2.2  阴道脱落细胞染色结果  每日晨10点对每只鼠进行阴道涂片，观察每只鼠情期变化，未观察到明显规律的动情周期变化。见图1。

2.3  小鼠血清促卵泡生长素和雌激素水平的变化  2组小鼠免疫注射前及注射后2周，促卵泡生长激素及雌激素水平均差异无显著性意义；注射后4周实验组小鼠血清雌激素水平明显下降，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但促卵泡生长激素水平无明显变化；注射后6周实验组血清雌激素水平明显低于对照组(P < 0.05)，促卵泡生长激素水平明显高于对照组(P < 0.01)，见表1，2及图2，3。

2.3  小鼠血清促卵泡生长素和雌激素水平的变化  2组小鼠免疫注射前及注射后2周，促卵泡生长激素及雌激素水平均差异无显著性意义；注射后4周实验组小鼠血清雌激素水平明显下降，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但促卵泡生长激素水平无明显变化；注射后6周实验组血清雌激素水平明显低于对照组(P < 0.05)，促卵泡生长激素水平明显高于对照组(P < 0.01)，见表1，2及图2，3。

2.3  小鼠血清促卵泡生长素和雌激素水平的变化  2组小鼠免疫注射前及注射后2周，促卵泡生长激素及雌激素水平均差异无显著性意义；注射后4周实验组小鼠血清雌激素水平明显下降，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但促卵泡生长激素水平无明显变化；注射后6周实验组血清雌激素水平明显低于对照组(P < 0.05)，促卵泡生长激素水平明显高于对照组(P < 0.01)，见表1，2及图2，3。

2.3  小鼠血清促卵泡生长素和雌激素水平的变化  2组小鼠免疫注射前及注射后2周，促卵泡生长激素及雌激素水平均差异无显著性意义；注射后4周实验组小鼠血清雌激素水平明显下降，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但促卵泡生长激素水平无明显变化；注射后6周实验组血清雌激素水平明显低于对照组(P < 0.05)，促卵泡生长激素水平明显高于对照组(P < 0.01)，见表1，2及图2，3。

2.4.1  实验组小鼠卵巢体积减小，子宫壁薄  见图4。

2.4.2  卵巢组织形态学变化  小鼠卵巢组织的形态学表现实验组闭锁卵泡数量(1.60±0.76)增多，间质纤维化严重，原始卵泡(0.50±0.54)、初级卵泡(1.50±0.93)、次级卵泡(1.50±0.76)均显著低于空白对照组(P < 0.001)，见表3。在小鼠免疫注射后6周，对小鼠卵巢组织行苏木精-伊红染色，见空白对照组小鼠卵巢组织，分布着各个阶段的生长卵泡；颗粒细胞层排列紧密，图5A；实验组小鼠卵巢体积变小，卵巢皮质增厚，成熟期卵泡数量减少。黄体纤维化、数目增多，血管减少，见图5B。统计结果显示：实验组小鼠各级生长卵泡数量明显减少，但闭锁卵泡数量增加(见表2)，卵巢由多个大的黄体样物质组成，符合免疫早衰鼠特征。

2.4.2  卵巢组织形态学变化  小鼠卵巢组织的形态学表现实验组闭锁卵泡数量(1.60±0.76)增多，间质纤维化严重，原始卵泡(0.50±0.54)、初级卵泡(1.50±0.93)、次级卵泡(1.50±0.76)均显著低于空白对照组(P < 0.001)，见表3。在小鼠免疫注射后6周，对小鼠卵巢组织行苏木精-伊红染色，见空白对照组小鼠卵巢组织，分布着各个阶段的生长卵泡；颗粒细胞层排列紧密，图5A；实验组小鼠卵巢体积变小，卵巢皮质增厚，成熟期卵泡数量减少。黄体纤维化、数目增多，血管减少，见图5B。统计结果显示：实验组小鼠各级生长卵泡数量明显减少，但闭锁卵泡数量增加(见表2)，卵巢由多个大的黄体样物质组成，符合免疫早衰鼠特征。

