生长因子可促进自体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：生长因子是干细胞强有力的动员剂，可以增加注射细胞的黏附力和增殖力，诱导干细胞向梗死区迁移、增殖分化，参与心肌修复。
目的：观察肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子的联合应用在骨髓间充质干细胞自体移植治疗心肌梗死中的作用。
方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞，原代培养后采用红光荧光染料CM-Dil标记。结扎冠脉前降支制作兔急性心肌梗死模型，然后随机均分为对照组、骨髓间充质干细胞组、肝细胞生长因子+胰岛素样生长因子组和肝细胞生长因子+胰岛素样生长因子+骨髓间充质干细胞组。于心肌梗死区心肌内分4点共注射不同干预试剂。Masson三色法染色检测存活心肌；免疫荧光检测骨髓间充质干细胞分化；心脏超声评价心功能。
结果与结论：建模后4周，肝细胞生长因子+胰岛素样生长因子+骨髓间充质干细胞组CM-Dil/cTNT+细胞数量明显多于骨髓间充质干细胞组，其存活心肌最多，左室射血分数改善最明显，左室舒张末径最小。肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子联合应用促进自体移植的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，增加存活心肌数量，改善心功能，抑制心室重构，可能成为心肌梗死后细胞治疗的有效方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 心肌梗死, 心肌细胞, 肝细胞生长因子, 胰岛素样生长因子

Abstract:

BACKGROUND: The growth factor is a potent mobilization agent for stem cells, which can increase adhesion and proliferation of injected cells, induce stem cells to migrate to the infarct zone, proliferate, differentiate, as well as participate in myocardiac repair.
OBJECTIVE: To investigate the effect of hepatocyte growth factor (HGF) and insulin-like growth factor (IGF) on transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) after acute myocardial infarction.
METHODS: Primary rabbit BMSCs were cultured in vitro and labeled by red fluorescence dye CM-Dil for transplantation. After the mid third of left anterior descending was ligated, model rabbits were grouped into four groups: control group, BMSCs group, HGF+IGF group, and HGF+IGF+BMSCs group (n=6 in each group). Different interventional agents were injected into the myocardium at four sites within the ischemic region. Masson trichrome staining was performed to determine viable myocardium, and immunofluorescence staining was used to identify BMSCs differentiation. The cardiac function was assessed with Doppler echocardiography.
RESULTS AND CONCLUSION: Four weeks after treatment, CM-Dil/cTNT+ cells significantly increased in the HGF+IGF+BMSCs group, compared with BMSCs group. Consequently, viable myocardial tissues significantly increased, left ventricular ejection fraction was significantly improved, and left ventricular end-diatolic volume significantly decreased in the HGF+IGF+BMSCs group, relative to the other three groups. Combination of HGF and IGF that promotes differentiation of transplanted autologous BMSCs into cardiomyocytes, thus increasing viable myocardium, improving left ventricular function, and inhibiting left ventricular remodeling, may be a new method for the cell treatment of acute myocardial infarction.

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Key words: stem cells, bone marrow, mesenchymal stem cells, myocardial infarction, myocytes, cardiac, hepatocyte growth factor

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

心肌梗死是目前严重危害人类健康的疾病之一，由于成体心肌细胞缺乏足够再生能力，因而梗死后将导致心肌细胞不可逆的丢失，并被纤维瘢痕组织取代，最终导致心力衰竭。心衰是心肌梗死致死的主要原因之一。如何促进缺血坏死区心肌再生，防止心室重构，已成为防止心肌梗死后心衰发生及降低远期病死率的关键^[1-2]。近年来随着分子生物学和细胞生物工程技术的发展以及对干细胞研究的深入，通过细胞移植技术，试图将干细胞移入受损心肌组织中分化为心肌细胞，替代坏死心肌改善心功能，这为心肌梗死后心衰提供了一种全新的治疗策略^[2-4]。2001年德国移植免疫和细胞治疗研究所Strauer等首次对心肌梗死患者尝试自体骨髓干细胞移植，10周后发现患者左心室周长缩小，心脏指数、左心射血分数、心输出量等均有明显改善，坏死心肌的平均面积由24.6%减至15.7%。目前，干细胞移植治疗心肌梗死虽未能广泛应用于临床治疗，但已能预见其广阔前景^[5-6]。

