左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导中转化生长因子β1及Smad2/3的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (10): 1496-1501.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.004

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左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导中转化生长因子β1及Smad2/3的影响

孙月娇¹，宋囡¹，何文智²，何丽娟¹，任艳玲¹

¹辽宁中医药大学基础医学院，辽宁省沈阳市 110847；²辽宁中医药大学药学院，辽宁省大连市 116600

出版日期:2014-03-05 发布日期:2014-03-05
通讯作者: 任艳玲，医学博士，药学博士后，教授，博士生导师，辽宁中医药大学基础医学院，辽宁省沈阳市 110847
作者简介:孙月娇，女，1988年生，河北省保定市人，汉族，辽宁中医药大学在读硕士，主要从事方药配伍规律及应用的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81373527)；辽宁省自然科学基金项目(201102148)

Effect of Zuoguiwan and Youguiwan on transforming growth factor beta1 and its signal transduction protein Smad2/3 in osteogenic induction of rat bone marrow mesenchymal stem cells

Sun Yue-jiao¹, Song Nan¹, He Wen-zhi², He Li-juan¹, Ren Yan-ling¹

¹ College of Basic Medicine, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, Liaoning Province, China; ²College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, Liaoning Province, China

Online:2014-03-05 Published:2014-03-05
Contact: Ren Yan-ling, M.D., Professor, Doctoral supervisor, College of Basic Medicine, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, Liaoning Province, China
About author:Sun Yue-jiao, Studying for master’s degree, College of Basic Medicine, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81373527; the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 201102148

摘要/Abstract

摘要：

背景：滋补肾阴左归丸、温补肾阳右归丸均可协同诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，但其机制尚有待探讨。
目的：观察左、右归丸含药血清对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中转化生长因子β1及其信号转导蛋白Smad2/3表达的影响。
方法：运用全骨髓贴壁法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞；分别以空白血清对照组，左归丸、右归丸、阳性对照药补佳乐制备的大鼠含药血清加诱导剂(地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠)，以及诱导剂组为对照共5组对骨髓间充质干细胞进行干预。采用Western blot法检测Ⅰ型胶原蛋白表达，用免疫组化法检测转化生长因子和Smad2/3在细胞内的表达。
结果与结论：左归丸、右归丸含药血清诱导骨髓间充质干细胞成骨后Ⅰ型胶原蛋白、转化生长因子β1、Smad2/3蛋白表达高于空白组、诱导剂组，差异有显著性意义(P < 0.05)，且左归丸优于右归丸(P < 0.05)。提示左、右归丸含药血清能通过转化生长因子β1调节Smad2/3信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化，且左归丸组效果更好，表明中医“滋肾阴”法更能有效的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 左归丸, 右归丸, 肾藏精, 含药血清, 骨髓间充质干细胞, 成骨诱导, Ⅰ型胶原蛋白, 信号转导, 转化生长因子β1, 信号转导蛋白, Smad2/3, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate into osteoblasts under inducing condition that Zouguiwan and Youguiwan coordinate inducers, but the mechanism remains to be discussed.
OBJECTIVE: To observe the effects of serum containing Zuoguiwan and Youguiwan on transforming growth factor β1 and its signal transduction protein Smad2/3 message expression during the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: A whole bone marrow adherence method was adopted to isolate and cultivate bone marrow mesenchymal stem cells from rats. The cell cultivation was processed in five groups: bone marrow mesenchymal stem cells were respectively cultured with blank serum, serum containing Zouguiwan, serum containing Youguiwan, positive serum containing progynova+inducer (dexamethasone, vitamin C, and β-glycerophosphate), and inducer. Western blot was applied to detect the expression of type I collagen. The immunohistochemical assay was utilized to test transforming growth factor β1 and Smad2/3 expression in the osteoblasts.
RESULTS AND CONCLUSION: It was apparently more significant for serum containing Zuoguiwan and Youguiwan on type I collagen, transforming growth factor β1 and Smad2/3 expression, compared with blank serum group and inducer group (P < 0.05); moreover, serum containing Zuoguiwan was better than serum containing Youguiwan (P < 0.05). Both of serum containing Zuoguiwan and Youguiwan are able to promote osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Moreover, Zuoguiwan is much more effective indicating that this method of traditional Chinese medicine about nourishing kidneys can be better to promote osteogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, bone marrow, osteoblasts, adaptor proteins, signal transducing, transforming growth factors

中图分类号:

R394.2

孙月娇，宋囡，何文智，何丽娟，任艳玲. 左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导中转化生长因子β1及Smad2/3的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1496-1501.