卵巢早衰是女性青春期之后，40岁之前出现3-6个月以上的闭经，血清雌激素水平降低，卵泡刺激素水平升   高^[1]。近10年来卵巢早衰在育龄女性中的发病率呈逐年上升，且向低龄化发展的趋势，已成为影响女性生育的常见病因之一。卵巢早衰的病因复杂，很多患者(50%-60%)找不到明确的原因^[2]。卵巢早衰迄今为止发病机制尚不明确，是一种多因素所致的疾病，与遗传、免疫、环境、不良生活方式及酶缺乏等有关^[3-4]。临床研究显示10%-30%的卵巢早衰是由免疫因素所致^[5]，近年研究表明患有自身免疫性疾病的育龄女性发生卵巢早衰的风险呈上升趋势^[6]。其早期诊断困难，治疗也相当棘手。

此次实验拟探讨免疫性卵巢早衰的致病机制，故建立透明带3多肽(peptide of zona pellucida 3，pZP3)引起的小鼠自身免疫性卵巢早衰模型，观察卵巢早衰小鼠卵巢结构及血清激素水平变化，拟寻找一简便可靠的建模方法，为临床研究免疫性卵巢早衰提供理论依据，进一步为深入研究其发病机制、诊断和治疗提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年9月至2019年5月在新疆医科大学临床医学研究院完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠30只，体质量18-22 g，来自新疆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(新)2018-0002。动物随机分为实验组(20只)和空白对照组(10只)，在新疆医科大学实验动物中心饲养，室内温度、湿度、光照均由动物中心统一控制，普通饲料饲养，自由进食水。实验动物的使用经新疆医科大学实验动物中心伦理委员会批准(批准号为IACUC20160616-13)。

1.3.2  实验用主要试剂  pZP3第330-342个氨基酸系列 (NSSSSQFQIHGPR)，其分析纯度>95%(上海奥科有限公司合成，批号：AD5412)；完全弗氏佐剂(CFA)4 g/L的灭活结核杆菌浓度(美国sigma，规格：F-5881)；不完全弗氏佐剂(IFA)(美国sigma，规格：F-5506)；小鼠促卵泡生长激素/雌激素elisa(武汉华美BX002)；瑞氏/瑞氏-姬姆萨染色液(兰州贝索BA4017)；Bouins固定液(Solarbio，货号G2331)

1.4  实验方法

1.4.1  动物建模  参照文献[7]的方法：10 mg pZP3粉末溶解于10 mL三蒸水，与完全弗氏佐剂按1∶1比例配成免疫试剂，与不完全弗氏佐剂按1∶1比例配成免疫强化试剂。实验组小鼠首次免疫注射时间为0周，给予0.15 mL(pZP3为75 μg)免疫试剂注射双足底及下腹部皮下，每日晨阴道脱落细胞涂片观察小鼠动情周期的变化；2周后(即第15天)予0.15 mL(pZP3为75 μg)免疫强化试剂皮下注射同样部位，第4周和第6周的第1天，分别注射免疫试剂或免疫强化试剂各1次(交替注射)。于0，2，4，6周每次注射前于眼眶静脉丛采血，离心后血清-80 ℃储存；首次免疫后6周留取卵巢及子宫组织，石蜡包埋。对照组注射三蒸水1∶1混合液。

1.4.2  阴道脱落细胞染色  每日晨10：00观察小鼠阴道脱落细胞的变化，确定每只小鼠动情周期的变化。用棉签轻取阴道分泌物涂片，瑞士或瑞士吉姆萨染色，在光学显微镜下观察阴道脱落细胞，确定每只小鼠的情期及动情前期、间期、后期。