骨髓间充质干细胞具有分化为心肌细胞的潜能，补充丢失的心肌细胞并通过旁分泌等机制增强心功能，为心肌梗死提供一种全新的治疗方法，是心肌梗死后心肌细胞再生治疗的新希望。应用干细胞移植有可能取代受损心肌细胞并建立新的血管来供应血运^[7-8]，然而大量动物实验及临床试验并没有得到满意的临床效果^[9-13]，主要原因可能是骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的能力较弱，不能提供足够的新生心肌细胞进行损伤后修复^[14-15]。因此，促进移植的骨髓间充质干细胞在体分化成为研究热点。王欢等^[16]研究认为骨髓间充质干细胞可能通过旁分泌作用改善大鼠心肌梗死后心肌重构，减少心肌细胞凋亡。徐信群等^[17]探讨骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠损伤心肌的修复效果，认为骨髓间充质干细胞可在心肌梗死的大鼠心脏分化为心肌样细胞，提高梗死区毛细血管密度，进而改善心功能。

生长因子是干细胞强有力的动员剂，可以增加注射细胞的黏附力和增殖力，诱导干细胞向梗死区迁移、增殖分化，参与心肌修复。肝细胞生长因子是一种肝素结合蛋白质，对肝素具有较强的亲和力，肝细胞生长因子具有类似散射因子的功能，在一些上皮细胞和内皮细胞培养体系中加入不同浓度，均可促进细胞扩散和迁移^[18]。胰岛素样生长因子最早曾被称为硫化因子，后来又称之为生长介素，胰岛素样生长因子参与体内几乎每个器官的生长和功能，是一类具有广泛生物学功能的细胞因子，可促进细胞增殖、分化，抑制凋亡，还具有胰岛素样的生物学活性^[19]。已有研究发现，肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子的联合应用促进心肌细胞再生^[20]。前期体外实验证实，这两种细胞因子联合应用促进骨髓间充质干细胞表达GATA4^[21]。实验将进一步观察肝细胞生长因子+胰岛素样生长因子能否促进骨髓间充质干细胞的在体分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞形态学观察。

时间及地点：实验于2011年1至8月在中国医科大学动物实验室及中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康成年日本大耳白兔31只，体质量2.0-2.5 kg，雌雄不拘，购于沈阳市药科大学，动物质量合格证号：SYXY(沈) 2009-0026。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

主要仪器：实验应用主要仪器设备包括凹槽形动物手术台(自行设计制作)、荧光显微镜及照相系统(IX70，日本OLYMPUS公司)、Image Pro Plus 4.5图像分析系统(MediaCybernetics公司，美国)。

主要试剂：红光荧光细胞染料CM-Dil 购于美国Sigma 公司；4’，6二脒基-2-苯吲哚(4’，6-diamidino-2- phenylindole, DAPI)购于成都贝斯特试剂有限公司；鼠抗兔心肌特异性肌钙蛋白T(cTNT)抗体购自英国Abcam公司。

方法：

骨髓间充质干细胞培养和标记：成年日本大耳白兔于髂前上棘抽取骨髓液，采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞^[22-24]。将细胞稀释液加于1.077 g/mL的Ficoll试剂上，1 500 r/min离心20 min。所得细胞悬浮于细胞培养液中，置于含体积分数5%CO₂，37%湿度的培养箱内。培养液含有：40% MCDB201、5% DMEM/F12 培养基、体积分数2%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和链霉素。培养48 h后换液并保留贴壁细胞，以后每周换液2次，至汇合度达90%。移植前以0.25%的胰酶收获细胞。红光荧光细胞染料CM-Dil购于美国Sigma公司。预先用DMSO溶解。按每mL细胞悬液加2 μL Dil 染料溶液(共2×10⁷细胞)，混匀后置于37 ℃恒温箱中孵育5 min，然后于4 ℃环境中静置 15 min。将标记好的细胞用37 ℃预温的PBS洗涤3次，悬浮于50 μL生理盐水中备用。荧光显微镜观察细胞的体外标记效率在95%以上。

急性心肌梗死模型的制作及分组：急性心肌梗死模型制作参见文献[25-28]。建模成功的28只大鼠随机分数字表法均分为4组(n=7)：对照组、骨髓间充质干细胞组、肝细胞生长因子+胰岛素样生长因子组和联合治疗组。建模后即刻于心肌梗死区心肌内分4点共注射50 μL生理盐水(对照组)、2×10⁷个自体骨髓间充质干细胞(骨髓间充质干细胞组)、1 μg肝细胞生长因子和1 μg胰岛素样生长因子(肝细胞生长因子+胰岛素样生长因子)或1 μg肝细胞生长因子+ 1 μg胰岛素样生长因子和2×10⁷个骨髓间充质干细胞(联合治疗组)。建模后连续3 d腹腔注射青霉素80×10⁴ U抗感染。4周后处死动物，取心肌梗死区内组织用于免疫组化分析。

