乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.021

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (10): 1841-1848.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.021

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

宋艳玲^1，2，唐乙^1，2，丁维进^1，2，王春燕²，苏志达²，江华¹，张盈帆¹

1解放军第二军医大学长征医院整形外科，上海市 200003
2解放军第二军医大学长征医院神经科学研究中心，上海市 200003

收稿日期:2012-08-05 修回日期:2012-11-10 出版日期:2013-03-05 发布日期:2013-03-05
通讯作者: 江华，博士，教授，主任医师，解放军第二军医大学长征医院整形外科，上海市 200003 dosjh@126.com
作者简介:宋艳玲★，女，1984年生，山东省烟台市人，汉族，2012年解放军第二军医大学毕业，硕士，医师，主要从事组织工程干细胞及神经再生的研究。 upsylup@126.com
基金资助:
国家自然科学基金(青年科学基金项目) 项目(81100950)；上海市科委基础研究重点课题(08JC1407100)。

In vitro induced differentiation of mouse muscle-derived stem cells into Schwann-like cells

Song Yan-ling^1,2, Tang Yi^1,2, Ding Wei-jin^1,2, Wang Chun-yan², Su Zhi-da², Jiang Hua¹, Zhang Ying-fan¹

1 Department of Plastic Surgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200003, China
2 Research Center for Neuroscience, Changzheng Hospital, Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200003, China

Received:2012-08-05 Revised:2012-11-10 Online:2013-03-05 Published:2013-03-05
Contact: Jiang Hua, Ph.D., Professor, Chief physician, Department of Plastic Surgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200003, China dosjh@126.com
About author:Song Yan-ling★, Master, Physician, Department of Plastic Surgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200003, China; Research Center for Neuroscience, Changzheng Hospital, Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200003, China upsylup@126.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：有证据显示，肌源性干细胞能够促进肌纤维的再生，增强再生肌组织的功能，并具有分化为神经外膜组织细胞和具有许旺细胞表型细胞的潜能。
目的：分析许旺细胞条件培液诱导小鼠乳鼠源肌源性干细胞向许旺细胞的分化，探讨其作为神经组织工程的种子细胞的可行性。
方法：取C57BL/6乳鼠四肢骨骼肌，采用改良的Preplate技术纯化培养肌源性干细胞，利用抗体Desmin和Sca-1对纯化后的细胞进行免疫细胞化学鉴定。采用许旺细胞条件培液诱导其向许旺细胞分化，并行许旺细胞特异性抗体S100β、P75NTR免疫细胞化学鉴定。
结果与结论：从小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞，能在体外稳定增殖传代，Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色阳性。肌源性干细胞经体外诱导分化后部分细胞S100β、P75NTR染色阳性。说明应用改良的Preplate方法，可从新生小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞；采用许旺细胞条件培液能将其诱导分化为许旺样细胞，有可能成为神经组织工程神经较理想的许旺细胞替代物。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 肌源性干细胞, 许旺细胞, 许旺样细胞, 培养基, 诱导分化, 骨骼肌, 三重酶消化, 神经轴突, 神经组织工程, 种子细胞, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: There is evidence that muscle-derived stem cells can promote the regeneration of muscle fiber, strength the function of regenerative muscle tissue, exhibit the ability to differentiate into epineurial cells and possess the phenotype of Schwann cells.
OBJECTIVE: To analyze the induced differentiation of neonate mouse muscle-derived stem cells into Schwann-like cells by Schwann cell conditioned culture medium and investigate the feasibility of use of neonate mouse muscle-derived stem cells as the seed cells for nerve tissue engineering.
METHODS: Muscle-derived stem cells were harvested from C57BL/6 neonate mouse appendicular skeletal muscle and purified and cultured by modified Preplate technique. These cells were identified by immunocytochemistry with Desmin and Sca-1 antibodies and then induced to differentiate into Schwann-like cells using Schwann cell conditioned culture medium. Schwann cell specific antibodies S100β and P75NTR were used for immunocytochemical identification.
RESULTS AND CONCLUSION: Muscle-derived stem cells isolated from mouse skeletal muscle could be stably proliferated and passaged, and were positive for Desmin and Sca-1 staining. After induced differentiation, some muscle-derived stem cells were positive for S100β and P75NTR staining. These findings suggest that muscle-derived stem cells can be harvested from neonate mouse skeletal muscle through the use of modified Preplate method. In the Schwann cell conditioned culture medium, neonate mouse skeletal muscle-derived stem cells can differentiate into Schwann cell-like cells and therefore can become an ideal Schwann cell substitute in nerve tissue engineering.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, muscle-derived stem cells, Schwann cells, Schwann-like cells, culture medium, induced differentiation, skeletal muscle, triple enzyme digestion, neurite, nerve tissue engineering, seed cells, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

宋艳玲，唐乙，丁维进，王春燕，苏志达，江华，张盈帆. 乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(10): 1841-1848.