1.4.3  性激素检测  首次注射(0周)及注射后2，4，6周，每次注射前各组小鼠眼眶采血法获取血清，小鼠激素ELISA试剂盒检测促卵泡生长激素和雌二醇水平。

1.4.4  卵巢组织的准备  6周后麻醉下颈椎脱臼法处死各小鼠，分别取双侧卵巢组织，将卵巢固定于bouin固定剂中，加工制备石蜡包块，进行2 μm连续切片，苏木精-伊红染色^[8]。显微镜下观察卵巢组织及卵泡形态，所有类型的卵泡都在两卵巢最大2切面中被计数，计数各级卵泡数量，各级卵泡标准同彭静等^[6，8-9]，原始卵泡由单层鳞状的颗粒细胞包裹；初级卵泡有增大的卵子，由单层立方形的颗粒细胞包裹；次级卵泡由两三层立方形的颗粒细胞层包裹，无窦状空间；窦状卵泡由积云状的颗粒细胞包裹，卵泡液丰富。

1.5  主要观察指标  ①阴道脱落细胞染色观察小鼠动情周期变化；②小鼠血清促卵泡生长素和雌激素水平；③小鼠卵巢、子宫组织的形态学变化。

1.6  统计学分析  采用SPSS 24.0统计软件分析实验结果，计量资料以x(_)±s表示，组间两两比较采用t 检验。P < 0.05差异有显著性意义。样本为正态分布，并进行方差齐性检验。

       卵巢早衰是威胁女性健康的最大问题之一，其发病机制尚不明确，如何治疗更是当今的难题，因此对其发病机制和治疗策略的研究已成为热点^[10-11]。因此卵巢早衰动物模型的建立为临床研究奠定了基础，但是在众多早衰动物模型中^[12-15]，目前最多的是通过注射化疗药物构建，即小鼠腹腔注射50 mg/(kg.d)环磷酰胺，连续15 d，建立卵巢早衰模型。然而目前多项研究表明，有5%-30%的卵巢早衰患者自身免疫功能出现异常^[2，16-17]，自身免疫与卵巢早衰的发病机制密切相关^[12]，因此，免疫性卵巢早衰模型动物的建立对研究该病的研究具有重要意义。

1992年RHIM等^[18]报道小鼠与人类pZP3蛋白具有67%同源性，pZP3诱导小鼠产生AZP3Ab，与卵巢pZP3结合引起免疫反应，干扰卵母细胞与颗粒细胞之间的信息交换，可引起类似于人类卵巢早衰的表现如卵巢萎缩、无排卵等。1994年，SMITH和HOSID^[19]首次报道了抗透明带抗体与卵巢早衰的发生相关。已经证实抗透明带抗体因可以加速卵母细胞的破坏和耗竭而致卵巢早衰^[20-21]。ZP抗原免疫导致闭锁卵泡增多，卵巢局部免疫环境紊乱，在不同阶段促进卵泡耗竭，导致卵巢早衰。因此，此次研究拟应用pZP3构建免疫性卵巢早衰动物模型。

      不同种系小鼠在免疫反应性、繁殖能力存在差异。国内外多项研究报道由A/J雄鼠和C57BL/6雌鼠进行杂交繁殖出的B6AF1雌鼠建立自身免疫性疾病的动物模型，其成模率达90%以上^[20-22]。后又有多位学者应用小鼠pZP3诱导BALB/c小鼠也成功建立免疫性卵巢早衰模型^[21-23]。BALB/c相比较B6AF1是一广泛使用的实验小鼠，在免疫学研究中广泛应用。因此，此次研究选用BALB/c小鼠进行实验。

虽然多个研宄都采用的pZP3多肽建模，但建模成功时间报道不一差距较大。蔡慧华等^[7]研究结论BALB/c小鼠免疫8周后80%小鼠建模成功。伍娟娟等^[24]同样以BABL/c小鼠 30 d后造模成功。王佩娟等^[25]用B6AF1小鼠诱导免疫卵巢早衰14 d建模成功。此次研究采用pZP3多肽双足底及腹部皮下注射,每次间隔2周接种1次，每次注射75 μg，选择在首次免疫及免疫后2，4，6周进行注射。自第1次免疫后次日开始每日观察阴道脱落细胞涂片，多数研宄通过阴道脱落细胞涂片判定动情周期^[27]，鉴定建模效果，如蔡慧华等^[7]每日早8时予阴道脱落细胞涂片，当出现连续2个动情周期紊乱时,视为建模成功。付莉等^[27]每日8和20时行阴道脱落细胞涂片检查，观察小鼠性周期。研究发现在动情期的判定上都存在不确定性，在实验结果的判断上都存在太多人为的因素^[26]，各情期不一定在同一时间被观察到，因此方法工作量大繁琐，不建议以此判断是否建模成功。

