组蛋白去乙酰化酶在卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.007

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (10): 1514-1520.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.007

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组蛋白去乙酰化酶在卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞中的表达

刘大勇¹，邰勇^1，2，王梅蕊^1，2，崔婷¹，刘萍¹，赵梦明¹，贾智¹

¹天津医科大学口腔医院牙体牙髓科，天津市 300070；²天津医科大学附属第二医院口腔科，天津市 300211

出版日期:2014-03-05 发布日期:2014-03-05
通讯作者: 贾智，副教授，天津医科大学口腔医院牙体牙髓科，天津市 300070
作者简介:刘大勇，男，1972年生，2011年首都医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事牙齿相关干细胞与组织再生方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81371109)

Histone deacetylases mRNA profile in mesenchymal stem cells derived from ovariectomized mice

Liu Da-yong¹, Tai Yong^{1, 2}, Wang Mei-rui ^{1, 2}, Cui Ting¹, Liu Ping¹, Zhao Meng-ming¹, Jia Zhi¹

¹ Department of Endodontics, Tianjin Medical University School of Stomatology, Tianjin 300070, China; ²Department of Stomatology, the Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China

Online:2014-03-05 Published:2014-03-05
Contact: Jia Zhi, Associate professor, Department of Endodontics, Tianjin Medical University School of Stomatology, Tianjin 300070, China
About author:Liu Da-yong, M.D., Attending physician, Department of Endodontics, Tianjin Medical University School of Stomatology, Tianjin 300070, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81371109

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞的多向分化能力在骨代谢疾病中发挥重要作用，受激素、细胞因子等多种因素调节。目前骨髓间充质干细胞骨向分化的表观遗传学调控机制尚不明确，组蛋白去乙酰化酶与骨质疏松的关系尚需进一步探讨。
目的：建立雌激素缺乏骨质疏松小鼠的实验动物模型，检测骨髓间充质干细胞组蛋白去乙酰化酶1，3，4 mRNA表达水平，探索卵巢切除小鼠骨组织形成障碍的表观遗传学机制。
方法：昆明种小鼠30只随机等分为模型组和假手术组。小鼠适应性喂养7 d后，模型组小鼠切除双侧卵巢，造成雌激素缺乏骨质疏松实验动物模型，假手术组小鼠仅切除等量脂肪组织。
结果与结论：模型组小鼠股骨骨小梁稀疏或断裂，骨小梁宽度变窄，骨小梁间距变宽，骨小梁占视野面积降低。与假手术组相比，模型组小鼠骨髓间充质干细胞中组蛋白去乙酰化酶3 mRNA表达水平显著降低，组蛋白去乙酰化酶1，4表达水平变化差异无显著性意义。提示雌激素缺乏导致骨髓间充质干细胞去乙酰化状态改变可能是骨形成障碍的重要原因之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨质疏松症, 骨代谢, 组蛋白去乙酰化酶, 骨髓间充质干细胞, 表观遗传学, 细胞分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: As the multipotent differentiation potential, bone marrow mesenchymal stem cells exert an important role in bone metabolism disorders, which is regulated by a variety of hormones and cytokines. Currently, the epigenetic regulatory mechanisms underlying osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells are unclear, and association between histone deacetylase (Hdac) and osteoporosis needs to be further explored.
OBJECTIVE: To investigate the epigenetic mechanisms of bone formation by analyzing the expression of Hdac1, 3, 4 mRNA profile in bone marrow mesenchymal stem cells isolated from ovariectomized mice.
METHODS: A total 30 female healthy Kunming mice were randomly divided into sham group and ovariectomy group. After 7 days of adaptive feeding, mice in the ovariectomized group (n=15) were subject to bilateral ovariectomy; mice in sham group (n=15) were sham-operated.
RESULTS AND CONCLUSION: In the ovariectomy group, the trabecular bone of the femur was sparse or broken, the width of trabecular bone was narrowed, the trabecular separation was widened, and the trabecular bone volume was reduced. The level of Hdac3 mRNA was lower in bone marrow mesenchymal stem cells from ovariectomized mice compared with controls, but there was no significance between Hdac1, Hdac4 mRNA expression of the two groups. These findings demonstrate that Hdac might play an important role in bone remodeling in the model of estrogen deficiency-induced osteoporosis.