Sun Yue-jiao, Song Nan, He Wen-zhi, He Li-juan, Ren Yan-ling. Effect of Zuoguiwan and Youguiwan on transforming growth factor beta1 and its signal transduction protein Smad2/3 in osteogenic induction of rat bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1496-1501.

图/表（结果） 3

2.1 纳入动物数量分析 共纳入动物21只，1只用于提取骨髓间充质干细胞，剩余20只随机分为4组用于制备含药血清，各组数量无脱失，均进入结果分析。

2.2 骨髓间充质干细胞的形态学特征 全骨髓贴壁法分离的骨髓间充质干细胞接种于培养瓶，24 h后可见少量细胞贴壁，以圆形居多，胞体透亮，3 d后P0代骨髓间充质干细胞已可见大部分细胞贴壁，仍保持圆形，此时进行首次换液；10-12 d细胞达 80% 融合，细胞可呈菱形或长梭形，并形成突触，放射状向周围不断扩大，但集落有大有小，有的集落细胞呈多层，方可进行首次传代(图1A)；P4代细胞多呈防锤形生长，排列为旋涡状或水草样(图1B)。

2.3 左、右归丸对骨髓间充质干细胞的Ⅰ型胶原蛋白表达的影响 Western blot结果显示Ⅰ型胶原蛋白的表达明显，与空白血清对照组比较，补佳乐组、左归丸组、右归丸组、诱导剂组均可促进骨髓间充质干细胞的Ⅰ型胶原蛋白的表达(P < 0.05）；与诱导剂组比较，左归丸组、右归丸组可促进骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达(P < 0.05)；且与右归丸组比较，左归丸组可显著促进骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达(P < 0.05)，见图1C。

2.4 左、右归丸对骨髓间充质干细胞成骨诱导中转化生长因子β1-Smad 2/3的表达 免疫组化染色显示，各组骨髓间充质干细胞胞浆中都可见转化生长因子β1的阳性反映，多呈棕黄色着色，但表达程度有差异。与空白血清对照组比较，补佳乐组、左归丸组、右归丸组、诱导剂组均可促进转化生长因子β1表达(P < 0.05)；与诱导剂组比较，左归丸组组、右归丸组可促进转化生长因子β1表达(P < 0.05)；且与右归丸组比较，左归丸组可显著促进骨髓间充质干细胞转化生长因子β1的表达(P < 0.05)，见图2。

另外，各实验组均有不同程度Smad2/3的阳性表达，胞浆内和细胞核边缘可见棕黄色的不均匀分布。与空白血清对照组比较，补佳乐组、左归丸组、右归丸组、诱导剂组均可促进Smad2/3表达(P < 0.05)；与诱导剂组比较，左归丸组、右归丸组可促进骨髓间充质干细胞Smad2/3的表达(P < 0.05)；且与右归丸组比较，左归丸组Smad2/3的阳性表达率增高(P < 0.05)，见图3。

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引言

材料方法

设计：细胞培养，细胞形态学观察及蛋白测定。

时间及地点：于2013年1至6月在辽宁中医药大学省部共建中医脏象理论及应用教育部重点实验室完成。

材料：

实验动物：SPF级SD大鼠21只，雌性10只，雄性11只，体质量(210±10) g，于辽宁长生生物技术有限公司购买，许可证号：SCXK(辽)：2010-0001。取其中20只大鼠(雌雄各半)随机分为4组(n=5)，用于制备含药血清；剩余1只2月龄雄性大鼠，用于提取和培养骨髓间充质干细胞。

中药制备：中药饮片购于辽宁中医药大学附属第一医院。左归丸，成分：熟地黄24 g、炒山药12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿胶炒珠12 g、制菟丝子12 g、川牛膝酒炙9 g、龟胶炒珠12 g；右归丸，成分：熟地黄24 g、炒山药12 g、枸杞子12 g、山茱萸9 g、鹿角炒珠12 g、制菟丝子12 g、当归9 g、肉桂6 g、杜仲12 g、附子6 g；自制成水煎剂，生药量为1 g/mL。