Song Yan-ling, Tang Yi1,, Ding Wei-jin, Wang Chun-yan, Su Zhi-da, Jiang Hua, Zhang Ying-fan. In vitro induced differentiation of mouse muscle-derived stem cells into Schwann-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(10): 1841-1848.

图/表（结果） 11

2.1 肌源性干细胞的形态学特点 见图1。

采用改良的Preplate技术分离肌源性干细胞过程中，在倒置相差显微镜下可见肌源性干细胞分离过程中PP1-PP5不同细胞形态。贴壁较快的PP1、PP2大部分为多角形的成纤维样细胞和形态不规则的杂细胞，偶见少量肌细胞，贴壁迅速，数量多，分裂增殖旺盛，1周左右即可完全融合。PP3、PP4可见成纤维数量明显减少，以长梭形、短梭形的肌细胞为主，偶见折光性较强的圆形细胞，增殖较快，肌细胞可相互融合成肌管。PP5中见大量短梭形的肌卫星细胞和部分圆形折光性强的肌源性干细胞，

若将PP5置于较难贴壁的玻片上时，可见干细胞呈球样生长，同时呈现出过渡放大细胞，见图2。

PP6贴壁细胞体积较小，贴壁缓慢，多为圆形，折光性强，增殖缓慢，另有少量干细胞球处于悬浮状态。培养72 h后，细胞数量明显增多，以圆形细胞为主，亦可见过渡放大细胞。培养5-7 d后，悬浮细胞基本消失，贴壁细胞分裂增殖明显，可见较多分裂相，细胞密度明显增加，胞体逐渐舒展，细胞体积增大，细胞形态出现较大变化，可见短梭形、圆形细胞贴壁生长，见图3。

过渡放大的细胞随着胞内细胞分裂增殖，体积逐渐增大，当超过包膜张力后即崩解释放出大量的肌源性干细胞，仅残留破碎的包膜和胞内碎片，见图4。

2.2 肌源性干细胞传代后细胞形态 传代培养的肌源性干细胞初为零星散落的圆形细胞，培养1周后肌源性干细胞可增殖形成单克隆集落，见图5。肌源性干细胞的单克隆集落细胞基本为大小均一，折光性强的圆形细胞。

2.3 肌源性干细胞的生长曲线 传代培养的肌源性干细胞生长曲线呈S型，细胞的增殖先后经过调整期、对数生长期、稳定期3个时期。第2天开始细胞进入对数生长期，第7天时细胞数量达到顶峰，8 d后细胞生长明显减缓并开始进入平台期，见图6。

2.4 肌源性干细胞的免疫细胞化学染色 取爬片培养的PP6行Desmin和Sca-1双标，见图7，双标的免疫细胞化学染色鉴定结果，可见过渡放大细胞呈多核，体积明显增大，核浆比增大。

2.5 分离的许旺细胞形态学观察 细胞悬液重新贴壁培养24 h后，通过倒置显微镜观察到大部分呈短梭形、少部分为三角形的许旺细胞，两端突起明显。继续培养72 h后，许旺细胞突其变长，细胞间通过突触融合生长，见图8，1周后的许旺细胞可达到80%左右的融合度。

2.6 许旺细胞的免疫细胞化学染色鉴定 对培养4 d的许旺细胞采用许旺细胞特异性标记物S-100β和P75NTR行免疫细胞化学鉴定结果，见图9。

2.7 诱导后许旺样细胞的形态学特点 小鼠肌源性干细胞经许旺细胞条件培液诱导7 d后，倒置显微镜下观察未诱导的肌源性干细胞和诱导后的肌源性干细胞，经许旺条件培液诱导后的细胞生长状态良好，大部分失去了圆形的细胞形态，出现长突起，类似许旺细胞，细胞突起之间似发生联系，胞体折光性较差，变化呈渐进性，分化率较高，此时细胞未见明显增殖现象，见图10。

2.8 诱导后许旺样细胞的免疫细胞化学染色 肌源性干细胞经许旺细胞条件培液诱导1周后，采用许旺细胞特异性标记物S-100β、P75NTR行免疫细胞化学鉴定，结果可见部分肌源性干细胞被诱导成许旺样细胞，见图11。