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Key words: cell differentiation, mesenchymal stem cells, ovariectomy, osteoporosis

中图分类号:

R394.2

刘大勇，邰勇，王梅蕊，崔婷，刘萍，赵梦明，贾智. 组蛋白去乙酰化酶在卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1514-1520.

Liu Da-yong, Tai Yong, Wang Mei-rui, Cui Ting, Liu Ping, Zhao Meng-ming, Jia Zhi. Histone deacetylases mRNA profile in mesenchymal stem cells derived from ovariectomized mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1514-1520.

图/表（结果） 4

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引言

目前全世界目前约有2亿人患骨质疏松症，其发病率已跃居各种常见病的第7位。研究骨质疏松及其引起的骨折的发病规律和危险因素，合理进行骨质疏松预防，对于提高人群的生活质量具有重大意义。
人体骨骼循环重复着骨重建的平衡过程。这一过程由成骨细胞和破骨细胞共同参与。在病理状态下，新骨的形成相对旧骨的吸收不足，从而导致骨丢失最终引起骨质疏松^[1] 。骨组织主要由来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞分泌胶原基质并进行矿化形成^[2] 。研究发现，多种因素包括激素、生长因子、转录因子以及免疫系统等均可以调节骨髓间充质干细胞的骨向分化^[3-8] ，但是目前表观遗传学对于骨髓间充质干细胞骨向分化这一过程的调控机制尚不明确，需要进一步的探讨。
表观遗传学是与遗传学相对应的概念，是20世纪80年代逐渐兴起的一门学科，是在研究与经典的孟德尔遗传学遗传法则不相符的许多生命现象过程中逐步发展起来的。经典的孟德尔遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学是研究没有DNA序列变化的、可遗传的表达改变的科学^[9] ，其调控机制涉及DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、染色质重塑和微小RNA调控等^[10-23] 。其中组蛋白翻译后修饰是以基因组为模板的各种生命进程调节的核心机制，参与染色质相关的许多重要的生物学过程。组蛋白乙酰化修饰过程由组蛋白去乙酰化酶和组蛋白乙酰化酶共同调控^[24] 。
组蛋白去乙酰化酶是一类蛋白酶，能对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。一般情况下，组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离、核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，并由组蛋白乙酰化转移酶和组蛋白去乙酰化酶共同调控。组蛋白乙酰化转移酶将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，组蛋白去乙酰化酶使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制。在癌细胞中，组蛋白去乙酰化酶的过度表达导致去乙酰化作用的增强，通过恢复组蛋白正电荷, 从而增加DNA与组蛋白之间的引力, 使松弛的核小体变得十分紧密, 不利于特定基因的表达, 包括一些肿瘤抑制基因。组蛋白去乙酰化酶抑制剂则可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化，从而调控细胞凋亡及分化相关蛋白的表达和稳定性，诱导细胞凋亡及分化，成为一类新的抗肿瘤药物。组蛋白去乙酰化酶抑制剂不仅对多种血液系统肿瘤和实体瘤具有良好的治疗作用，而且具有肿瘤细胞相对较高选择性和低毒的优点。研究表明组蛋白去乙酰化酶在调控成骨和软骨细胞分化中起到重要作用^[25] 。已有研究显示组蛋白去乙酰化酶3和组蛋白去乙酰化酶7在所有骨中均有表达，组蛋白去乙酰化酶1，组蛋白去乙酰化酶4，组蛋白去乙酰化酶6则大部分在骨祖细胞或在成熟的成骨细胞中表达^[26-28] 。同时其结合一些重要的转录因子来共同完成成骨细胞的表达，包括Runx2，Smads，Twist和pRb等^[29-30] 。有体外实验表明，个别抑制一些组蛋白去乙酰化酶能刺激成骨细胞的成熟，从而抑制成骨。通过RNA干扰抑制组蛋白去乙酰化酶能够促使碱性磷酸酶上升从而抑制成骨^[31] 。
总之，组蛋白去乙酰化酶在骨改建过程中参与调节成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收，从而调控骨代谢的动态平衡。
实验拟通过建立雌激素缺乏骨质疏松小鼠的实验动物模型，检测骨髓间充质干细胞组蛋白去乙酰化酶的基因表达，探索卵巢切除小鼠骨组织形成障碍可能的表观遗传学机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：动物实验观察。