免疫组化分析：心肌组织制成5 μm切片。行Masson三色法染色检测存活心肌。行抗心肌特异性肌钙蛋白T (Cardiac specific troponin T，cTNT)抗体标记心肌细胞。用4'，6二脒基-2-苯吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)进行细胞核染色。采用荧光显微镜进行观察。每张切片随机采集5个非重叠视野图像，用Image Pro Plus 6.0 (IPP，Media Cybernetics，美国)软件分析图像，阳性目标转化为吸光度值进行量化分析。

心功能评价：采用心脏超声测定左室射血分数及左室舒张末容积，评价给药后4周心功能。

主要观察指标：骨髓间充质干细胞的分化及鉴定，心肌存活及心功能的观察。

统计学分析：由第一作者采用采用统计SPSS 13.0软件处理数据，结果用x(_)±s表示，两组比较采用两样本t 检验，多组比较采用单因素方差分析，P < 0.05认为差异有显著性意义。

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讨论

干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的细胞。目前，尝试用于治疗心肌梗死的干细胞大致可分为两大类，胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞主要包括胚胎心肌细胞和胚胎干细胞。成体干细胞主要包括骨骼肌干细胞、骨髓干细胞和外周血干细胞^[29]。到目前为止，科学家已从啮齿类、兔、猪和灵长类动物体内分离得到胚胎干细胞系。胚胎干细胞可在体外生长，并能在原始未分化状态下无限增殖，且仍能保持其多能性和正常核型。杨虹等^[30]探讨经反转录病毒载体介导的胰岛素样生长因子1基因转染胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞胰岛素样生长因子1的表达及移植于大鼠慢性心梗模型后对心功能的影响，实验结果显示移植细胞在移植区存活，作者认为胰岛素样生长因子1基因转染心肌细胞后表达分泌胰岛素样生长因子1增加，可促进梗死区新生血管形成，有利于移植细胞的存活，能更好地改善心功能。与胚胎干细胞相比，成体干细胞容易从自体采集，避免了胚胎干细胞移植所面临的伦理学纠纷，而且自体移植不存在免疫排斥反应，适合临床应用，因而成体干细胞成为近几年干细胞移植领域的主要研究对象，而研究最多的成体干细胞则是骨髓干细胞，骨髓干细胞分化为心肌细胞和血管内皮细胞，由两个关键因素决定-损伤的组织环境和足够数量的多能干细胞^[31-32]。

已有体外实验发现，肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子1明显增加与心肌细胞共培养的骨髓间充质干细胞表达GATA4，促进其向心肌细胞分化^[21]。然而，随后的研究并没有发现肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子1联合应用促进骨髓间充质干细胞在体分化^[33]。推测以下的原因可能解释体内外实验结果的差异：①体内实验为同种异体骨髓间充质干细胞移植。虽然机体对异体骨髓间充质干细胞无免疫排斥反应，但已明确异体的骨髓间充质干细胞将激活免疫系统进而影响其治疗效果^[34]。②局部注射将丢失大量细胞因子，因此离体实验的量对于在体实验可能远远不足^[35-37]。为了消除上述因素的影响，实验采用了自体骨髓间充质干细胞移植并显著提高了肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子1局部注射剂量(增加约1 000倍)，结果得到了阳性发现，证实了体外实验的机制。

移植治疗后6周，肝细胞生长因子+胰岛素样生长因子+骨髓间充质干细胞组中CM-Dil/cTNT⁺细胞数量明显增加，提示肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子1可促进自体移植的骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞，存活心肌数量的增加和心功能的改善进一步证实移植骨髓间充质干细胞介导的心肌细胞再生的增强。虽然没有直接观察新生心肌细胞的功能，但本研究发现这些骨髓间充质干细胞源性的心肌细胞与原有细胞排列紧密，说明它们已经在功能上进行了整合。而且提高的心功能也提示新生心肌细胞可在功能上可以取代原有心肌细胞。

细胞因子可能通过以下机制促进骨髓间充质干细胞分化：①肝细胞生长因子是一种促进细胞有丝分裂的多功能因子，可以激活c-Met受体，促进基质金属蛋白酶形成和消化胶原纤维，有利于细胞向目的区域迁移^[38]。②肝细胞生长因子能抑制移植的干细胞凋亡，增强其存活与增殖^[39-41]。③胰岛素样生长因子1能促进心肌梗死后血管再生，增加组织灌注，为移植的干细胞存活提供基础^[42-43]。④心肌梗死后胰岛素样生长因子1可以维持心肌组织结构，抑制心室扩张，为干细胞修复提供保障^[44-45]。

研究限制：没有在体内观察新生心肌细胞功能；而且本实验采用兔心肌梗死模型，可能与人类病理生理过程存在差异。

总之，肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子1的联合应用能促进自体移植的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，参与心肌梗死后心肌组织修复，改善心功能，抑制心室重构，可能成为心肌梗死后干细胞治疗的有效方法。