天，颌骨来源的骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶活性明显高于髂骨，提示颌骨比髂骨骨髓间充质干细胞具有更显著的增殖能力及成骨潜能，可能与颌骨骨髓间充质干细胞中高表达促成骨细胞分化的骨关键转录因子Cbfα1有关^[23]。

Cbfα1通过调节生长因子和骨特异性细胞外基质的基因表达而参与成骨细胞的分化和骨发育过程，其表达异常可阻碍膜内成骨和软骨内成骨的发生^[24]。研究发现在Cbfα1(+/-)杂合子小鼠中，锁骨明显发育不全，膜状骨发育和颅骨钙化延迟，出现与人锁骨头颅发育不良综合征(cleidocranial dysplasia，CCD)完全一致的表型^[25-27]。Zhang等^[28]研究发现敲除Cbfα1/p57亚型的转基因小鼠膜内颌骨发育正常，而躯干四肢骨出现发育不良或缺乏。由于颌骨与躯干四肢骨成骨方式不同，上述研究结果进一步提示Cbfα1各亚型对膜内成骨及软骨内成骨的分子调控具有差异性。

本研究发现，在培养第6天及以后，颌骨来源的骨髓间充质干细胞Cbfα1/p56亚型在mRNA相对表达量高于髂骨来源骨髓间充质干细胞；而培养第3天则与髂骨来源骨髓间充质干细胞并无差异，可能与培养初期骨髓间充质干细胞数量过少有关。Cbfα1/p57亚型在各个对应培养时间点的mRNA表达两组间均无差异。以上结果提示颌骨与髂骨成骨分化的差异性可能与早期p56亚型的表达有关，Cbfα1/p56在早期的成骨分化及膜内成骨过程中起着至关重要的作用^[29-32]。颌骨与髂骨骨髓间充质干细胞的生物学差异性可能与这两者的骨骼胚胎发育密切相关。研究证实在颅神经嵴外胚间充质来源的颌骨与中胚层间充质来源的髂骨中，同源盒基因Hoxa2(homeoboxa2，Hoxa2)的分子调控具有显著差异性^[33-34]。与躯干四肢骨中Hoxa2的阳性表达不同，Hoxa2在颌骨中呈现表达抑制状态^[35]。因此有理由认为转录因子Cbfα1处于Hoxa2基因下游，Hoxa2可能通过下调Cbfα1/p56亚型抑制髂骨骨髓间充质干细胞中与膜内成骨相关的成骨分化，导致髂骨骨髓间充质干细胞的生物学特性下降。与此相反，Cbfα1/p56及p57亚型共同参与颌骨的分子调控，成骨分化具有显著优势。颌骨是人体重要的组织，在面形、语言、呼吸、咀嚼等方面起着重要作用，颌骨发育异常或缺损将直接导致颜面畸形，引起严重的功能障碍，在生理、心理、社会等各方面给人们造成不利的影响。本研究证实Cbfα1亚型在颌骨及髂骨来源的骨髓间充质干细胞中表达具有差异性，颌骨来源的骨髓间充质干细胞Cbfα1/p56亚型早期表达更高；颌骨来源的骨髓间充质干细胞具有更强的增殖和成骨能力。但Cbfα1亚型调控骨髓间充质干细胞成骨向分化的分子调控信号通路仍需进一步的深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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Expression of Cbfα1/p56 subtype in bone marrow mesenchymal stem cells from rat mandible

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