时间及地点：实验于2013年1至4月在中国医学科学院放射医学研究所动物中心完成。

材料：SPF级雌性昆明种小鼠30只，鼠龄2个月，体质量25 g，购自北京华富康生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2009-0004。饲养于温度18-23 ℃，相对湿度50%-60%环境。

实验动物的处置符合医学伦理学要求。

方法：

实验动物分组：30只小鼠随机分为模型组和假手术组，各15只。小鼠适应性喂养7 d后，进行为期6周的实验。

卵巢切除动物模型的建立：模型组小鼠用5%水合氯醛按6 mL/kg腹腔注射麻醉，俯卧位，备皮，在无菌条件下行双侧卵巢切除。经背部肋缘下1 cm，脊柱两侧各1.5 cm交界处，分别切2个1 cm左右切口，进入腹腔，结扎并切除双侧卵巢；术后肌注4×10⁶ U青霉素预防感染。

假手术组小鼠仅切除卵巢周围等体积的脂肪组织，体积约为0.27 cm³。喂养小鼠的6周期间，每周测量其体质量1次。

骨组织的采集：造模后6周5%水合氯醛麻醉后断颈处死动物，每组15只右侧胫骨及右侧股骨并去除肌肉及软组织，立即置于40 g/L多聚甲醛-0.1 mol/L磷酸缓冲液中固定。

苏木精-伊红染色观察小鼠股骨形态变化：将固定好的小鼠股骨标本，以体积分数15%EDTA溶液脱钙4周(每4 d换一次脱钙液)，脱钙完成后对标本组织进行修剪。二甲苯孵育标本10 min×2；梯度乙醇浸泡，自来水冲洗5 min，苏木精染色3 min，自来水冲洗5 min，1%盐酸乙醇分色，自来水冲洗5 min，淡氨水返蓝，自来水冲洗5 min后，0.5%伊红1 min，水洗；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光学显微镜(日本Nikon公司)观察。

骨髓间充质干细胞的原代及传代培养：引颈法处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，尽量将肌肉组织清除干净，浸泡入加双抗的PBS中。配制无血清DMEM培养基，取髓将长骨两端剪开，用针管吸取培养基将骨髓冲出，反复直至发白，制成单细胞悬液。Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含体积分数15%胎牛血清的DMEM培养基重悬离心管中的骨髓间充质干细胞，镜下细胞计数，使细胞浓度达到1×10⁹ L^-¹，37 ℃体积分数CO₂培养箱培养，换液，将骨髓间充质干细胞不断纯化。当细胞70%-80%覆盖培养皿时，进行细胞传代。首先将细胞培养液去除，用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，置于培养箱内消化5 min，在显微镜下观察，看绝大部分细胞是否成单独分离状态。消化好后，向细胞悬浮液中加入1 mL的培养基，轻轻吹打混匀，终止消化。4 ℃，1 000 r/min离心5 min。吸弃上清，加入新鲜的培养基轻轻吹打混匀，按1∶3比例传代到新的培养板中，置于37 ℃细胞培养箱中培养。此时标记为第1代，以后每三四天换液1次；当细胞生长融合达80%-90%时，继续以1∶3的浓度传代扩增培养，传代培养并记为第2代，以此类推。

骨髓间充质干细胞的成骨诱导及鉴定：将生长状况良好的纯化的第3代骨髓间充质干细胞进行成骨诱导。将生长状况良好的纯化的第3代骨髓间充质干细胞以1×10⁸ L^-¹的浓度接种于6孔板，待细胞融合达80%后，更换培养基为含有10 mmoI/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C、0.25 μmol/L地塞米松和0.36 mol/L磷酸二氢钾的成骨诱导液。每2 d换液1次，成骨诱导7 d后行碱性磷酸酶染色，14 d后行茜素红染色。