血清促卵泡生长激素含量升高，雌激素水平下降是卵巢早衰患者最主要的特征和诊断依据。因此此次研究通过每2周1次检测免疫注射后促卵泡生长激素和雌激素水平的变化。2组小鼠随机分配，注射前其促卵泡生长激素和雌激素水平无显著差异；注射后2周，促卵泡生长激素及雌激素水平仍无显著差异；注射后4周实验组小鼠血清雌激素水平明显下降，与对照组有统计学差异，但促卵泡生长激素水平无明显变化；注射后6周2组比较，实验组血清雌激素水平低，促卵泡生长激素水平高，差异均有统计学意义(P < 0.05)。实验组小鼠造模完成后促卵泡生长激素表达上升 (P < 0.05)，雌激素表达下降(P < 0.05)，与临床上卵巢早衰患者的典型表现相符。此次研究血清激素水平同王佩娟等^[25]用pZP3免疫B6AF1雌性小鼠结果一致，模型组小鼠在第7天和第14天血清雌激素水平均下调，但第14天血雌激素水平下降更明显(P < 0.01)，模型组中促卵泡生长激素水平明显上调，第7天上升不明显(P > 0.05)，第14天上升明显(P < 0.01)。

激素分析可以与小鼠卵巢冰冻切片和苏木精-伊红染色方法结合^[9]，用于小鼠模型中的卵巢发育和功能研究。通过观察卵巢组织中不同发育阶段的各级卵泡的形态和数量，并结合性激素的测定能够更好地评估卵巢功能。此次研究在免疫注射6周后，激素水平出现卵巢早衰表现，同时观察卵巢及子宫形态学变化，发现卵巢组织皮质变薄，间质纤维化严重，各级卵泡数减少，符合卵巢功能减退的卵巢组织学变化特征，同SILVA等^[28]免疫性卵巢早衰的特点。

     此次研究用pZP3抗原免疫BALB/c小鼠6周，其检测结果符合自身免疫性卵巢早衰的指标，说明此方法6周即可成功构建免疫性卵巢早衰鼠模。为揭示免疫性卵巢早衰的发病机制，为进一步研究卵巢早衰的治疗，提供了一种可靠的动物模型。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

免疫性卵巢早衰：近年来卵巢早衰在育龄女性中的发病率逐年上升，且向低龄化发展, 成为女性不孕的常见重要原因之一。卵巢早衰的病因复杂，很多患者(50%-60%)找不到明确的原因，迄今为止卵巢早衰的发病机制不明，临床研究显示10%-30%的卵巢早衰是由免疫因素所致，其早期诊断困难，治疗也相当棘手。因此对于免疫导致卵巢早衰的研究，已成为目前国内外研究的热点。

免疫性卵巢早衰模型：免疫性卵巢早衰动物模型的建立为临床研究奠定了基础，因此需要一个建模方法简单，成功率较高，而且卵巢的形态和功能与人类卵巢早衰相似的动物模型。

免疫性卵巢早衰致病机制不清，尚无有效治疗，需建立一简单有效动物模型，为临床研究免疫性卵巢早衰提供理论依据。不同种系小鼠在免疫反应性、繁殖能力存在差异。国内外多项研究报道由A/J雄鼠和C57BL /6雌鼠进行杂交繁殖出的B6AF1雌鼠建立自身免疫性疾病的动物模型，其成模率达90%以上。后又有多位学者应用小鼠pZP3诱导BALB/c小鼠也成功建立免疫性卵巢早衰模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程