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引言

材料方法

设计：细胞形态观察。
时间及地点：于2011年4月至2012年2月在解放军第二军医大学神经科学研究中心完成。
材料：
实验动物：健康新生C57BL/6小鼠6只，3-5 d龄，体质量5-10 g，雌雄不拘；8只1 d龄C57BL/6小鼠，体质量2 g，雌雄不拘，均由解放军第二军医大学动物实验中心提供，生产许可证号为SCXK(沪2007-0003)，动物使用许可证号为SYXK(沪2007-0002)。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。
小鼠乳鼠肌源性干细胞体外诱导分化为许旺样细胞实验的试剂与仪器：
Main experimental reagents and instruments:

方法：
肌源性干细胞的分离培养：C57BL/6小鼠无菌条件下取出四肢骨骼肌，显微镜下剔除骨、脂肪、血管、神经等，剪成乳糜状，依次采用0.2%的Ⅱ型胶原酶、2.4 U/mL的中性酶、0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化1 h，45 min，30 min，通过100目，200目，400目细胞筛过滤，离心后含有体积分数10%胎牛血清(FBS)、体积分数10%马血清(HS)、0.5%鸡胚提取物(CEE)的DMEM重悬细胞，接种于包被CB-I包被的T75培养瓶中，于37 ℃(含体积分数5% CO₂)孵育箱中培养，记为PP1；2 h后换液，吸出贴壁不牢的细胞及未贴壁细胞重悬后移至新的T75培养瓶中，记为PP2；此后每24 h差速贴壁纯化细胞，分别记为PP3、PP4、PP5、PP6。PP6即为肌源性干细胞，两三天更换干细胞培液1次。倒置相差显微镜下观察不同时期贴壁细胞的形态。
PP6贴壁培养5-7 d后，贴壁细胞分裂增殖明显，待细胞融合达90%后，0.25%胰蛋白酶消化传代，根据细胞计数结果，调整密度后移至用CB-I包被的24孔板中，每孔加干细胞培液500 μL(1×10³细胞)，于37 ℃(含体积分数5% CO₂)孵箱中培养，每两三天更换干细胞培液，培养1周后，可见培养板中形成单个克隆集落即为肌源性干细胞单克隆集落。
取传代后生长状态良好的细胞，种于CB-I包被的24孔板中，分为8组，每组3孔，每孔加干细胞培液500 μL(1×10⁴细胞)，于37 ℃(含体积分数5% CO₂)孵箱中培养；每隔24 h取3孔计算细胞数，以细胞数为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线。
肌源性干细胞的鉴定：取通过改良的Preplate技术分离得到PP6的细胞爬片行Desmin抗体和Sca-1抗体的免疫细胞化学染色。4%PFA室温固定细胞20 min；0.5%Triton X-100处理20 min；体积分数5%羊血清室温封闭20 min；加一抗(Desmin抗体和Sca-1抗体)，于湿盒中4 ℃过夜；加相应的二抗，室温避光孵育1 h；Hoechst 33258室温避光孵育5 min，50%甘油封固，荧光显微镜下观察拍照。
许旺细胞的分离培养：8只1 d龄C57BL/6小鼠浸溺于体积分数75%乙醇溶液，俯卧于解剖台，固定四肢，剪开后肢皮肤，钝性分离肌间隙，取出坐骨神经，用显微器械分离坐骨神经的神经外膜，剪碎组织，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化30 min，通过400目细胞筛过滤，离心后含有体积分数10%胎牛血清(FBS)的DF12重悬细胞，接种于用L-型多聚赖氨酸包被的6孔培养板中，于37 ℃(含体积分数5%CO₂)孵育箱中培养；2 h后，吸取未贴壁的上清悬液移至新的L-型多聚赖氨酸包被的6孔培养板中。待细胞完全贴壁后，加阿糖胞苷 (10^-5 mol/L)抑制成纤维细胞的增殖；2 d后，加入Forskolin至工作浓度14 μmol/L，于37 ℃(含体积分数5%CO₂)孵箱中培养，2 d更换培液1次，倒置相差显微镜下观察许旺细胞的形态。
许旺细胞的鉴定：为证实分离得到细胞为许旺细胞，对培养的许旺细胞爬片行其特异性标记物S-100β和P75NTR免疫细胞化学鉴定。
许旺细胞条件培液的制备：待许旺细胞融合度达60%左右，收集 6孔板中的培液置于无菌的离心管中，并向6孔板中加入2 mL新鲜的许旺细胞培液。如此至细胞融合度达90%左右停止收集。将收集的培液通过0.22 μm孔径的滤器过滤，所得到的培液称之为许旺细胞条件培液。
定向诱导肌源性干细胞向许旺样细胞分化：诱导前1 d用含EDTA的0.25%的胰蛋白酶溶液消化原代培养的肌源性干细胞(融合度需达80%左右)，调整细胞浓度后种于CB-I包被12孔板中。共分为3组，每组4孔，分别标记为A、B、C组，每孔加干细胞条件培液1 mL(1×10⁵细胞)；诱导前，用吸管吸出各孔中的培液，灭菌的PBS洗2遍；向A组各孔中加入1 mL干细胞培液，向B、C组各孔中加入1 mL许旺细胞条件培液，置于37 ℃，含体积分数5%CO₂，细胞孵箱中培养1周，2 d更换培液1次。倒置相差显微镜下观察诱导后细胞的形态变化。
诱导细胞的鉴定：为验证肌源性干细胞诱导后分化为许旺样细胞，取诱导7 d后的A组细胞爬片2张和B、C组细胞爬片各2张，分别采用许旺细胞特异性标记物S-100β、P75NTR行免疫细胞化学鉴定。
主要观察指标：①肌源性干细胞原代培养时，各个时期贴壁细胞的形态特点。②肌源性干细胞传代培养时，细胞单克隆集落的形态特点。③肌源性干细胞表面特异性标记物Desmin和Sca-1的表达情况。④肌源性干细胞经许旺细胞条件培液诱导后，细胞形态的变化情况。⑤肌源性干细胞经许旺细胞条件培液诱导后，许旺细胞特异性标记物S-100β和P75NTR的阳性表达情况。