碱性磷酸酶染色：成骨分化细胞去条件培养基，PBS洗2次，加入2 mL固定液(30 mL丙酮，50 mL柠檬酸盐，16 mL甲醛，4 ℃保存，使用前室温预热)固定30 s，弃固定液，纯水洗2次；加入2 mL碱性磷酸酶染色液，常温染色15 min，避光孵育；纯水洗2次，光镜下观察。

茜素红染色：去培养基，PBS洗2次；4 ℃条件下用体积分数70%乙醇固定1 h；双蒸水洗2次；40 mmol/L茜素红溶液(pH 4.2)室温染色1-10 min，大体观察着色情况；双蒸水洗5次，轻轻吹打；光学显微镜下观察。

反转录PCR检测小鼠胫骨和股骨中骨髓间充质干细胞中组蛋白去乙酰化酶的表达：按TRIZON试剂说明书细胞提取总RNA。收集100%融合状态的细胞于离心管内，加入1 mL的TRIZOL，室温放置5 min，然后加入0.2 mL氯仿，盖紧离心管，剧烈摇荡离心管30 s，室温孵育3 min，4 ℃10 000 r/min离心15 min。取上层水相于一新的离心管，加0.5 mL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min，4 ℃ 1 000 r/min离心10 min。弃去上清液，加入1 mL体积分数75%乙醇，涡旋混匀，4 ℃ 7 500 r/min离心5 min，弃上清，然后室温或真空干燥5 min，沉淀溶于10 μLRNA溶解液中。58 ℃孵育10 min。-80 ℃低温冰箱保存样品或行反转录PCR。根据反转录PCR引物设计原则，分别设计组蛋白去乙酰化酶和GAPDH的引物序列。

对多重PCR的各引物浓度、dNTPs及PCR反应的变性、退火至延伸条件以及循环次数等进行优化，确定最佳的反应模式为：反转录42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min。PCR反应体系为20 μL，包括：2×PCR Master Mix(含染料) 6 μL，正义链和反义链各1 μL，模板cDNA 1 μL，5×PCR增强子3 μL，去RNA酶水50 μL。经优化的PCR程序：预变性95 ℃ 5 min，进入95 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后于4 ℃结束反应。0.9%琼脂糖凝胶90 V电压电泳20 min。

主要观察指标：小鼠体质量，卵巢切除小鼠股骨组织病理变化，成骨诱导后的骨髓间充质干细胞中骨碱性磷酸酶和钙结节的表达，去卵巢小鼠骨髓间充质干细胞中组蛋白去乙酰化酶1，3，4 mRNA的表达。

统计学分析：数据以x(_)±s表示。采用SPSS 16.0统计软件(美国SPSS公司)，两组计量资料比较采用t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