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养：取2月龄SPF级雄性SD大鼠1只脱颈处死，用体积分数75%乙醇浸泡10 min后，移入超净台，在无菌条件下取双侧股骨和胫骨，除净骨上附着软组织，剪下两侧骨骺端，暴露出骨髓腔。用5 mL改良型α-MEM培养液(含1×10⁵U/L青霉素、100 mg/L硫酸链霉素的α-MEM培养液)反复冲洗骨髓腔至培养皿中，至骨髓腔变白，反复吹打成单细胞悬液，移入15 mL无菌离心管，离心(1 000 r/min，3 min)，离心半径10 cm，倾去上清液，加入含体积分数10% FBS的α-MEM 培养液重悬细胞，接种于25 cm²培养瓶，置37 ℃、体积分数5% CO₂细胞培养箱中培养。接种后第3天首次换液，以后每3 d换液1次。细胞长至80%融合时，用胰酶进行消化、传代。传至P4代细胞，用于以下实验。

含药血清制备：20只大鼠随机数字表法均分为空白血清对照组、西药对照补佳乐组、左归丸组、右归丸组，每组5只。按每kg体质量大鼠的给药量为人的6.3倍计算，并且每次给大鼠灌胃量为正常人用药量的2倍，2次/d，空白血清对照组灌服蒸馏水，于第4天给药2 h后，腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，静置2 h后，离心(2 500 r/min，4 ℃，20 min)，收集血清，56 ℃水浴灭活30 min，分装后，-86 ℃保存。

实验分组：细胞培养实验共分为5组，空白血清对照组、补佳乐组、左归丸组、右归丸组、诱导剂组(表1)。

免疫印迹法检测Ⅰ型胶原蛋白表达：采用 Western blot法，将P4代骨髓间充质干细胞以5×10⁴/瓶接种于5个25 cm²培养瓶，3 d后饥饿24 h，每瓶分别加入6 mL各组培养液；干预9 d后，弃培养液，PBS洗3遍，甩干；每瓶细胞加入1 mL PBS将细胞刮至瓶底一角，收集至预冷的 1.5 mL EP管中；离心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)，弃上清；每个EP管加100 μL蛋白裂解液，反复吹打后冰上静置30 min；再次离心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)，取上清；BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白变性后，每孔上样 20 μL，电泳后转膜3 h，5%的脱脂奶粉37 ℃孵育1 h，TBST洗膜一次(5 min)后一抗孵育1 h，4 ℃过夜；次日TBST洗3次，二抗孵育1 h后TBST洗4次；暗室中加入ECL发光液后，曝光，扫描图像后用Gel-pro Analyzer图像分析软件分析结果。采用目的蛋白Ⅰ型胶原与内参GAPDH条带的吸光度比值来表示蛋白表达水平，各组间进行比较。

免疫组化法检测转化生长因子β1，Smad2/3表达：将剪裁合适大小的盖玻片置于12孔板；取出干预9 d后的P4代骨髓间充质干细胞，细胞经胰酶消化后计数，以2.5×10⁴接种于12孔板中，使分布均匀，密度适中；爬片生长2 d后取出；弃培养液，多聚甲醛每孔1 mL固定；PBS清洗后加入0.2% Triton破膜，每孔覆盖即可；PBS洗3遍(每次 3 min)，滴加山羊血清封闭液使每孔完全覆盖；室温20 min弃多余液体；一抗37 ℃水浴1 h后4 ℃过夜；次日清洗后用二抗37 ℃水浴1 h；PBS清洗3遍(每次5 min)后DAB显色 10 min，流水冲洗10 min，苏木精复染2 min(盐酸乙醇分化)，流水冲洗后，镜检。通过BI-2000医学图像分析系统比较各组平均吸光度值表示转化生长因子β1和Smad2/3蛋白在成骨细胞内的表达。

主要观察指标： ①观察骨髓间充质干细胞的形态学特征。②Western blot法检测左、右归丸对骨髓间充质干细胞的 Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。③免疫组化染色法检测左、右归丸对骨髓间充质干细胞成骨诱导中转化生长因子β1-Smad 2/3的表达。