讨论

肌源性干细胞具有良好的自我更新和增殖能力，并具多向分化的潜能，不仅能分化成骨骼肌纤维，促进肌组织的再生，还能分化成成骨细胞，促进骨骼的愈合^[3]，被认为是肌卫星细胞的前体。实验采用机械消化与三重酶消化相结合的方法来分离培养肌源性干细胞，实验中发现，向肌组织块中加入胶原酶后很快就变成了乳糜状，中性蛋白酶可以抑制细胞聚集，胰酶对组织具有很好的离散作用，通过反复的吹打重悬可将细胞从基膜中分离出来，这样保证肌组织消化彻底而原代细胞不受单一胰酶长时间消化引起的细胞损害。为达到肌源性干细胞纯化培养的要求，实验依次采用100目、200目和400目的不同孔径的细胞筛网过滤以去除肌纤维碎片，而混杂细胞悬液中的非肌性成分主要采用改良的Preplate技术，通过差速贴壁的方法去除成纤维样细胞、肌细胞、肌卫星细胞等，获得相对较纯的肌源性干细胞，再通过传代培养单克隆的方式获得纯化的肌源性干细胞克隆集落。实验中发现，实验动物的选择对肌源性干细胞的获取影响很大，随着乳鼠出生天数的延长，所获得的肌源性干细胞的数量和活力逐渐下降，因此选择新生小鼠作为取材对象。实验中还发现出生一两天的乳鼠分离得到的肌源性干细胞活力太差，又不利于取材，故新生3- 5 d的小鼠最适宜进行原代取材。

肌源性干细胞在组织形态学上，主要表现为体积小，折光性强的圆形细胞，可见过渡放大细胞；传代培养后，肌源性干细胞细胞大小较均一，呈纺锤形或圆形，贴壁一周左右可形成克隆集落，细胞不发生分化，且形态保持一致，体现了良好的增殖能力。细胞动力学研究表明，干细胞的增殖速度较慢，而过渡放大细胞是快速分裂细胞。过渡放大细胞是介于干细胞和分化细胞之间的过渡细胞，经若干次分裂产生分化细胞，通过这种方式，机体可用较少干细胞获得较多干细胞。

肌源性干细胞本身具有特征性外形，培养过程可以中采用倒置显微镜观察贴壁细胞的形态特征来辨别，但较理想的鉴定方法是结合细胞的生物学特征从分子水平来鉴定，肌源性干细胞能或多或少表达肌系相关标记如Desmin、Myogenin等^[4]，且能被大量的干细胞标记物标记如Sca-1、CD-34、Bcl-2、GFAP等^[5-7]。依据实验的研究目的和实验室的条件综合考虑作者选择结蛋白(Desmin)抗体染色鉴定其肌源性，并通过干细胞抗原1(Sca-1)抗体来鉴定其干细胞特性。Desmin是一种中间丝蛋白，是成肌分化的早期标志，常作为肌源性的标志，虽然成纤维细胞与骨骼肌内血管平滑肌细胞也能产生结蛋白，但此种细胞中结蛋白含量低，于抗体仅产生弱阳性反应，且仅有15%的Desmin阳性率^[8]，而通过本方法获取的肌源性干细胞中Desmin阳性率高达90%以上。Sca-1是18kDa磷脂酰肌醇锚定蛋白，属Ly-6抗原家族成员，是目前较为公认的肌源性干细胞标志，体外长期倍增实验中Sca-1水平保持稳定^[9]，一般作为肌组织来源干细胞特有的标记物之一^[10]。综合以上因素可以对肌源性干细胞进行鉴定。