作为美国食品与药物管理局和世界卫生组织推荐的模拟妇女绝经后骨质疏松最佳实验动物建模方法^[32] ，应用卵巢切除小鼠可形成稳定可靠的骨质疏松模型。适合用于模拟骨质疏松情况下组蛋白去乙酰化酶的表达情况。绝经后骨质疏松症是指由绝经引起的骨质疏松症。其致病机制还尚未定论，但绝经后由卵巢功能衰竭所导致的雌激素缺乏己是公认的绝经后骨质疏松症发生的重要原因^[33-37] 。
骨是雌激素的重要靶器官之一，在成骨细胞、破骨细胞中均有雌激素受体存在^[38-47] 。雌激素对骨骼的作用是通过作用于雌激素受体从而对成骨细胞和破骨细胞产生协同调节完成的^[48-50] 。有研究报道显示组蛋白去乙酰化酶可以使雌激素受体结合位点及其附近的组蛋白去乙酰化，从而让组蛋白和 DNA之间的结合程度更加紧密，不利于转录因子与DNA模板相结合，抑制下游基因的转录^[51] 。然而，卵巢切除而致的雌激素缺乏骨质疏松骨组织和骨髓间充质干细胞中组蛋白去乙酰化状态以及组蛋白去乙酰化酶的表达尚不清楚，需要深入研究探讨。
作者通过卵巢切除法成功建立了小鼠骨质疏松动物模型，发现其骨代谢与脂肪代谢均发生障碍。卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞中组蛋白去乙酰化酶3 mRNA的相对水平较假手术小鼠表达低，提示在小鼠卵巢切除模型中，组蛋白去乙酰化酶3的降低导致成骨细胞功能减低，抑制了骨的矿化。组蛋白去乙酰化酶3同属于I类组蛋白去乙酰化酶。
在体外实验中，组蛋白去乙酰化酶3与Runx2相互影响从而阻碍成骨相关因子，骨钙素和骨涎蛋白的表达^[31，52] 。而通过应用RNA抑制永生成骨细胞系中组蛋白去乙酰化酶3的表达，检测结果显示骨钙素，骨涎蛋白以及其他标志成骨细胞成熟的因子的表达有所上升^[53] 。Westendorf等[26]对小鼠组蛋白去乙酰化酶3条件基因敲除后，实验显示组蛋白去乙酰化酶3缺乏会导致皮质骨与小梁骨形成降低，而骨髓脂肪形成升高，同时由p53基因介导的2个相关因子p21Cip1和重组人血小板细胞C激酶底物同源物样域家族A成员1受到明显的正向调节，进而导致成骨细胞发育成熟缺陷。
此外许多与组蛋白去乙酰化酶3相关的信号通路在成骨细胞成熟过程中扮演重要角色。如基质γ-羧基谷氨酸蛋白和核苷酸内焦磷酸酶1等^[54-55] 。研究显示组蛋白去乙酰化酶3缺乏时会影响Wnt信号通路^[56] 。Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，其包括许多可调控Wnt信号分子合成的蛋白质，它们与靶细胞上的受体相互作用，而靶细胞的生理反应则来源于细胞和胞外Wnt配体的相互作用。其功能最常见于胚胎发育和癌症，但也参与成年动物的肢体形成及正常生理过程^[57-58] 。当组蛋白去乙酰化酶3缺乏时Wnt通路的抑制靶基因如体轴发育抑制因子、人分泌型卷曲相关蛋白4、受体酪氨酸激酶样孤儿受体等，进而抑制Wnt10b通路，导致间充质干细胞的成骨潜力受抑制，成脂趋势增加^{[56, 59]} 。对于脂肪形成的重要调控因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ2、组蛋白去乙酰化酶3的调控作用同样明显^[60-61] 。
实验发现卵巢切除小鼠组蛋白去乙酰化酶3的降低导致成骨细胞功能减弱，其作用机制考虑为正常状态下小鼠的骨祖细胞在Wnt通路作用下增殖分化最终形成成骨细胞，以完成骨代谢的正常进行。当组蛋白去乙酰化酶3下降时Wnt通路的相关因子人分泌型卷曲相关蛋白1与受体酪氨酸激酶样孤儿受体2受到抑制，进而影响骨祖细胞的正常分化，并促进过氧化物酶体增殖物激活受体γ2的表达上升，使成脂过程加强。而2组小鼠组蛋白去乙酰化酶1和组蛋白去乙酰化酶4表达水平均没有明显变化，可能是由于雌激素缺乏未能影响组蛋白去乙酰化酶1，组蛋白去乙酰化酶4的表达所致。
目前对于雌激素影响组蛋白去乙酰化酶表达水平的具体作用机制还不明确，在以后的研究中可以从分子水平进行深入探讨。
总之，深入研究骨质疏松发生的组蛋白修饰状态及其形成原因等表观遗传机制，可能是解释雌激素调节成骨和破骨等生理病理过程的重要线索，有望为骨质疏松的预防与治疗提供进一步的基础研究证据及治疗靶点。

组蛋白去乙酰化酶在卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞中的表达

Histone deacetylases mRNA profile in mesenchymal stem cells derived from ovariectomized mice

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