统计学分析：计量数据采用SPSS 13.0软件处理，用LSD或One-Way Anova进行分析，结果用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导的研究已有较大发展^[16-18] ，但是有关中医药在其诱导过程中相关信号转导机制方面的研究相对较少。中医理论认为肾为先天之本，肾藏精，其精气促进人体的生殖、生长和发育，是人体生命活动的原动力。中医学很早就认识到肾与骨髓关系密切，《内经》曰：“肾藏精，主骨生髓”，“骨者，髓之府”，“髓者，骨之充也”，“肾生骨髓”。因此，可以从中医补肾角度探讨补肾经典方剂之左、右归丸在一定程度上促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程。
左、右归丸均由明代医家张景岳所创制，分别是滋补肾阴、温补肾阳的代表方剂，体现了中医独特的补肾阴阳观，并从理论的深度与实践的要求体现出补肾之法，真阴为本；育阴之用，涵阳为度；扶阳之妙，培阴生阳，阐明了补肾以真阴为本，是育阴以涵阳和培阴以生阳的基础与前提。提示中医肾理论特别是肾为先天之本理论与骨髓间充质干细胞增殖分化有着密切的内在联系，开展相关研究将有可能深化中医肾本质以及扩大干细胞应用成果。
前期实验表明，益肾填精中药能有效促进成骨细胞生成。并从多个角度探讨了成骨细胞增殖分化机制和信号转导途径，已取得了初步进展^[19-21] 。胶原蛋白是基底膜的主要成分，在骨骼中超过80%的有机质是Ⅰ型胶原蛋白。Ⅰ型胶原蛋白由成骨细胞以原胶原的形式分泌，在骨骼与结缔组织中通过形成和保持骨架的完整性来发挥作用，同时在形成特定的细胞外微环境中也起到主要作用，而这些微环境对于维持细胞的完整性及传递细胞外信号起到关键作用^[22-23] 。因此，Ⅰ型胶原蛋白是评价骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的特征性标志之一，Ⅰ型胶原蛋白的阳性表达，反映了骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞合成骨胶原的能力^[24-26] 。实验结果表明，除空白组外，各组均能促进骨髓间充质干细胞的Ⅰ型胶原蛋白蛋白的表达，具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用，且左、右归丸的协同诱导作用最佳。
转化生长因子β1是调节细胞生长和分化的转化生长因子β超家族成员之一，这一家族除转化生长因子β1外，还有活化素、抑制素、缪勒氏管抑制质和骨形成蛋白^[27] 。转化生长因子β1对细胞的生长发育、增殖分化、物质代谢和免疫功能都有重要的调节作用^[28] 。这种多功效性决定了在细胞内必然存在着复杂的转化生长因子β1信号传导通路^[29-31] 。转化生长因子β1通过细胞表面受体丝氨酸/苏氨酸激酶和胞浆内效应分子Smads蛋白等将信号转导到核内^[32-33] 。Smads通过直接与DNA结合作为转录因子，或与其它转录因子及活化因子相互作用诱导对转化生长因子β1信号的转录应答^[34-36] 。现已发现3种类型9个Smad蛋白，包括受体调节型R-Smad，共同介导型Co-Smad，抑制型I-Smad；其中，Smad2和Smad3属于受体调节型蛋白，它们的同源性高达92%，但在功能上二者尚有很大区别^[37-39] 。目前发现，能被转化生长因子β1激活的只有Smad2/3。激活的转化生长因子β1使Smad 2/3磷酸化，移位至核，完成转化生长因子β1信号由胞浆至胞核的转导，进而调节目的基因的表达^[40-41] 。Smad2/3作为转化生长因子β1信号下传的第一个信号分子，将转化生长因子β1信号从细胞表面转导到细胞核，从而调节靶Smad 2/3蛋白的表达水平^[42] 。
研究骨形成过程中转化生长因子β1和Smad2/3蛋白表达有助于加深对转化生长因子β1胞内信号转导机制的理解，也有助于阐明骨髓间充质干细胞增殖分化机制，为其进一步进行分子水平研究打下基础。实验中，除空白组表达不明显外，其余各组均对转化生长因子β1、Smad2/3在成骨诱导后的骨髓间充质干细胞内的表达有显著作用，左归丸和右归丸组优于诱导剂组和补佳乐组，并且左归丸协同诱导剂的作用为最佳。本实验结果表明左、右归丸协同诱导剂促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导，并通过转化生长因子β1通路调节Smad 2/3表达，干预转化生长因子β1与Smad 2/3信号通路可能是左、右归丸促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要机制之一，为深入阐明益肾填精中药的促成骨分化机制提供了实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导中转化生长因子β1及Smad2/3的影响

Effect of Zuoguiwan and Youguiwan on transforming growth factor beta1 and its signal transduction protein Smad2/3 in osteogenic induction of rat bone marrow mesenchymal stem cells

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