研究发现，Pax7对于维持肌卫星细胞的分化起重要作用。斑马鱼研究中发现，Pax7特异性的表达于肌肉前体细胞，当肌组织受损时，细胞膜修复因子表达上调，Pax7+细胞迁移至损伤部位，并进入细胞周期^[11]。肌源性干细胞在体内/外分化成肌肉细胞时不需要特定的刺激，但让肌源性干细胞分化成骨骼肌细胞以外的其它谱系细胞时，可能需要特殊的生长因子刺激或将其置于适宜的环境中。大量的实验表明中胚层起源的肌源性干细胞成体干细胞在特定的环境中还能跨胚层分化为神经细胞的星形胶质细胞^[12]。

传统观点认为中枢神经系统损伤后，由于内在的再生能力差和外在的微环境的抑制，损伤轴突很难再生，然而近年的研究报道发现，大多数成体干细胞如骨髓基质干细胞、脂肪间充质干细胞或祖细胞等，在生长的轴突刺激下有向神经分化的潜能^[13-14]。骨髓基质干细胞在体外诱导得到许旺样细胞与外周神经来源的许旺细胞在形态和功能上还存在一定差别，但诱导后的细胞植入体内后能促进轴突的生长和功能的修复，甚至形成髓鞘包绕神经轴突。有证据表明肌源性干细胞可能是一群未向任何方向定型的原始干细胞，且其来源广泛，取材方便，容易分离培养和体外扩增且易于外源基因的导入和表达，自体移植又克服了伦理学争议和排斥反应等问题，可为基因治疗神经系统的疾病提供良好的载体，具有诱导分化为神经细胞的潜能并且能向神经干细胞一样在神经组织里迁移和整合^[15]，可以作为神经组织工程临床用于周围神经系统损伤修复的理想种子细胞。

成熟的许旺细胞能大量分泌各种神经生长因子、神经营养因子及粘附因子等物质，因此实验中采用以收集成熟许旺细胞的条件培液作为诱导剂。向肌源性干细胞中加入许旺细胞条件培液进行诱导并检测P75NTR、S-100β表达情况。P75NTR为神经生长因子的低亲和力受体，位于细胞膜和胞质，广泛分布于神经系统及肿瘤细胞中^[16]。S-100β是一种可溶性的酸性蛋白，能够高浓度特异性地存在于神经系统胶质细胞，主要包括中枢神经系统的星形胶质细胞和周围神经系统的许旺细胞^[17]。初步证实可以通过将肌源性干细胞与许旺细胞条件培液共培养的方案，可以将其诱导分化为具备许旺细胞表型的细胞。

实验结果发现，诱导得到的许旺样细胞在形态上和许旺细胞还存在一定的差异，倒置显微镜下观察，采用许旺细胞条件培液诱导后的细胞生长状态良好，大部分失去了圆形的细胞形态，出现长突起，类似许旺细胞，细胞突起之间似发生联系，胞体折光性较差，变化呈渐进性，分化率较高，此时细胞未见明显增殖现象。对诱导后细胞表面标志蛋白进行免疫荧光染色检测，发现部分肌源性干细胞存在P75 NTR、S-100β的阳性表达，这表明许旺细胞条件培液可以将肌源性干细胞诱导分化为许旺样细胞，具有一定的可行性，为组织工程神经和相关再生医学的研究提供了可能的许旺细胞替代物。

致谢：解放军第二军医大学神经生物教研室所有老师，整形科教授与医护人员，家人、各位师兄弟致以最衷心的感谢！
基金资助：国家自然科学基金(青年科学基金项目) 项目(81100950)；上海市科委基础研究重点课题(08JC1407100)。
作者贡献：实验设计为第一作者，实验实施为第一、二、四作者，实验评估为第五作者，资料收集为第三作者，第一作者成文，通讯作者审校第一作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置应符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

In vitro induced differentiation of mouse muscle-derived stem cells into Schwann-like cells

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